全 文 ：·1864· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第12期2008年12月
银杏叶总提取物对H202诱发的心肌细胞损伤的保护作用
郭健1，刘 义2，李延平2，宋文东3，梁伟钧1．
(1．广东医学院附属医院心血管内科，广东湛江524023f2．广东医学院广东天然药物研究与
开发重点实验室，广东湛江524023，3．广东海洋大学，广东湛江524000)
摘 要：目的 研究银杏叶总提取物(GBE)对H：o：诱发的心肌细胞损伤的保护作用。方法采用胰酶消化法获
取大鼠乳鼠心肌细胞，用H。()z损伤心肌细胞，制备心肌缺血再灌注损伤实验模型，实验组加入GBE使其终质量浓
度分别为50、100、150mg／L，阳性对照组加入异博定，用紫外分光光度法、硫代巴比妥酸法、黄嘌呤氧化酶法分别
测定细胞培养液中乳酸脱氧酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)活性；测定线粒体中
琥珀酸脱氢酶(SDH)、细胞色素C氧化酶(CCO)比活力；透射电镜观察细胞的超微结构。结果与对照组相比模
型组I．DH活性和MDA水平均明显升高(P<0．05、0．001)，SOD则明显降低(P<0．01)，而GBE各组能减少
LDH和MDA的产生呈剂量依赖关系；SDH和CCO比活力在H。0：组明显下降(P<0．001)。GBE组改变不明显；
150mg／LGBE对细胞线粒体有明显的保护作用。结论银杏叶提取物对Hzoz诱发的心肌细胞损伤有显著的保护
作用，其机制可能与维持细胞中线粒体的能量代谢有关。
关键词：银杏叶总提取物(GBE)；心肌细胞；H：02
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)12—1864一04
银杏GinkgobilobaL．系落叶乔木作为药物在
我国已有5000多年的历史。《中国药典》中记载银
杏叶有润肺、平喘、止痛等功效。银杏叶总提取物
(Ginkgobilobaextract，GBE)主要成分为银杏类
黄酮和萜内酯，具有扩张血管、抗炎、抗肿瘤、调血脂
等作用[1]。在体外实验中可直接灭活各类氧自由基、
抑制脂质过氧化作用[2’3]。过氧化氢(H。O。)是体内
氧化代谢的中间产物，同时又是一种活性氧。当
H。o：的浓度积累到一定程度时会对心肌细胞产生
损伤作用。目前认为H。0：是心肌细胞损伤的重要发
病机制，对氧化应激的防护一直是心血管病理生理
和治疗学十分重要的课题。本实验利用离体乳鼠心
肌细胞为载体研究GBE对H：o。诱发的心肌细胞损
伤的保护作用及可能的机制。
1材料与方法
1．1 实验动物：出生1～3d的Wistar大鼠，雌雄
不拘，由广东医学院动物实验中心提供。
1．2 试剂与仪器：GBE粉剂购于中国药品生物制
品检定所，使用前用培养液配制，滤过除菌待用；异
博定片剂购于广东华南药业有限公司；胎牛血清、
DMEM(低糖)培养液、胰蛋白酶购于Gibco公司；
琥珀酸脱氢酶(SDH)比活力测试盒、细胞色素C
氧化酶(CCo)比活力测试盒、葡聚糖凝胶、H。o：、
hepes、glucose、L—glutamine购于Sigma公司；乳酸
脱氢酶(LDH)测试盒、丙二醛(MDA)测试盒、超
氧化物歧化酶(SOD)测试盒购于南京建成生物工
程研究所；Lowry法蛋白质测定试剂盒购于上海申
能博彩生物科技有限公司。
1．3 大鼠乳鼠心肌细胞离体培养：参考Harary
法[41略有改进分离心肌细胞。取出生1～3d的
Wister大鼠乳鼠，无菌条件下取出心脏，放入预冷
的D—hank7S瓶皿内洗去残余血液，剪掉心房，将洗
净的心室肌放入大离心管内，用眼科剪快速剪碎，
0．06％胰蛋白酶分次消化成单细胞悬液，离心收集
沉淀，用含15％胎牛血清的DMEM培养液悬浮分
散细胞，调整细胞密度约为1×106／L接种到25
mL培养瓶中，CO。孵育(5％Co。、37C)培养。90
min后翻转培养瓶，取培养液接种到新培养瓶中。由
于成纤维细胞较心肌细胞更易于贴壁，用此法可使
大部分成纤维细胞贴壁，剩下富含心肌细胞的培养
液。48h换培养液，倒置显微镜下观察细胞全部贴
壁，相互连接成片，形成同步搏动，细胞生长状态良
好，即可进行下一步实验。
1．4实验分组：实验分为6组，每组6瓶细胞。对照
组；模型组：加入H202，终质量浓度为100omol／L，
继续培养3h；GBE3个剂量组：培养液中加入GBE
收稿日期：2008一04一09
基金项目：广东省自然科学基金项目(2005894201002)
作者简介：郭健<1981)，女，黑龙江牡丹江人，硕士研究生，主要从事心血管相关疾病研究。E—mail：plliu78@sina．corn
*通讯作者梁伟钧
万方数据
中草焉 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第12期2008年12月·1865·
使其终质量浓度分别为50、100、150mg／L，继续培
养12h；阳性对照组：将异搏定加入培养液中使其
为终质量浓度40pg／L，继续培养12h。
1．5 细胞培养液中LDH漏出量、MDA水平及
SOD活性的测定：分别取各实验组的细胞培养液，用
紫外分光光度法测定LDH活性；硫代巴比妥酸法测
定MDA水平；黄嘌呤氧化酶法测定SoD活性。
1．6 Lowry法测定细胞线粒体中的蛋白量：消化、
离心收集细胞，加入线粒体分离介质，用超声波震荡
器将其制备成匀浆，2300r／min离心10min，取上
清，9200r／min再离心20min，取沉淀，制成线粒体
悬液。用Lowry法蛋白质定量测定试剂盒测细胞线
粒体悬液中蛋白的量。
1．7线粒体中SDH、CCO比活力的测定：分别用
SDH和还原型细胞色素C测试盒测细胞线粒体悬
液中SDH比活力及CCO比活力。
1．8超微结构：用细胞刮刀将细胞刮下，1000r／
rain离心5min，弃上清收集细胞，4C，2．5％戊二
醛固定10min，再2000r／rain离心10min。常规乙
醇、丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，铅、铀
双重染色，透射电镜观察并摄片。
1．9数据处理：采用SPSS10．0软件进行分析，各
组间进行方差分析，并进行g检验。
2结果
2．1 GBE对心肌细胞培养液中LDH、MDA及
SOD的影响：结果见表1。与对照组相比模型组
LDH活性及MDA水平均有明显的升高(P<
0．05，0．001)，说明H。0。所造成的缺氧／复氧能使心
肌细胞产生明显的氧化应激反应，而GBE各实验
组LDH活力均出现显著的下降(P<0．001)，
MDA水平虽有不同程度的上升但上升幅度随着给
表1 GBE对心肌细胞培养液中LDH和SOD活性以及
MDA水平的影响(工±s，辟=6)
Table1 EfleetofGBEonLDHandSODactivities，
MDAlevelincardiomyocytesculturefluid
(；士s，n=6)
与对照组比较；’P<0．05一P<0．01⋯P<0．001
’尸<0．05’。P药浓度的增加呈下降趋势；模型组能明显减少SOD
的量(P果表明，GBE能够抵制MDA的产生，增加SoD活
性，保护心肌细胞免受氧化应激的损伤。
2．2 GBE对心肌细胞线粒体中SDH、CCo比活性
的影响：结果见表2。模型组与对照组相比SDH及
CCO活性均有明显下降(尸<0．001)，GBE50、100
mg／L实验组也有不同程度的降低(P模型组相比其减少幅度较小；150mg／LGBE实验组
SDH及CC()比活性与对照组无明显差异。结果表明
GBE能改善心肌细胞中线粒体的能量代谢。
表2 GBE对心肌细胞线粒体中SDH、CCO比活性的影响
(；士s，n一6)
Table2 EfleetofGBEonSDHandCCO
specificactivitiesinmitochondria
ofcardiomyoeytes(；±s，捍一6)
组 别
剂量／ sDH比活性／ cco比活性／
(mg·L一1)(U·rain一1·mg一1)(U·min一1·mg一1)
与对照组比较：。P<0．05⋯PdO．001
。P2．3 GBE对心肌细胞超微结构的影响：正常培养
乳鼠心肌细胞(图l-A)，细胞核大，核膜清晰，核周
围部较密集。胞浆较少，线粒体大小正常，结构完整，
细胞膜结构清晰，表面可见有突起。模型组心肌细
胞，细胞核固缩成高电子密度的团块状，核膜溶解；
细胞膜断裂，细胞内膜空泡变形，细胞呈环死早期变
化(图1一B)。GBE50mg／L组，细胞核及线粒体明
显肿胀，细胞膜结构尚完整，胞浆内可见大量空泡
(图1一C)。GBE100mg／L组，细胞核及线粒体肿
胀，细胞膜结构完整，胞浆内可见有空泡(图1一D)。
GBE150mg／L组，细胞核大小正常，核仁清晰可
见；线粒体大小及结构基本正常；细胞膜结构完整，
细胞之内有少量脂滴颗粒(图1一E)。
说明高浓度GBE能保护H：o。诱发的心肌细胞
损伤，中浓度和低浓度GBE对H。o。诱发的心肌细
胞保护作用不明显。
3讨论
心肌缺血是目前严重威胁人类的常见病、多发
病。近年来，用对缺血心肌再灌注的治疗技术，挽救
了大量心肌缺血病人的生命，但再灌注本身也可引
万方数据
·1866· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第12期2008年12月
图l GBE对心肌细胞保护的超微结构特征
Fig．1UltrastructuralfeaturesofinjuriedcardiomyocytesprotectedbyGBE
起心肌损伤而影响其疗效[5]。心肌缺血时导致氧化
应激状态，造成心肌内消除活性氧的保护机制发生
改变，产生大量的自由基，进而诱导心肌细胞损伤。
心脏疾病时，细胞内活性氧水平的增加和抗氧化剂
水平的降低能直接诱导细胞损伤。有研究证实通过
外源性活性氧H。O：，能建立H：()：诱导心肌氧化应
激的细胞模型L6】。
细胞在生理条件下不断产生氧自由基，同时机
体存在着清除和抑制自由基产生的系统。在再灌注
损伤的病理条件下，心肌细胞易产生过量的活性氧
自由基，活性氧自由基和细胞膜脂质发生反应，启动
自由基连锁反应，引发细胞膜的脂质过氧化反应，造
成心肌细胞的严重损伤，心肌细胞培养液中LDH
活性的高低是细胞膜脂质过氧化损伤程度的显著标
志。细胞处于氧化应激状态能产生大量的MDA，且
使S()D活性降低。MDA是氧自由基脂质导致过氧
化的代谢性产物，反映体内氧自由基的生成水平及
其对组织的损伤程度。在心肌细胞的氧化应激中氧
自由基大量合成，攻击细胞膜中的不饱和脂肪酸，造
成MDA大量增加，储存的SOD因清除大量的超
氧阴离子而消耗减少，从而导致氧化和抗氧化系统
失衡，清除自由基的能力降低，引起心血管组织的进
一步损伤。自由基造成对心血管损伤的程度主要与
MDA水平、SoD活性变化有关。测定细胞培养液中
的LDH、MDA、SOD可以直观反应细胞受过氧化
损伤的程度，以及药物对此的保护作用。本实验表明
100肛mol／L的H。()。能损伤心肌细胞，产生氧化应
激，表现为LDH、MDA的水平上升(P<0．05，
0．001)和SOD活性下降(尸增多与脂质过氧化损伤。而加入不同浓度的GBE
可以有效地抑制I。DH活性的升高(P<0．001)，对
MDA水平的升高有抑制作用，GBE对LDH及
MDA的作用呈剂量依赖关系，同时能有效地维持
SOD活性。提示GBE可能通过增强机体消除自由
基的能力，抵制脂质过氧化反应，而达到对心肌的保
护作用。
线粒体是一种结构和功能复杂而敏感的重要细
胞器，是细胞能量产生的主要部位，是细胞的活力及
生存和死亡的调节中心。心肌细胞耗氧量增大，对氧
依赖性强，线粒体是氧化磷酸化的重要场所，因此其
功能的损害将直接影响心肌的功能。线粒体是生成
氧自由基的主要场所，由于线粒体功能受损后，从呼
吸链逃逸的自由基将大量增加，这将加重氧自由基
的暴发产生，从而进一步促进氧化应激反应L7]。SDH
和CCo是线粒体内膜呼吸链的关键酶，其活性的
改变直接影响着细胞能量代谢的过程，进而影响整
个心肌细胞功能[8]。改善线粒体中SDH和CCO活
性有助于维持线粒体呼吸及能量代谢功能。本实验
表明，模型组SDH、CCO比活性与对照组相比有显
著下降(P和CCO比活性升高，与对照组比较无明显性差异。
说明GBE能有效地维持心肌细胞中线粒体能量代
谢功能，有助于改善心肌细胞的氧化应激状态。
在离体培养的大鼠心肌细胞缺血再灌注损伤模
型中，加入不同浓度的GBE能明显降低细胞的氧
化应激反应，保护心肌细胞；GBE保护心肌细胞的
作用可能与其能维持细胞中线粒体正常呼吸及能量
代谢功能有关。
参考文献：
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壮药依肝达含药血清对2215细胞分泌HBsAg和HBeAg的影响
梁帛，邓家刚，韦松基。
(广西中医学院，广西南宁530021)
乙型肝炎是由乙肝病毒(HBV)引起的，以肝
脏炎性病变为主的一种传染性疾病。尽管已有干扰
素及核苷类等各种抗HBV药物，但其疗效均不理
想。目前，中药抗HBV已成为国内外的研究热点。
壮药依肝达是通过长期的民间临床观察而拟定的治
疗急慢性乙型肝炎和肝硬化的验方，主要由壮族民
间草药饭汤子、田基黄、三姐妹等组成，具有清热解
毒、利湿退黄和促进肝功能恢复之功效，临床疗效显
著。本实验以2215细胞株为研究对象，采用中药血
清药理学方法，研究依肝达的体外抗HBV作用。
1材料
1．1 动物：昆明种小鼠，雌雄各半，体质量(18～
22)g，动物使用许可证：SYKG桂2003--2005，由
广西医科大学实验动物中心提供。
1．2细胞：2215细胞株，广西中医学院新药开发中
心惠赠。
1．3 药品与试剂：依肝达，由广西中医学院壮医药
学院壮药教研室提取制备(取组方药材饭汤子、田基
黄、三姐妹以3：5：3的比例按常规水提法提取)；
阿德福韦酯片(ADF)：天津药物研究院药业有限公
司产品，批号20070804；MEM培养基：美国Gibco
公司；胎牛血清：美国Gibco公司；HBsAg和
HBeAg酶联免疫检测试剂盒：北京万泰有限公司，
批号20080302。
1．4 主要仪器与设备：CO：孵箱(美国Thermo
Forma公司)；自动酶标仪(美国Bio—Rad公司)；培
养瓶(美国Promega公司产品)；96孔板(美国
Corning公司)。
2方法
2．1依肝达含药血清的制备：18～20g小鼠，随机
分为3组，每组3只。对照组：等量的蒸馏水；阳性组
(ADF)：20mg／kg；依肝达组：40g／kg。各组动物在
同样条件下饲养，均以每日2次，早晚各1次空腹ig
给药，连续给药3d。于末次给药(禁食不禁水)后
1h，摘眼球取血，分离血清，经56℃30min灭活处
理，培养液分别稀释至40％、20％，再经0．22弘m微
孔滤膜滤过除菌后，置一20C冰箱保存备用。
2．2 EI。ISA法定量检测HBsAg和HBeAg：将
2215细胞用含lo％胎牛血清的MEM培养液置于
377C、5％CO。环境中的孵养箱中培养，每天在倒置
显微镜下观察其生长情况，2～3d换培养液1次，
约7～10d长满培养瓶。在长满2215细胞的培养瓶
中，用0．25％胰酶消化液进行消化成为单个细胞
悬液，取少量消化后的细胞置于细胞计数板进行计
数。调其浓度为含1×105／mL细胞，接种于96孔
板，每孑L加i00pL，于37C、5％CO。培养箱培养。
在接种2215细胞24h后加40％、20％含药血清
(终末体积分数为20％、10％)，每种体积分数设3
孔，于第4天换含相同体积分数的含药血清，维持
8d，于第8天时收集培养液，同时采用酶联免疫吸
附实验(ELISA)法测定HBsAg、HBeAg。结果以
抑制率表示。
抑制率=过竖塑磊震葛菪鬈严×·00％
2．3统计学处理：采用SPSS13．0统计软件分析
数据，组间比较采用方差分析，各均数两两比较。
3结果
实验结果表明，依肝达含药血清(20％、10％)
明显降低2215细胞分泌的HBsAg、HBeAg抗原水
平(P<0．01)，与阳性组无明显差别，结果见表1。
收稿日期：2008—06—06
基金项目：科技部“十一五”支撑项目(2006BAl06A17-03)
作者简介：梁宁(1974一)，女．广西容县人．讲师，硕士，主要从事民族药研究与开发工作。E-mail：liangnlng．ron@163．com
*通讯作者韦松基E·mail：weisongji@126．com
万方数据
银杏叶总提取物对H2O2诱发的心肌细胞损伤的保护作用
作者： 郭健， 刘义， 李延平， 宋文东， 梁伟钧
作者单位： 郭健,梁伟钧(广东医学院附属医院,心血管内科,广东,湛江,524023)， 刘义,李延平(广东医
学院广东天然药物研究与开发重点实验室,广东,湛江,524023)， 宋文东(广东海洋大学,广
东,湛江,524000)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(12)
被引用次数： 3次

参考文献(8条)
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