全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2006年第3期
58-20-9菌株[(肠型点状产气单胞菌)A.punctataf. Intestinafis是鱼类细菌性肠炎病病原,G4菌株[(鱼害
粘球菌)Myxococcus piscicola]是鱼类细菌性烂鳃病病原,56-12-10菌株 [(荧光假单胞菌)Pesudomonas
fluorescens]是鱼类赤皮病病原[1],细菌分类学上这三种细菌属于不同属,但都是鱼类的重要病原菌,危害甚
大,对它们快速诊断和免疫防治一直是一个研究热点。原生质体融合技术已成为基础分子生物学研究和微
生物育种的一种有效方法,微生物原生质体融合技术是近 20年来国内外细胞工程领域的一个研究热点。目
前,尚无肠型点状产气单胞菌、鱼害粘球菌、荧光假单胞菌三者原生质体融合及其应用于免疫研究方面的报
道。亲株遗传标记的选择是鉴定融合子的重要手段,其选择方法多种多样,耐药性遗传标记选择是原生质体
融合遗传标记选择的主要方法之一。本文主要对这三种细菌原生质体融合的耐药性遗传标记进行了研究,
旨在为构建、选择和鉴定其三元融合子提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验菌株
荧光假单胞菌 56-12-10菌株由中科院水生所提供,肠型点状产气单胞菌 58-20-9菌株与鱼害粘球菌
G4菌株的二元融合子 AM-1由湖南农业大学水产系提供[2]。
1.2 药品与试剂
药敏纸片(市售常用抗菌药物)购自北京天坛药物生物技术开发部,硫酸链霉素(20030113)由大连美罗
大药厂生产,盐酸环丙沙星片(20011011)由岳阳中湘康神药业集团有限公司生产。
二元融合子与荧光假单胞菌耐药性遗传标记的筛选
陈光荣 1,2 肖克宇 2
(1暨南大学水生所,广州 510632; 2湖南农业大学水产系,长沙 410128)
摘 要: 应用定性和定量药物敏感性试验与诱变相结合,筛选出荧光假单胞菌56-12-10菌株的遗传标记为链霉素
抗性,二元融合子AM-1菌株的遗传标记为环丙沙星抗性,确定了在这两种细菌原生质体融合试验中,选择培养基中链霉
素的应用浓度为 300Iu/ml,环丙沙星应用浓度为100Iu/ml。
关键词: 二元融合子 荧光假单胞菌 遗传标记
SelectionofAntimicrobialToleranceGeneticMarkerofProtoplast
FusionBetweenBinaryStrainandPesudomonasfluorescens
ChenGuangrong1,2 XiaoKeyu2
(1Instituteofhydrobiology,jinanuniversity,Guangzhou 510632;
2Aquaticdepartmentofhunanagricultureuniversity,changsha 410128)
Abstract:Usingthequalitativeandquantitativeantimicrobialsusceptibilityexperimenttoscreenthegeneticmark-
ersofprotoplastfusionbetween56-12-10strainsandAM-1strainswhichareSmr(streptomycinresistance)andCmr
(ciprofloxacinresistance)respectively.itcanbeasuredthattheappliedchromainselectiveculturemediumofstreptomycin
andciprofloxacinare300Iu/mland100Iu/mlintheprotoplastfusionexperimentbetweentwobacteria.
Keywords:Binaryfusion PesudomonasfluorescensGeneticmarker
收稿日期:2005-12-29
作者简介:陈光荣(1978-),男,湖南衡阳人,博士生,研究方向:水环境修复
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
注:敏感度的判定是根据文献[7]
1.3 培养基制备
见参考文献[3]
1.4 菌种培养
将原始菌种接种至斜面培养基活化后转接至肉汤培养基,培养 24h备用。
1.5 定性试验
采用常规纸片法[4],取培养 24h的二元融合子 AM-1菌株和荧光假单胞菌 56-12-10菌株的菌液,麦氏比
浊法[5]测定菌数均约为 9×108个/ml,分别加于平板培养基上,再用灭菌的玻璃刮棒将菌液分别均匀涂布,稍
干后用无菌镊子夹取药敏纸片等距离放入培养皿内,每个平板可测试 5~6种纸片,并加以标记。置 28℃恒
温培养 16~18h后取出,量取纸片周围药物抑菌圈直径,选择这两种细菌交叉耐药的药物用于定量试验[6]。
1.6 定量试验
采用试管法[4],取 12支试管,于第 1管内加入培养液 1.6ml,其余各管分别加入 1ml培养液,第 12管内加
1.05ml。而后吸取0.4ml的待检药液到第1管中,充分混匀后吸出1ml混合液逐管作倍比稀释,至第10管时弃
去 1ml,第 11、12管内不加药液,然后吸取培养了 6~8h的菌液,菌数均约为 9×108个/ml,从第 1到 11管内分
别加入0.05ml,第12管不加菌液作为阴性对照,第11管作为阳性对照。摇匀后置28℃恒温培养18~24h取出
观察结果,以能抑制细菌生长的药物最高稀释浓度即最小抑菌浓度为该药的MIC(最低抑菌浓度)。本试验每
菌株平行重复两次。将上述观察的无细菌生长的培养液转接到琼脂平板上,置 28℃恒温培养 18~24h,观察
有无细菌生长。以能杀死细菌的药物的最高稀释度即最小杀菌浓度为该药的 MBC(最低杀菌浓度)。
1.7 耐药性遗传标记药物应用浓度试验
将再生培养基灭菌冷却到 45~60℃时,同时加入这两菌株交叉耐药的两种药液于无菌平板上,浓度分
别为该两种菌株的 MIC和 MBC,将上述培养基倒平板轻轻混匀,即为选择培养基平板,每组倒两个用作平行
试验。然后每个都均匀接种这两种菌液,置 28℃恒温培养 18~24h后观察结果。以两种细菌均不在平板上生长
的药物浓度为制备选择培养基时的初始应用浓度。
表1 二元融合子AM-1菌株和荧光假单胞菌56-12-10菌株耐药性定性试验结果
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1.8 耐药菌株的进一步培育与稳定
采用逐步提高药物浓度诱导培养法,将已耐受环丙沙星和链霉素的双亲菌株,在完全培养基和选择培
养基上交递培养,将其耐药性提高并稳定至选择融合子的应用浓度。
2 结果与分析
2.1 定性试验结果
二元融合子 AM-1菌株和荧光假单胞菌 56-12-10菌株对 17种药物的耐药性定性试验结果见表 1。由
试验结果可知,二元融合子 AM-1菌株和荧光假单胞菌 56-12-10菌株对以上 17种药物没有完全交叉耐药
的两种药物。但这两菌株对同一药物的敏感度上存在差异,环丙沙星、氯霉素对前者的抑菌作用比后者强,
但区别最大的为环丙沙星;而链霉素、复方新诺明、呋喃唑酮片、红霉素对前者的抑菌作用比后者弱,而链霉
素相对更常用。所以本试验选择环丙沙星和链霉素作为这两菌株遗传标记筛选的交叉耐药药物。
2.2 定量试验结果
环丙沙星和链霉素对二元融合子 AM-1菌株和 56-12-10菌株两菌株敏感度定量试验结果见表 2。由以
下结果可知:AM-1菌株加环丙沙星时的 MIC=62.5Iu/ml、MBC=100Iu/ml,56-12-10菌株加环丙沙星的 MIC=
100Iu/ml、MBC=250Iu/ml,AM-1菌株加链霉素的 MIC=125Iu/ml、MBC=500Iu/ml,56-12-10菌株加链霉素的
MIC=62.5Iu/ml、MBC=300Iu/ml。
表2 二元融合子AM-1菌株和荧光假单胞菌56-12-10菌株耐药性定量试验结果
2.3 耐药性遗传标记药物应用浓度试验结果
在选择培养基平板上,两种药物的浓度为 MIC时,平板上有少量细菌生长,药物浓度为 MBC时平板上
无细菌生长。因此,在这两种细菌原生质体融合试验中,选择培养基中的环丙沙星应用浓度为 100Iu/ml,链霉
素应用浓度为 300Iu/ml。
注:“-”表示试管中无细菌生长,“+”表示试管中有细菌生长,“(-)”表示试管中无细菌生长后转接至平板上也
无细菌生长,“(+)”表示试管中无细菌生长后转接至平板上有细菌生长。
陈光荣等:二元融合子与荧光假单胞菌耐药性遗传标记的筛选 75
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3 讨论
3.1融合株的筛选依赖于两亲本株的稳定的遗传标记 主要采用的有营养缺陷型标记、抗药性标记[8]、荧
光色素标记、失活原生质体供体法[9]等,近来使用较多是抗药性标记,也有将抗药性标记与营养缺陷型标记
相结合的,本试验采用抗药性标记,亲本耐药性遗传标记的建立有些采用梯度培养皿方法获得[10],这里两亲
本株遗传标记的筛选是采用药敏定性和定量实验,逐步选出双抗药物和应用浓度,并进一步稳定和培养耐
药菌株。试验结果表明,AM-1菌株和 56-12-10菌株在所选药物中虽无完全交叉耐药的药物,但这两菌株对
环丙沙星和链霉素在敏感程度上存在明显差异。定量试验中,这两种药物的用量差距很大,因此,环丙沙星
和链霉素可作为这两菌株遗传标记筛选的交叉耐药药物,由此可知只要两菌株的抗药性存在差异,就可选
出其有应用价值的遗传标记。
3.2耐药性遗传标记选择方法简便易行,但在实际应用时影响因素较多,资料表明,培养基中加入药物时
的适宜温度为 45℃~60℃,如果温度过高,药物会降低药效甚至完全失效,温度低于 45℃琼脂则会凝固,倒
不成平板,因此在具体应用时应严格控制加入药物时的培养基温度。除了药物质量及药物加入培养基时的
温度、细菌耐药性遗传外,药物浓度也会产生重要影响,药物浓度过高,会降低原生质体的再生率及融合率,
药物浓度过低则会使亲本生长,影响融合子的检出。本试验根据供试菌株对药物敏感程度来确定其遗传标
记,这两菌株对同一药物的耐药只表现为剂量上的差别。因此,严格掌握药物应用浓度是今后选择融合子是
否成功的关键。
参 考 文 献
1 倪达书,汪建国.草鱼生物学与疾病.北京:科学出版社,1997:95~133.
2 钟蕾,肖克宇.湖南农业大学学报,2002,28(专刊):139~142.
3 陈天寿.微生物培养基的制造与应用.北京:中国农业出版社,1995:29~53.
4 章育正.微生物学.北京:中国农业出版社,1984:152~154.
5 曹澍泽.兽医微生物学及免疫学技术.北京:北京农业大学出版社,1993;56~57.
6 王自振,卢中华,崔保安.食品微生物检验学.北京:中国科学技术出版社,1991:294~296.
7 韩文瑜,何昭阳,刘玉斌.病原细菌检验技术.吉林:吉林科技出版社,1992:84.
8 徐京宁,米贯东,唐孝宣.生物工程学报,1992,8(3):237~242.
9 HoopwoodDA.RevMicrobial,1981,35:237~259.
10张克旭,陈 宁,张永志.微生物学报,1991,31(2):108~114.
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