全 文 ：·276· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第2期2006年2月
物时，必须加入细胞分裂素解除抑制，才能打破休
眠，促进萌发[1]。
羌活种子中内源Z、GAs、IAA和ABA的量在
20d时都增加，可能有利于启动羌活种胚的生长分
化。从羌活种子内源Z的变化来看，Z与种胚的生长
速度有关，羌活种胚生长缓慢的时期是层积70和
150d时，这两个时期羌活种子中内源Z量相对较
低。羌活种子内源IAA量在20d时增加，之后下
降，在i00和150d时检测不到，且未完成生理后熟
的羌活种子IAA量比出芽种子中的高，可能羌活种
子内源IAA与羌活种子休眠的的解除有关。
羌活种子内源GA。量在100d时较低，别的时
期都比较高，尤其是在20d时达到最高值，可能此
时GA。量的增加提高了羌活种胚的生长潜力，有研
究指出内源赤霉素可能通过这两条途径控制种子萌
发：降低胚周围组织的机械阻碍作用和提高胚的生
长潜力，种皮和胚乳的破裂导致烟草种子休眠解除
与赤霉素相关[2]。羌活种子内源ABA量在20d时
增加，之后下降，到i00d时就检测不到了，ABA量
在层积前期增加，可能促进胚的分化和发育，有研究
指出ABA在植物种胚发育中的作用主要有两点：
一是刺激胚胎的发生，一是防止成熟的胚过早萌发
而影响物种的延续[3]。而赤霉素可能对打破种子休
眠没有直接的作用，如通过后熟和层积能提高Ara—
bidopsisthaliana赤霉素缺陷突变体对赤霉素的敏
感性来减轻种子的休眠；夕}源GA。处理A．thaliana
的休眠种子不能很有效地打破休眠，GA。只是当
ABA的合成被抑制的时候才促进种子的萌发[“。羌
活种子中内源GA。的量一直远高于ABA的量，而
且不同质量浓度的外源GA。浸泡完成形态后熟的
羌活种子(胚率80％)24h对打破羌活种子的生理
后熟效果也不明显(未发表)，可能GA。对打破羌活
种子的休眠也没有直接的作用。根据近些年来的研
究，从生理学方面分析指出ABA和赤霉素在种子
中的作用有“拔河”般的激素平衡关系，决定着种子
所有的休眠和萌发能力。ABA高敏感水平和赤霉素
低敏感水平导致种子休眠程度增加，反之，ABA低
敏感水平赤霉素高敏感水平导致种子休眠程度降
低[s]。层积后期不能检测到ABA，此时羌活种子并
没有解除休眠，可能除了ABA之外还有其他内源
抑制物质，有待进一步的研究证明。
致谢：实验得到中国林业科学院分析中心王文
芝老师帮助。
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筛选草珊瑚黄酮高产细胞克隆系的研究
涂艺声，吴笑臣
(江西师范大学生命科学学院，江西南昌 330022)
植物单细胞克隆的研究，国际上自20世纪70
年代以后迅速发展。其原因是，一方面理论研究的需
要，另一方面细胞工程的研究，特别是植物次级代谢
工业化生产的兴起，推动了单细胞克隆研究的发
展m2|。笔者在江西省自然科学基金资助下，已研究
报道了草珊瑚Sarcandraglabra(Thunb．)Nakai
愈伤组织启动诱导、悬浮细胞培养系统‘3~53和建立
了一套适合草珊瑚细胞克隆的平板培养技术嘲。
光是植物生长发育的重要环境因素，它作为一
种调节植物信号以调节植物的各生理过程因子，在
收稿日期：2005—04—01
基金项目：江西省自然科学基金项目(99460)
作者简介：涂艺声(1957一)，女，教授，2002年调入江西师范大学，研究方向植物生物技术。
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第2期2006年2月·277·
研究欧芹悬浮培养细胞的类苯丙烷代谢和黄酮苷途
径中[7]报道，光诱导类苯丙烷代谢顺序相关PLA
酶，肉桂酸一4一羟基化酶，P一香豆酸辅酶A连接酶(组
I)和类黄酮苷途径的乙酰辅酶A羧化酶，黄烷酮
合成酶的活性。尤其是紫外光，通常刺激许多培养物
形成某些次级代谢产物，高原植物因接受紫外光线
多，类黄酮成分的质量分数相对高，这可能是因为黄
酮类物质对植物自身起保护的功能。
为了探索细胞工程提高生产草珊瑚天然有效成
分的技术方法，笔者采取相关的诱导方法，处理裸细
胞并结合单细胞克隆培养，进行了系统的筛选研究
检测工作，这为细胞大量培养生产草珊瑚有效成分
提供了基础。
1材料
采用人工诱导继代培养的第38代草珊瑚愈伤
组织无性系，经液体悬浮振荡培养2代，收集培养物
作细胞诱变及其平板培养筛选的材料。
2方法
2．1 草珊瑚细胞克隆系培养：草珊瑚细胞克隆系培
养基和培养方法见文献报道[3“]。
2．2草珊瑚悬浮物的紫外光诱变：草珊瑚悬浮培养
物的制备方法参见文献报道[5]，然后在1000r／min
离心5min，用吸管吸去上清液，沉淀的细胞在无菌
条件下定量转入灭菌皿中，以人工紫外光辐照裸露
细胞，辐照度为625／-W／cm2并进行不同辐照时间
5、4、3、2、1、0．5、0．25、0min处理和不同细胞密度
(个／mL)：2700、3600、4500、5400、6300、7200、
8100处理实验，此后即进行细胞的平板培养。
2．3草珊瑚悬浮培养福马酸、琥珀酸培养诱变及培
养方法：在悬浮培养基中分别添加60、40、20、10、5、
0mg／L不同质量浓度的福马酸、琥珀酸后，进行诱
变培养15d，以后正常悬浮培养二代，再进行细胞平
板培养。悬浮培养方法见文献报道[5]。
2．4草珊瑚细胞平板培养基及培养方法：草珊瑚诱
变细胞平板培养及培养方法见文献报道[6]。
2。5细胞克隆的挑选和继代培养：草珊瑚细胞平板
培养30d，挑选直径1～2mm的细胞克隆团块于三
角瓶中继续培养，每30天转接1次，连续培养4次，
其后各克隆系作为第1代，每克隆系一半用于继代
培养，一半用于相对增长率、总黄酮量的检测。克隆
系继代培养周期30d。
2．6细胞相对增长率的测定计算、总黄酮的提取、
测定法：采用相对增长率进行对比，以消除因接种量
的差别产生的影响。实验时，称重接种培养物(接种
前后分别称三角瓶及内含物的质量，得接种量)，培
养一个月后收获培养物并称重。计算公式：相对增长
率一[(收获质量一接种质量)／接种量]×100％。总
黄酮的提取、测定见文献报道[3]。
3结果
3．1 紫外光辐照诱变因子的效应：利用草珊瑚有效
成分之一黄酮吸收紫外光的特性，人工辅加紫外光
辐照为诱变压力，期望诱导细胞内表达有关酶的
DNA发生变异，继之，经单细胞克隆筛选变异细胞
株。由表1结果表明草珊瑚细胞紫外光辐射半致死
时间为2min，当辐照时间为5min时，细胞克隆植
板率很低，并表现出细胞严重受伤害，细胞克隆很难
发生，0．5min以下的辐照时间影响植板率变化甚
小，植板率密度高，不利于细胞克隆筛选，由表1得
知3min的紫外光辐射较为适合，细胞植板率为
8．35％，能有效发生细胞克隆以及区别挑选(表1内
诱变细胞的密度为5000个／mL)。
表1紫外光辐射草珊瑚细胞不同时问
处理的克隆植板率效应
Table1 PlantefficiencycOrrespOndingtovarious
ultraviolettimperiods
5 4．32 79．38
4 5．88 71．93
3 8．35 60．14
2 10．43 50．21
1 15．5l 25．97
O．5 17．96 14．27
0．25 20．68 1．29
0 20．95
不同裸细胞密度受紫外光辐射后与其细胞克隆
的发生和生长存在密切关系，由表2可以看到细胞
密度在4500个／mL细胞以下的处理，细胞植板率
较低，而超过8000个／mL细胞时，克隆植板率迅速
提高，这是因为细胞密度大，细胞间互相遮盖，而紫
外光透过力差，结果是有的细胞未受到紫外光的作
用生长势强所致。因此，认为本实验适宜紫外光辐照
(辐照度625btW／cm2)的细胞密度为4500～7200
个／mL，辐照时间采用3min。
表2紫外光辐照不同细胞密度的
细胞克隆植板率变化
Table2 Plantefficiencycorresponding
toirradiatedcellulardensity
诱变细胞密度／(个·mL“) 克隆植板率／％
O．82
5．34
8．71
10．89
11．03
11．22
17．53
3．2福马酸、琥珀酸诱导草珊瑚细胞的胁迫实验：
O
O
O
O
0
O
O
加
∞
印
∞
∞
加
如
2
3
4
5
6
7
8
万方数据
·278· 中草芮 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第2期2006年2月
福马酸、琥珀酸均为草珊瑚有效成分[3]，本实验期望
通过添加外源福马酸或琥珀酸质量浓度胁迫压力，
诱导、筛选有效成分(福马酸或琥珀酸)的高产细胞
突变株，在悬浮培养中分别单独添加60、40、20、10、
5、0mg／mL不同质量浓度的福马酸或琥珀酸预处
理诱变培养，测定其悬浮培养物的相对增长率，结果
是几乎都比对照的相对增长率降低1～2．5倍，有些
处理的细胞全褐死，不能生长，尤其采用它们的悬浮
培养物进行细胞平板培养，多次重复表现植板率几
乎为零，这可能因为有效成分福马酸、琥珀酸皆属草
珊瑚的初级代谢物，当外源添加后，直接扰乱其初级
代谢生理过程，进而对生活细胞的有关酶起了抑制
或伤害，致使其生长不良乃至死亡，故此预示福马酸
和琥珀酸外源添加作诱导压力是不能引发代谢正效
应的。
3．3细胞克隆系的培养和变异株的筛选：草珊瑚细
胞经紫外光辐照诱变处理后，立即进行平板细胞分
离培养，约15d开始有克隆形成的迹象(肉眼可见
平板上凸起的“星”点)，30d后挑选增殖块(2mm
大小)的克隆小团块转代到三角瓶新鲜培养基上培
养，初选到215个诱变细胞克隆株；连续培养4次后
开始选优去劣，最后选留36个细胞克隆系，表3列
出部分克隆系的分析结果。
表3细胞克隆第9代生长和总黄酮的比较
Tahie3 Contrastofcellcloneandnavones
●
in9thgeneration
克隆系相时瞥氏帑／％与亲本相tt／倍总黄酮／％提高亲本的百分率／％
由表3可以看到，各克隆系间的差异非常明显，
它们的相对增长率变化在317．33％～871．51％，19
个细胞株增长率中有14个超过原始株，超过原始株
的细胞株系占71．43％，总黄酮质量分数变化范围
在2．89％～5．09％，19个细胞株中总黄酮有14个
超过原始株，超过原始株的细胞株系占61．9％，从
中选出4个双高(即增长率高、总黄酮质量分数高)
细胞系SG一112，SG一056，SG一130，SG一208，它们的相
对增长率是原始株系的2倍以上，总黄酮质量分数
比母株提高8％～15％。
3．4高产草珊瑚黄酮的克隆系稳定性分析鉴定：为
筛选优良克隆系，对建立的克隆系进行了连续继代
培养观察，发现早期继代培养中的克隆系无论是细
胞增殖，还是总黄酮的质量分数都表现变化很大，随
着继代培养代数的增加，各克隆系的两种指标变化
均趋向稳定。通过测定第9、10、11、12、13多代细胞
克隆系的相对增长率和总黄酮质量分数，对高产系
SG一056，SG～112，SG一130，SG一208的相对增长率和
黄酮量的继代变化作图分析，由图1明显发现，
SGl30从第9至第13代保持较稳定的水平，并且两
种指标都优于原始株系。认为SGl30属高产黄酮的
优良细胞株，它的相对增长率平均是原始株系的2
倍，总黄酮质量分数比原始株系提高15．72％，而
SG一056，SG一112，SG一208第9代时相对增长率和总
黄酮质量分数皆高，随着继代增加，它们的两个指标
仍有较大变化，尚不稳定，说明细胞克隆是来源杂小
细胞团，因此，当继代增加，不同质的细胞增殖和代
谢继续随着来源的不同而表现不同，反映在培养结
果上的差异凸显。
孚
壶
趣
增
800
孚
藤600
业
蜜
‘离400
200
“＼★—7“～l一15
p捕1r百13
连续继代培养／代
1-SG0562-SGll23-SGl304-SG2085-亲本
I-SG0562-SGll23-SGl304-SG2085-originalline
图1细胞克隆系在连续继代培养中的稳定性
Fig．1Stabilityofclonelinesduring
successivesubcultruing
3讨论
植物单细胞克隆是筛选细胞突变体的一个极其
有效的方法。利用紫外光辐照草珊瑚裸细胞诱变突
变株，结合细胞平板克隆培养分离选择，能有效地培
万方数据
中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第2期2006年2,El·279·
养高产草珊瑚黄酮的细胞株。但是通过细胞克隆培
养的许多克隆系中，有些属于细胞突变产生的表型，
有些可能仅是细胞间生理状态差异的表型，在草珊
瑚细胞克隆系连续继代培养的早期，大部分处于生
长和黄酮质量分数不稳定的状态，经过10代左右的
连续继代培养并鉴定分析，才能确定真实的高产变
异细胞株，这和大多数利用细胞克隆技术筛选高产
系的报道是一致的。作为高产草珊瑚黄酮的细胞系
必须同时满足两个条件：其一是在一定时间内，细胞
相对增殖率高；其二是细胞代谢次生产物的有效成
分黄酮质量分数高，只有这样，两者的积才表现高
产。实验中SG一130符合这两个条件。因此，认为
SGl30确属高产草珊瑚黄酮细胞株系，对于其细胞
大量培养工艺研究有待进一步深入探索。
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RP—HPLC法测定黄柏中黄柏内酯
马学敏1’2，王力生1，赵巍1，郭亚健1，郭树仁2
(1．北京中医药大学，北京100102；2．北京大学，北京100083)
黄柏为常用中药，系芸香科植物黄皮树Phel—
lodendronchi enseSchneid．及黄柏树P．amurense
Rupr．除去栓皮的干燥树皮，前者习惯称“川黄柏”，后
者习惯称“关黄柏”。黄柏性味苦寒，具有清热燥湿、泻
火解毒、退虚热等功效。主要含有生物碱，如小檗碱、药
根碱、木兰花碱等。另含黄柏酮、白鲜交酯、黄柏内酯
等。其中，黄柏内酯具有降血糖Ⅲ、驱虫、抗溃疡‘21的作
用，可作为黄柏及其制剂的指标性成分之一。
一直以来，《中国药典》及各种文献中大多单独
以小檗碱作为黄柏药材及制剂定性定量的指标性成
分，然而，小檗碱存在于黄连、三颗针、功劳木多种植
物中，其专属性较差，黄柏内酯作为黄柏药材及其制
剂的指标性成分更加具有科学性。
本实验建立了黄柏药材中黄柏内酯的测定方
法，该方法操作简便、准确，重现性好，为改善黄柏中
的指标性成分的专属问题提供参考。
1仪器与试药
1．1 仪器：RE一52A薄膜旋转蒸发仪(上海亚荣生
化仪器厂)，BruckerAM一500型核磁共振仪，
APEXⅡFT—ICR型质谱仪，SHz～3型水循环真
空泵(河南巩义市英峪电子仪器厂)，KQ一100型超
收稿日期：2005—04—24
声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，惠普
HPl050高效液相色谱仪。
1．2试药：柱色谱硅胶和薄层色谱硅胶(青岛海洋
化工厂)；水为重蒸水，乙腈为色谱纯，其他试剂均为
分析纯；显色剂为对二甲基氨基苯甲醛；关黄柏1于
2003年采自吉林，经本校生药系阎玉凝教授鉴定为
黄柏树Phellodendronamu e seRupr．干燥树皮；
关黄柏2、川黄柏、山黄柏来自中药学院生药系标本
馆；黄柏内酯对照品为自制，质量分数>98％。
2方法与结果
2．1 黄柏内酯的提取分离与结构鉴定：将关黄柏1
依次用石油醚、醋酸乙酯提取。将醋酸乙酯提取物进
行硅胶柱色谱分离，以氯仿一醋酸乙酯(50：1～8；
1)进行梯度洗脱，将氯仿一醋酸乙酯(10：1)部分进
行反复柱色谱分离，得到白色针状结晶(CHCl。一
MeOH)。经结构鉴定为黄柏内酯(obaculactone)[3]。
2．2色谱条件：Diamonsil—C18分析柱(250mm×
4．6mm，5肚m)，流动相：乙腈一水一磷酸(50：50：
0．2)，体积流量：1．0mL／min，柱温：室温，检测波长
210nm。在此条件下，样品中黄柏内酯与相邻成分
达到良好基线分离，见图1。
万方数据
筛选草珊瑚黄酮高产细胞克隆系的研究
作者： 涂艺声， 吴笑臣
作者单位： 江西师范大学生命科学学院,江西,南昌,330022
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(2)
被引用次数： 1次

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引证文献(1条)
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本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_zcy200602044.aspx