全 文 ：·1542· 中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10月
绞股蓝总苷对大鼠心、脑Na+，K+-ATP酶的抑制作用及其动力学分析
韩晓燕，卫洪波4，张富程
(中山大学附属第三医院中心实验室，广东广州 510630)
摘 要：目的 观察绞股蓝总苷对心、脑微粒体Na+，K—ATP酶活性的抑制作用及动力学分析。方法采用离心法
制备大鼠心、脑组织微粒体酶，以比色法测定Na+，K—ATP酶活力，通过酶动力学研究方法分析绞股蓝总苷对心、
脑微粒体Na+，K—ATP酶活性的抑制作用。结果绞股蓝总苷体外可逆性抑制大鼠心、脑微粒体Na+，K—ATP酶
活性，并呈浓度依赖性，且对脑微粒体Na+，K—ATP酶的抑制作用较强，其IC。o分别为(58．79士8．25)、(52．07土
6．25)mg／l。。降低Na+，K+浓度或增加ATP浓度则增强其抑制酶活性作用。酶动力学分析显示，绞股蓝总苷对微
粒体Na+，K-ATP酶的作用近似Na+的竞争性拮抗剂、底物ATP的反竞争性抑制剂、K+的混合性抑制剂。结论
绞股蓝总苷通过抑制心、脑Na+，K—ATP酶活性而发挥其强心作用和中枢抑制作用。
关键词：绞股蓝总苷；Na+，K—ATP酶；微粒体；酶动力学
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2006)10—1542—03
Inhibitionande zymekineticanalysesofgypenosideonNa+，K+一ATPase
inratheartandbrain
HANXiao—yan，WEIHong—bo，ZHANGFu—cheng
(ResearchCenter，theThirdAffiliatedHospitalofSunYat—senU iversity，Guangzhou510630，China)
Keywords：gypenoside；Na+，K十一ATPase；microsomes；enzymekinet s
绞股蓝总苷(gypenosides，Gyp)是葫芦科植
物绞股蓝Gynostemrnapent ph&rllum(Thunb．)
Mak．的主要成分，它含有多种与人参皂苷
(ginsenoside)结构相似的皂苷成分，并具有相似的
药理活性。Gyp对心肌的正性肌力作用和对中枢神
经系统显著的抑制作用已广泛用于临床，治疗慢性
失眠、头痛，缓解精神紧张等症状[1’纠。药理研究显示
Gyp对大鼠产生正性肌力作用，可增加麻醉犬的心
输出量；大剂量可产生中枢抑制作用[1卫]。为进一步
地探讨Gyp的正性肌力作用和中枢抑制作用机制，
本实验采用酶动力学研究方法观察Gyp对大鼠心、
脑微粒体Na+，K+一ATP酶活性的影响，以期为临
床用药提供理论依据。
1材料与方法
1．1 药品和试剂：绞股蓝总苷(Gyp)，由南京大学
生物系提供并鉴定，为黄绿色粉末(质量分数大于
90％)。三磷酸腺苷二钠(ATP—Na2+)为中国科学
院生物化学研究所产品，其余试剂均为国产分析纯，
用前以Millipor去离子水配制。
1：2仪器：BeckmanAllegra64R高速冷冻离心
机，OptimaI，--100XP超速离心机，Beckman
DU640分光光度计，DY89—1匀浆器。
1．3微粒体酶的制备：雄性Wistar大鼠(购自中
山大学动物实验中心)，断颈处死，速取出心、脑组织
置于预冷(4。C)的Tr毋一HCI缓冲液中冲洗2次，
去除结缔组织，加入5倍体积的Tris缓冲液(含蔗
糖0．25mmol／L、Tris—EDTA1 mmol／L、HCl10
mmol／L，pH7．4)制成匀浆，经100 0×g离心15
rain两次，取上清液，再行1000 Xg离心30min，
取沉淀得大鼠心、脑微粒体[3]，以上述缓冲液混匀。
以Brodford比色法[4J测定酶蛋白浓度，配成0．5g／
L微粒体酶蛋白混悬液，分装，一30。C保存备用。上
述操作均在O～4℃中进行。
1．4 ATP酶活性测定：用光电比色法[4’5]以复管测
定ATP酶活力。在lmL反应体系中，含有咪唑一盐
酸30mmol／L，M92+5mmol／L，含或不含Na+100
mmol／L，含或不含K+5mmol／L，测心肌酶活力时
反应体系中酶蛋白质量浓度为25mg／L，测脑酶酶
活力时为10mg／L，pH为7．4。37℃温育10min
后加入5mmol／L的ATP反应10min，取各测定
收稿日期：2006—02—12
基金项目；广东省自然科学基金项目(010742)
作者简介：韩晓燕(一)，女，北京市人，副教授。Tel：(020)87583706E—mail：hxy3706@126．corn
*通讯作者卫洪波E—mail：drWHB@glCN．corn
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10月·iS43·
管反应液0．1mL，按Mayan[51方法测定无机磷
(Pi)的量。酶活力单位以1h内1mg蛋白水解生
成的Pi微摩尔数表示，即pmol／(mg·h)。反应体
系中不含Na+、K+时所测得的酶活力为相应组织微
粒体的M92+_ATP酶活力，反之为总ATP酶活
力。总酶活力减去M92+一ATP酶活力即得Na+，
K+-ATP酶活力。本实验测得正常大鼠心、脑Na+，
K十_ATP酶活力分别为(25．33±2．86)和
(186．55±10．60)Ⅳ．mol／(rag·h)，分别约为总酶活
力的31．59％和68．77％。
1．5统计分析：实验结果以35土S表示，以SSPS
11．0软件做统计学数据处理。
2结果
2．1 Gyp对大鼠心、脑微粒体Na+，K+一ATP酶的
抑制作用：Gyp(10、30、60、100、200、300mg／L)显
著抑制心、脑微粒体Na+，K+-ATP酶活性，并呈浓
度依赖性。以半对数作图法(以Gyp质量浓度的对
数为横坐标，以酶活性抑制率相对应的概率单位为
纵坐标)得Gyp对心、脑微粒体Na+，K+-ATP酶
的IC50值分别为(58．79士8．25)、(52．07±6．25)
mg／L。降低底物ATP浓度，Gyp对心Na+，K+-
ATP酶的抑制作用减弱，降低Na+和K+浓度，Gyp
对脑Na+，K+一ATP酶的抑制作用增强。结果见图
1。可见当ATP0．5mmol／L时，GYP(10、30、60、
100、200、300mg／L)对心Na+，K+_ATP酶的抑制
作用明显低于ATP5mmol／L时Gyp的抑制作
用，因而Gyp的浓度抑制曲线右移；但在Na+i0
mmol／L时，Gyp对脑Na+，K+一ATP酶的抑制作
用显著强于Na+100mmol／L时Gyp的抑制作用。
2．2 Gyp对Na+，K+一ATP酶抑制作用的时间过
程：本实验以脑酶进行研究。在酶反应开始的不同时
间测定酶活力。图2显示反应介质中有或无Gyp存
在时，酶活性均随反应时间延长而增强；测定不同预
孵育时间对Gyp抑酶的影响，在Gyp存在下孵育6
rain时酶活性降低了约50％，在反应17rain后，孵
育时间延长，酶活性不再变化。当介质中Gyp质量
浓度为100mg／L时，脑Na+，K+-ATP酶活性受
到显著抑制(P
2．3 Gyp对Na+，K4-_ATP酶的抑制作用的可逆
性：随着酶蛋白质量浓度增加(心酶蛋白2．5～50
mg／L，脑酶蛋白5～30mg／L)，心、脑Na+，K+-
ATP酶活性也随之增强，呈线性关系(P
姗
娶
图1 Gyp对大鼠心、脑微粒体Na+，K+一ATP酶
活力的抑制作用(j土s，n=11)
Fig．1inhibitionofGyponmicrosomalNa+．K+一ATPase
activitynheartandbrainofratsG+s．月一11)
5 lO 15 20 25 30
，／mln
图2 Gyp对Na+，K+-ATP酶抑制作用的时间
过程(；土s，甩=8)
Fig．2TimecourseofGypinhibitiononNa+，
K+．ATP硒e(；士s，n=8)
体系中存在Gyp时，酶反应曲线斜率下降，且随
Gyp质量浓度增加斜率下降明显，各酶反应曲线分
别交于坐标零点。此结果说明Gy§对大鼠脑Na+，
K+_ATP酶的抑制作用为可逆性的。
2．4 Na+、K+、ATP浓度对Gyp抑酶作用的影响：
在反应介质中Gyp的质量浓度不变时，测定不同浓
度Na+、K+、ATP对酶活力的影响。结果发现：存在
或不存在Gyp的反应介质中，改变Na+(10～100
mmol／L)或K+(O．5～5mmol／L)浓度，Na+，K+-
ATP酶活力均随Na+、K+浓度增加而增强，而Gyp
对该酶的抑制作用程度却随介质中Na+、K+浓度的
增高而降低，说明Na+、K+可拮抗Gyp的抑酶作
用。采用Lineweaver—burk双倒数方法做图显示[6]：
随着Gyp质量浓度增加，酶的y⋯基本不变(P>
0
8
6
4
2
O
一，f抽Ⅲ．10Iu三、趟烬董堪镒厶-≈，釜．毛z
万方数据
·1544· 中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第10期2006年10月
O．14
o0．07
褂
蹦
：≥1
呕
港
O
04
03
02
O
O
25 50 15
酶蛋fLI，，／(mg·L。)
4
5
6
1～3-Gypo、30、i00mg／I一4～6一Gyp0、80、200mg／L
图3 Gyp对Na+，K+一ATP酶抑制作用与酶强自质量
浓度的关系(；±s，n一11)
Fig．3RelationshipbetweenGypinhibitiononNa+，
K+一ATPaseandenzymeproteinconcen—
trations(；士s，n一11)
0．05)，但K。值较对照增加，两条曲线交于纵坐标
上，这表明Gyp对Na+表现竞争性抑制作用；但对
K+其曲线交于第二象限近Y轴附近，所以表现为
混合型竞争抑制作用；当反应介质中存在Gyp时，
心、脑Na+，K+-ATP酶活性随介质中ATP浓度的
增高而增强，但K。值和y。均较对照降低(图4)，
曲线斜率不变(P>0．05)，接近平行左移。因而
Gyp对大鼠心、脑Na+，K+-ATP酶底物ATP表现
反竞争性抑制作用。
3讨论
Na+，K+-ATP酶是一种调节酶，是维持细胞内
外正常离子浓度的重要酶系，与细胞的正常能量代
谢有密切关系。它在调节心肌收缩力、维持中枢神经
兴奋性方面起着重要作用[1七]。目前它广泛地用于临
床治疗心衰、高血压、头痛、失眠等症状。本研究结果
显示，Gyp体外对Na+，K+-ATP酶具有显著、迅速
的抑制作用，并呈浓度依赖性，且对脑微粒体Na+，
K+一ATP酶的抑制作用较强。推测Gyp对心、脑的
药理作用与Gyp对两个组织中Na+，K+一ATP酶
的抑制作用有关。
酶动力学分析显示，Gyp与Na+竞争单一结合
位点卟~8]，使得低Na+浓度的抑制作用更强；Na+与
酶以E·ATP复合物的形式结合，Gyp与酶的结合
也如此，但不被E·ATP复合物干扰，即E·
ATP·Gyp复合物。增加反应介质中的Gyp浓度，
斗U
20多
一
)U
．脑／25
／
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一0．1 一O．05 0 0．05 O．J一2
Na+1／C(mmol-L一11
()·2
∥O·lj∥
0 l 2
k+I／C(mmol·L’。、
u-u。
多。．。：{．／。。
2一l 0 1 2 3 4-2—10 1 2 3 4
ATP1／C(mmol·L-J)ATPl／C(mmol‘L．J)
心：1-Gyp0 mg／L2-Gyp30mg／L
脑：卜Gyp0mg／L2-Gyp100mg／L
heart：1-Gyp0mg／L2-Gyp30mg／L
brain：1-Gyp0mg／I。2-Gyp100mg／L
图4双倒数曲线显示Na+，K+和ATP浓度对Gyp
抑酶作用的影响(J±s，n=11)
Fig．4DoublereciprocalplotsshowinginhibitionofGyp
onNa+．K+一ATPaseinv riousconcentra—
tionsofNa+，K+，andATP(工±s，n—11)
使E+ATP—E·ATP平衡右移，增加了酶与ATP
的亲和力，同时随着ATP活性降低，酶的K。值和
y。。。也降低，但曲线斜率不变，说明Gyp对ATP表
现反竞争性抑制作用睁9|。对K十的混合型抑制作用
提示，Gyp与K+对酶的结合位点与Na+不同。
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绞股蓝总苷对大鼠心、脑Na+,K+-ATP酶的抑制作用及其动力
学分析
作者： 韩晓燕， 卫洪波， 张富程， HAN Xiao-yan， WEI Hong-bo， ZHANG Fu-cheng
作者单位： 中山大学附属第三医院,中心实验室,广东,广州,510630
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(10)
被引用次数： 6次
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