全 文 ：中草喃 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第1I期2006年11,El·1733·
测到黄酮合成并且量略有提高。已知灯盏乙素是灯
盏花中的有效成分之一[13|，它是一个由黄酮苷元和
糖基配体组成的黄酮类化合物，在次生代谢中以终
产物的形式存在。在毛状根培养物中检测到大量黄
酮存在而灯盏乙素的量很低，这可能与毛状根中合
成灯盏乙素下游相关的代谢调控酶有关，笔者将在
已建立的短葶飞蓬毛状根转化体系的基础上进一步
开展灯盏乙素生物合成关键酶的研究。
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茯苓灭活原生质体融合育种研究
梁清乐，王秋颖。，曾念开，王怀凯
(中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所，北京 100094)
原生质体融合是一项重要的生物工程技术，近
30年来发展迅速，该技术比基因工程法和原生质体
转化法简便易行，可以克服传统育种法中细胞壁和交
配系统对育种的障碍，实现种间、属间以至远缘的杂
交。由于原生质体融合是整套基因组连同细胞在内的
其他组分一起融人另一细胞，就为遗传物质的充足和
有效表达提供了更多的机会，且并不需要预先了解有
关基因组或单个基因太多的具体细节，就能改变物种
的生物学特性，获得新品种，甚至可以通过将几个优
良品种的融合而将多种优良性状组合到单个菌株中，
所以，这是一个有可能在较短时期内取得明显成效的
育种方法[1]，并被广泛应用于微生物遗传育种工作
中[2]。灭活原生质体融合是对原生质体融合技术的重
大发展。自1977年以来，人们开始了用灭活原生质体
进行微生物融合育种的尝试[3]。
茯苓Poriacocos(Fr．)wolf是传统名贵中药，
近年来，茯苓菌种退化严重，给生产带来巨大的损
失。笔者在对茯苓原生体制备与再生条件进行探索
的基础上H]，通过原生质体融合技术，得到了茯苓融
合重组子，并对融合子进行了初步的鉴定。
1材料和方法
1．1 出发菌株：Z，。一：为中国医学科学院中国协和医
科大学药用植物研究所真菌室保藏；Z。∽来自福建
三明真菌研究所。
1．2培养基
1．2．1斜面培养基：麦麸5％(水煮0．5h，滤过，取
滤汁)，葡萄糖2％，磷酸二氢钾0．3％，硫酸镁
0．15％，VB0．001％，琼脂1．5％，pH值6．5。
1．2．2发酵培养基：麦麸5％(水煮0．5h，滤过，取
滤汁)，葡萄糖2％，磷酸二氢钾0．3％，硫酸镁
0．15％，VB0．001％，琼脂1．5％，pH值6．5。
1．2．3再生培养基：马铃薯10％(水煮0．5h，滤
过，取滤汁)，酵母粉0．3％，蛋白胨0．5％，葡萄糖
2％，磷酸二氢钾0．2％，硫酸镁0．1％，硫酸铵
0．1％，VB0．001％，琼脂条1．5％(煮溶)。
1．2．4高渗再生培养基：再生培养基中加入0．5
收稿日期：2006—03—06
*通讯作者王秋颖Tel：(010)62818260E～mail：qywang@implad．ac．en
万方数据
·1734· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第11期2006年11月
mol／l。甘露醇作为稳渗剂。
1．3试剂：0．1mol／LTris一0．1mol／LEDTA，0．1
mol／LTris一0．1mol／LEDTA配制的0．2％巯基乙
醇；稳渗剂KCl，NaCl，甘露醇，蔗糖；50mmol／L
CaCI。30％聚乙二醇(PEG6000)(北京欣经科试剂
公司)；溶壁酶(广东省微生物研究所)；蜗牛酶(北京
欣经科试剂公司)。
1．4原生质体的制备
1．4．1酶液制备：用灭菌的0．5mol／L渗透压稳定
剂配制，酶溶解后5000r／rain离心10min去掉沉
淀杂质，上清液用0．22”m微孔滤膜滤过除菌，4‘C
冰箱中保存备用。
1．4．2菌种培养：将菌株z，蚴、z，¨从试管斜面挑
取数小块，分别接种于150mL麦麸液体培养基中，
28℃下摇床培养7d，然后滤过收集菌丝，用无菌水
冲洗后，用研钵磨，取Z协：、Z协。各10mL分别再接
入150mL新培养基中培养，温度为28C，做以下
处理。
1．4．3制备：分别取培养72h的Z。㈣，培养56h的
Z，∽菌丝，铜网滤过收集菌丝，用无菌水将菌丝冲洗
干净，用0．1mol／I。Tris一0．1mol／I。EDTA冲洗
后，0．2％巯基乙醇处理30min，温度为28C，振
荡，用铜网收集菌丝，用0．5mol／l。甘露醇冲洗，将
收集的菌丝在1500r／rain下离心10min，称取
0．25g菌丝体加上1mol3％酶液，28℃振荡酶解2
h，铜网滤过，滤液离心500r／min，5min2次，去掉
菌丝段，3500r／min下离心10min，得到沉淀即为
原生质体，然后将沉淀用稳渗剂洗涤离心2次，并用
血球记数板计数。
1．5原生质体再生：采用0．5mol／L甘露醇，作为
稳渗剂加入到完全培养基中，取制备好的原生质体
0。1mI。涂皿，使每皿原生质体数目达到104个／
mL，28’C下培养，观察平皿中的再生菌落数，计算
再生率。
l，6原生质体灭活与融合嘲：取Z，呲原生质体悬浮
液10mI。，58‘C水浴30min，检测存活率为0；取
Z。∽原生质体悬浮液10mI，倒入直径9cm无菌平
皿中，在30W紫外灯管正下方30cm处，打开皿盖
照射灭活处理10min，检测存活率为0。
将两亲株灭活的原生质体各取1mL混合到无
菌带塞的离心管内，加入1mL预热的聚乙二醇
2000r／rain离心20min，28‘C温浴30min，加入数
毫升稳渗剂，离心洗涤，25℃预培养24h，取0．1
mL涂于高渗的融合再生培养基。
1．7融合株的分析
．7．1形态学分析：将充分活化的融合株及亲株转
接于固体平板上，30℃恒温培养后，观察菌落形态。
1．7．2亲和性分析：将充分活化的融合株及亲株转
接于固体平板上，亲株接于平皿两旁，融合株接于中
间，相距2cm；于30℃、黑暗条件下进行培养；至两
个菌株的菌丝长满培养皿，观察不同菌株菌落之间
菌丝交界处的反应类型。
1．7．3酯酶同工酶的分析：参照文献方法进行[6]，
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析融合株与双亲株酯酶
同工酶的差异。
2结果与分析
2．1 灭活原生质体融合频率：Z。。一：和Zm。原生质体分
别采用热灭活和紫外线灭活法处理，混合后在聚乙二
醇诱导下发生融合，融合后重组频率为4×10～。
2．2融合株的性状分析
2．2．1形态学分析：将充分活化的融合株及亲株转
接于固体平板上，30℃恒温培养后，对它们之间的
形态学特征进行了比较(图1)。
融合子的菌丝要比两亲本都要白，而且菌落菌
丝致密，气生菌丝浓密。其菌落性状、气生菌丝量要
优于两亲本，说明两亲本的基因在融合子中发生重
组，表现出了优于两亲本的性状。
A一亲率西株Zlo2 B一融合菌株RC一亲本菌株Zlo_3
A-parentstrainZ¨02 B一{usantR C—parentstrainZlo一3
围1融合子与两亲本菌株的菌落性状
Fig．1Colonycharacteristicsoffusant
andtwoparentstrains
2．2．2亲和性分析：通过融合子与两亲本间的拮抗
反应，可以看到融合子与两亲本之间有明显的拮抗
线，说明融合株有新的基因产生，而与两亲本有明显
的不同，证实融合子为新的菌株。
2．2．3酯酶同工酶分析：从双亲株与融合子的酯酶
同工酶结果来看，融合株和双亲株的酶带有明显的
不同，融合子的酶带明显多于双亲；融合株与双亲株
的主要酶带相同，但其酶带加深明显，而且融合株出
现了两条新的酶带(图2)。
对融合菌株进行同工酶分析能直接反映出融合
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第11期2006年11月·1735·
A一融合子R
B一亲本菌株Zlo-2
C一亲本菌株Z10一3
A—fusantR
B—parentstrainZ10—2
C—parentstrainZ,o一3
图2隧酶同工酶酶谱
Fig．2Zymogramsofesteraseisozymes
菌株的遗传背景及双亲株的关系。从酶谱中发现，融合
株的同工酶谱中存在双亲株的特征性酶带并有新的酶
带产生，说明融合菌株同时具有来自双亲株的基因组，
而且融合过程中双亲株的基因发生重组，引起同工酶
基因间的抑制表达发生变化或有新酶基因的产生。
2．3 融合重组子分析：茯苓菌种采用灭活原生质体
融合技术可以获得理想的杂交新菌株。双亲灭活原
生质体融合的特点是可以省去遗传标记菌株的筛
选，还有利于排除双方亲本类型的再生菌株，便于选
择融合重组子[7]。原生质体灭活主要包括3种不同
的方式：热灭活、紫外线灭活以及化学灭活。热灭活
是目前采用最广泛的手段。但热灭活必须配合其他
灭活方式，温度对双亲菌株原生质体作用位点在不
同细胞中差异很小，灭活后致死损伤部位基本相同，
不能做到互补融合，而得不到融合子再生菌株。双亲
原生质体均用紫外线灭活处理。大剂量的UV处理
在不同位点上损伤DNA，因而有可能使融合子的某
些代谢途径受到干扰，最终影响生产中产量，但紫外
线灭活法的优点是可以刺激双亲菌株基因组间的交
换。因此，在试验过程中，Z。。一。选用原生质体热灭活，
z，∽选用原生质体紫外线灭活，融合后双亲原生质
体损伤部位得到互补，就很容易从再生平板上挑选
出融合子再生菌株。
利用该方法笔者已选出融合子再生菌株，并通
过形态学、亲和性、酯酶同工酶分析，确定该再生菌
株为双亲融合子；该菌株是否为优质高产菌株，还有
待于进一步生产中试验结果来证明。
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不同部位、不同产地南五味子中木脂素类成分的比较
徐丽华1‘2，梁春霞3，孙萌2，李桂凤3，余伯阳H
(1．中国药科大学中药学院，江苏南京210009；2．苏州大学药学院，江苏215007；
3。苏州市恩源医药科技有限公司，江苏苏州 215011)
南五味子为木兰科植物华中五味子Schisandra
sphenantheraRehd。etWils。的干燥成熟果实。性
味酸、甘、温，归肺、心、肾经，具有收敛固涩、益气生
津、补肾宁心的功效。用于久嗽虚喘、津伤口渴、短气
脉虚、心悸失眠等症[1]。南五味子主要分布于华中、
西南等地，其化学成分主要有挥发油、木脂素、三萜、
多糖、有机酸等[2“]。木脂素类成分是南五味子的主
要活性部位[6’7]，其中五味子甲素、乙素、酯甲、醇甲
具有降酶保肝活性，五味子乙素、醇甲具有安神作
用，本实验采用HPLC法检测了南五味子果肉、种
皮、种仁中五味子甲素、乙素、酯甲及醇甲的量，并用
紫外一可见分光光度法检测了总木脂素的量，同时检
测了5个不同产地南五味子中五味子甲素、乙素、酯
甲、醇甲及总木脂素的量。检测结果显示，检测部位
收稿日期：2006—01—13
作者简介：徐丽华(1968一)，中国药科大学博士研究生，苏州大学药学院讲师，主要从事中药和天然药物研究。
*通讯作者余伯阳 E—mail：boyangyu@yahoo．corn．an
万方数据
茯苓灭活原生质体融合育种研究
作者： 梁清乐， 王秋颖， 曾念开， 王怀凯
作者单位： 中国医学科学院,中国协和医科大学药用植物研究所,北京,100094
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(11)
被引用次数： 3次

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