全 文 ：·1716· 中草喃ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11月
半夏的甲基化水平在50％以上，这可能与半夏的高
倍性有直接关联。因为当几个基因组综合到一个核
中，会发生超量表达的浪费现象，为减少这种过量的
基因表达，多倍体半夏中许多结构基因可能发生了
遗传二倍化，即多倍体中基因的表达水平被减少到
与其二倍体祖先相近或相同。这种遗传二倍化是通
过两种途径之一来实现的：基因沉默或基因剂量补
偿。而迅速发生的可遗传胞嘧啶甲基化增加变异可
能是遗传二倍化的一种有效途径[12‘。而不同倍性半
夏间的甲基化程度差别不大(54．4％～58．2％)，
提示半夏多倍化过程中还存在其他表观遗传作用途
径，比如：组蛋白修饰、染色质重改构等，这些表观遗
传所控制的基因程序化表达的结果就是保证多倍体
植物能够正常生长发育。
本实验结果表明，不同倍性多倍体半夏之间存
在大量的胞嘧啶甲基化变异。但由于至今未发现半
夏的二倍体，还不能确定与二倍体祖先相比，多倍体
半夏形成过程中胞嘧啶甲基化变异的水平以及这些
基因组变异是否具有随机性和稳定性。异源多倍体
物种的一个重要特性是基因分化，即基因在剂量上
的重复使得部分复等位基因可以分化成具有不同功
能的新基因。这些伴随异源多倍体物种形成所迅速
产生的表观遗传变异无疑可作为自然选择及适应性
进化的原材料，进而有助于多倍体物种在进化上的
成功，这也许就是半夏多倍体复合体具有如此广泛
分布区这一生态优势的主要原因。本研究结果为半
夏多倍体复合体的地理分布演化趋势研究奠定了一
定的理论基础。
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何首乌cDNA文库的构建及分析
谭雪梅1，申彦晶2，严 萍2，郑传进2，赵树进p
(1．广州军区广州总医院，广东广州 510010，2．华南理工大学，广东广州510640)
摘 要：目的 为进行药用植物次生代谢产物的生物合成基因调控研究，构建了三年生何首乌叶eDNA文库。方法
以何首乌成熟叶片为材料提取其总RNA；纯化出mRNA；反转录合成双链eDNA；钝化eDNA末端；连接上EcoRI
接头；经XhoI酶切后．使用SepharoseCL一2B凝胶介质滤过，收集400bp以上的片段与Uni—ZAPXR载体连接，经
包装蛋白包装成eDNA文库。Uni—ZAPXR载体可以在辅助噬菌体ExAssisthelperphage的共感染下，快速释放出
pBluescriptSK一噬菌粒，经转染E．coliSOLR后，铺于氨苄青霉素抗性平板。分别利用PCR和双酶切的方法鉴定插
入片段的大小。结果测定该初始文库的滴度为1．07×106pfu／mL。含有5．4×105个重组子，插人片断长度为
0．s～2．0kb；扩增文库的重组子为4．25X10“个，重组率为98．5％。结论经检测所构建的文库库容量满足基因筛
选要求．为进行中药材相关功能基因调控研究奠定基础。
收稿日期：2008—01一Z0
基金项目：广东省科技厅重点项目资助(63108)
作毒简介：谭雪梅(1982)．女，广东省江门市人，在读研究生，研究方向为生物制药。E—mail：txml021@126．corn
’通讯作者赵树进E—mail：gzzsjzhs@pub．guangzhou．gd．cn
万方数据
中草蒋ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11月· 717·
关键词：eDNA文库；何首乌；次生代谢产物
中图分类号：R282．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)11一1716一05
ConstructionandanalysisofeolygonummultiflorumcDNAlibrary
TANXue—meil，SHENYan—jin92，YANPin92，ZHENGChuan—jin2，ZHAOShu—jinl
(1．DepartmentofPharmacy，GuangzhouGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand，Guangzhou510010，Chinal
2．SouthChinaUniversityofTechnology。Guangzhou510640，China)
Abstract：ObjectiveTo onstructacDNAlibraryofthree—yearoldPolygonummultiflorumeaf
tissuesSOastofurtherresearchthegeneregulationofsecondarymetaboliteb osynthesisofmedicinal
plants．MethodsTotalRNAfromleaftissuesofP．multiflorumwasextractedandmRNAwaspurified．
whichweresynthesizedtodoublestrandcDNAthroughreversetranscription．AfterthecDNA miniwas
blunted，the5’endofEfDRI adaptersphosphorylatedwasconjoined，andthendigestedbyXhoI，
eDNAfragmentswerefractionatedbySepharoseCL一2Bspincolumn．Thefragmentslongerthan400bp
werelinkedtoUni—ZAPXRvector．TheprimarycDNAlibrarywasestablishedaftertherecombinantshad
beenpackaged．Uni-ZAPXRVectormightfleetlyreleasepBluescriptSK— hasmidsatthepresenceof
ExAssisthelperphageofcoinfectionandi vertedE．coliSoLR．Finally，PCRandoubleenzymes
digestionwereusedtoanalyzethrangeofinserts，respectively．ResultsThetiterofcDNAprimary
librarywas1．07×106pfu／mLandthelengthofexogenousinsertwasatabout0．5—2．0kbwith5．4×105
recombinants。therecombinantsof mplifiedl brarywere4．25×1011andtherateofrecombinationw s
98．5％．ConclusionTheresultsindicatethatthecDNAlibraryofP．multiflorum1eatissueshaenough
volumeforscreeningthedesiredg nesandsetsupabasisforstudyingo generegulationofsecondary
metabolitebiosynthesisofmedicinalpl ntsbesides．
Keywords：cDNAlibrary；PolygonummultiflorumThunb．；secondarymetabolite
近年来，中药功能基因的研究，特别是药用植物
次生代谢产物的生物合成基因调控研究已成为中药
现代化研究的热点。药用植物何首乌Volygonum
multiflorumThunb．为蓼科(Polygonaceae)的多年
生落叶草本植物，始载于《开宝本草》，又名夜交藤、
乌肝石、赤首乌石，根、茎、叶均可入药，主要成分为
葸醌类及二苯乙烯苷类化合物，具有抗衰老、补肝
肾、益精血、乌须发之功效，是滋补肝肾常用中药之
一[1]。由于人工栽培的何首乌产量和品质的限制，难
以满足临床上日益增长的需要，这在一定程序上加
大了对野生何首乌资源的破坏。应用植物基因工程
和组织细胞工程相结合的生物学方法有望成为生产
这些具有重要药理作用的次生代谢产物的有效手
段[2]。何首乌作为一种广泛种植的中药材，次生代谢
产物种类丰富，但目前对于何首乌有效成分的生物
合成途径及基因调控的基础研究相对缺乏。本实验
以Uni—gAPXR为载体构建了何首乌叶eDNA文
库，不仅保持了珍贵的野生种质资源，还为利用生物
技术大量生产有价值的化学成分奠定理论基础。
1材料与方法
1．1材料：三年生何首乌采自广西壮族自治区靖西
农业局，样品经华南植物园邢福武教授鉴定；成熟叶
片用蒸馏水冲洗干净，75％乙醇消毒，并保存于
一70℃低温冰箱，备用。
1．2 生化试剂：DEPC购于Sigma公司；CTAB购
于北京鼎国生物公司；cDNAsynthesis试剂盒／
Uni—ZAPXRvector及DNA包装蛋白均购于
Stratagen公司；OligotexmRNAisolationKit购于
Qiagen公司；DNAMarker及所需的限制性内切酶
均购于宝生物公司(大连)。其他试剂为国产或进口
分析纯产品。
1．3总RNA提取及mRNA的分离
1．3．1对常规的CTAB法进行改良，用于提取何首
乌成熟叶组织的，gRNA。①将65℃预热的提取缓冲
液[100mmol／LTris—HCI(pH8．0)，1．4mol／L
NaCl。20mmol／LEDTA(pH8．0)，2％CTAB，
2％PVP]加入到2mLEP管中，并加入终体积分数
2％肛巯基乙醇；②在预冷的研钵中加入PVP粉末，
迅速将组织研磨成粉末，转到温浴过的缓冲液中，剧
烈振荡混匀。温浴1h左右，期间漩涡几次，使裂解
液与细胞充分接触；③取出离心管，置于冰上，向每
管中加入无水乙醇和5mol／LKAc(pH4．8)，混匀
后添加等体积氯仿一异戊醇(24：1)，冰上静置10
min，4℃，12000r／rain离心20rain；④取上清，通
过调整水饱和酸酚／氯仿的体积比，可以有效降低基
因组DNA的污染，漩涡振荡2rain，4℃，12000
万方数据
·1718· 中草黄 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11月
r／rain离-I：,10min；⑤重复氯仿一异戊醇(24：1)抽提
至界面干净；⑥小心吸取上层液体，使用10mmol／L
LiCI于一20℃沉淀RNA2h以上，4℃，12000
r／min离心20min收集沉淀；⑦沉淀经适量的2％
SDS溶解，离心取上清液，用氯仿一异戊醇(24：1)抽
提；⑧使用3mol／LNaAc(pH5．2)和无水乙醇沉淀
过夜，4℃，12000r／rain离心20min，去上清；⑨沉
淀用75％乙醇漂洗，吹干后，溶于适量的DEPC处理
水。RNA样品，用紫外分光光度计测定A。。。／A。。。及
其产率，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。
1．3．2用OligotexmRNAisolationKit从总RNA
中纯化出含poly(A)+mRNA。各取5肛L分别进行
mRNA的完整性和纯度检测。
1．4 cDNA的合成
1．4．1 合成cDNA第一链：在0．5mL微量管中加
入5btgmRNA；5pL10×第1条链缓冲液；3pL
dNTP混合物；2弘L带有XhoI酶切位点的Oligo
(dT)18引物(1．4pg似L)；1pLRNase抑制剂(40
U／uL)；1．5肛LstrataScriptRT反转录酶(50
U／uL)，混合均匀后42℃孵育1h，冰上终止第1链
反应。
1．4．2双链eDNA的合成：借助RNaseH及DNA
聚合酶的作用合成双链cDNA：20弘L10×第2条链
缓冲液；7弘L第2条链dNTP混合物；115弘L灭菌去
离子水；2弘LRNaseH(1．5U／uL)；1pLDNA多
聚酶(9U／uL)；16℃孵育2．5h(不要超过16℃，否
则容易产生二级结构)，反应结束后立即置于冰上。
1．5 pfuDNA多聚酶削平cDNA末端及EcoRI接
头连接：向加样管中加入23弘LdNTP混合物；2弘L
pfuDNA多聚酶(9U／t．tL)，72℃温育3h(不要超过
3h)；经酚一氯仿抽提，取上清，一20℃沉淀过夜。沉
30min；1弘L10×连接缓冲液I1弘L10mmol／L
rATP；1肛LT4DNALigase(4U／／．tL)；8℃连接过
夜；放人70℃水浴中，孵育30min灭活连接酶。
1．6 T4多聚核苷酸激酶磷酸化连接子57末端及
XhoI消化
1．6．1磷酸化连接子：1弘L10×连接缓冲液；2pL
10mmol／LrATP；5pL灭菌去离子水；2弘LT4
pNKinase(5U／uL)，37℃孵育30min；70℃水浴灭
活pNKinase。室温平衡后向反应液中加入28弘L
XhoI缓冲液和2pLXhoI(5U／uL)，37℃孵育
反应1．5h。
1．6．2酶切生成的eDNA分子一端带有EcoRI黏
性末端，另一端带有XhoI黏性末端。用XhoI酶
切的产物经氯仿抽提和无水乙醇沉淀后，收集的沉
淀物可用于随后的分级分离。
1．7 eDNA的分级分离与回收：将酶切后的eDNA
片段过SepharoseCL一2B凝胶柱子，每管收集液取5
肛L电泳检测，回收大于500bp的片段。
1．8 eDNA片段的连接及体外包装
1．8．1连接：将分离纯化的双链cDNA定向克隆到
经EcoRI和XhoI双酶切并去磷酸化的Uni—ZAP
XR载体上，在载体浓度不变的情况下，设计3个连
接反应(表1)。取0．01～O．1pgeDNA分别与1弘L
Uni—ZAPXR载体连接，12℃孵育过夜。
1．8．2 体外包装：连接产物用GigapackiGold
Packaging进行包装，22℃孵育2h(90～120min连
接效果最高)；产物经氯仿抽提的上清液可用作滴度
测定。另取空载体Uni—ZAPXR1 pL，其他的用去离
子水代替，补足至5肛L，同样使用GigapaekⅢGold
Packaging进行包装并进行滴度检测，作为阴性对
照实验。
淀物用9弘LEcoRI adapters重悬，4℃孵育至少1．9原始文库和扩增文库滴度及重组率的测定：将
表1 eDNA与载体连接反应体系
Table1 ReactionsystemofligatingcDNAintovector
cDNA／tuL10×连接酶缓冲液／pL10mmol／LATP／pLUni—ZAPXR载体／ttLT4DNA连接酶／pL去离子水／pL
包装产物取1弘L作10倍比稀释，以对数生长期的
E．coliXLl一BlueMRF7株为受体菌进行滴度测定，
90mm培养平板加入3mL顶层琼脂，15肛L0．5
mol／LIPTG和50肛L250mg／mLX—gal，37℃恒温
培养过夜；次日统计噬菌斑数目，并计算文库的滴度
及蓝白斑比较[文库滴度公式P(pfu／mL)=噬菌斑
数×稀释倍数×103／噬菌体铺平板的体积]。按照原
始文库的滴度，继续感染宿主菌以扩增文库。最后向
扩增的文库中加入终体积分数为7％的DMSO，分装
成小管，于一70℃长期保存。
1．10噬菌体切割实验：取一定体积的扩增文库、
ExAssisthelperphage和E．coliXLI—BlueMRF7宿
万方数据
中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11月·1719·
主菌按比例将3者混合，Uni—ZAPXR载体在辅助
噬菌体ExAssisthelperphage的共感染作用下，释
放出pBlueserpitSK一噬菌粒，转染E．coliSOLR后，
铺于含有氨苄青霉素抗性的LB平板中培养。
1．11eDNA文库的质量鉴定
1．11．1PCR鉴定：随机挑取15个噬菌斑进行PCR
扩增，根据载体多克隆位点两端的序列设计引物，上
游引物5『_GTAATACGACTCACTATAGGG一37，
下游引物5’一AATTAACCCTCACTAAAGGG一3’，
PCR反应条件为94℃、3min，94℃、40S，54℃、30
S，72℃、40S，72℃、10min，30个循环。PCR产物
用1．o％凝胶电泳检测。
1．11．2双酶切鉴定：从噬菌粒抗性平板中随机挑
取12个阳性克隆子接种于LB液体培养基，37℃震
摇过夜，收集菌体，用碱裂解法[31提取pBluescript
SK一噬菌粒，经EcoRI和X^DI双酶切的产物用
1．o％凝胶电泳检测插入片段的大小。
2结果
2．1 RNA与mRNA的提取和纯化：通过改良的
CTAB法提取的总RNA，取2弘L样品稀释50倍后
进行紫外分光光度检测，A。。。／A瑚一1．982，表明所
得RNA纯度较高；1．ooA琼脂糖凝胶电泳结果显示，
28S和18SrRNA两条特征条带清晰，亮度比接近
2：1，说明总RNA较完整，没有明显的降解和基因
组DNA污染现象，多糖多酚等次生代谢物基本去除
干净(图1)。分离纯化出的mRNA，A。。。／以。。。=
2．010，总得率为12．02tLg，mRNA的量满足下一步
cDNA合成要求。
围1总RNA电泳图
Fig．1ElectrophoretogramoftotalRNA
2．2分析合成eDNA及体外连接：取cDNA第2链
反应产物，1．2％琼脂糖凝胶电泳检测，图2中显示
合成的eDNA为弥散状条带，分布在0．5～2．0kb。
双链eDNA经柱色谱分离，共收集12管，每管取
5pL进行电泳检测，确定回收大于500bp片段用于
连接反应。文库构建过程中eDNA与载体的连接比
例对连接效率影响较大。设计3种连接反应，分别包
装，滴度检测表明eDNA与载体最佳连接比为1；1。
卜双链eDNAM—DL一2000Marker
Lane1一DoublestrandeDNAl
M—DL一2000Marker
图2双链cDNA电泳图
Fig．2ElectrophoretogramofdoublestrandeDNA
2．3文库的滴度及重组率：按照载体与eDNA的最
适连接比进行放大培养检测，结果显示原始文库滴
度为1．07×106pfu／mL，含有5．0×105重组子，插
入片段长度为0．5～2．0kb；扩增后的滴度为4．25×
1011pfu／mL重组子，蓝白筛选鉴定文库的重组率
为98．5％，而阴性对照的篮白筛选实验，涂布平板，
观察平板中生长的几乎全为蓝斑，说明无明显外源
片段的插入，白斑数近乎为零(图3)。
圈3蓝自筛选原始文厍(a)和蓝自筛选阴性对照(b)
Fig．3Primarylibraryofblueandwhitedot
screening(n)andnegativeco trol
ofblueandwhitedotscreening(b)
2．4插入片段的分析：(1)随机挑取15个噬菌斑，
PCR鉴定插入片段的大小，电泳显示片段长度大部
分在0．4～2．0kb，平均大小在1kb左右(图4)。
(2)随机挑取12个在氨苄青霉素抗性平板中生长的
单菌落，过夜摇菌后，提取pBluescriptSK一噬菌粒，
经EcoRI和XhoI双酶切，电泳测定酶切产物的插
入片段大小集中在0．4～2．0kb(图5)。
3讨论
eDNA文库的筛选和植物表达序列标签
(expressedsequencetag，EST)等分子生物学技术
可应用于药用次生代谢调控机制的研究以及功能基
因的克隆及表达鉴定[3]。构建eDNA文库是研究功
能基因的有效方法，目前，已广泛用于目的基因的分
万方数据
·1720· 中草嚆ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第11期2008年11月
泳道1～15一随机克隆PCR产物M—DL一2000Marker
Lane1—15一PCRProductofrandomclonesM—DL一2000Marker
圈4随机挑取15个克隆的PCR产物检测
Fig．4PCRExaminationofrandomselectedfifteenclones
泳逼1～12-随机噬菌粒M—DL-2000Marker
Lane1—’12一randomplasmidM—DL一2000Marker
圈5 pBluescritSK一噬菌粒双酶切检测
Fig．5Examinationofd gestionw thXhoI。EcoRI
offragmentscontainedpBluecriptSK—phasmids
离。为了进行中药何首鸟次生代谢物的生物合成基
因调控的基础研究，笔者构建了何首乌叶eDNA文
库，在构建文库的过程中，特别注意了以下几点：
(1)mRNA的质量是文库构建成功的最重要的
因素，低质量mRNA(如部分降解)建立的文库容易
丢失大分子mRNA的全长拷贝，以及稀有的转录
本[‘]。因此，在取材上选用新鲜的何苜乌叶片为材
料，这时提取出的mRNA较丰富，质量也相对较高。
(2)cDNA合成的质量除了保证在总RNA和
mRNA提取过程中无RNase污染外，逆转录酶的选
择也很重要。采用了Stratagene公司的基因工程逆
转录酶StrataScript，它是一种新型的无RNaseH活
性的莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV～RT)，
在RNaseH位点的高度保守区发生的点突变导致
RNaseH活性丧失而并不影响其逆转录功能，这种
无核酸酶活性的突变体使其较野生型MMLV—RT
能转录出较高比例的全长eDNA转录本，使eDNA
合成的长度和效率明显增加，这对于一个高质量的
cDNA文库是必需的。
(3)双链eDNA分级分离也是一个不可忽略的
环节。cDNA经XhoI酶切后形成大小不等的片段，
若将这些片段都与载体连接，那些小片段会优先跟
载体相连，使得文库中小片段占有较高的比例，大大
降低了文库的质量Is]。通过SepharoseCL一2B凝胶柱
去掉绝大部分小于400bp的cDNA及酶切反应残留
的DNA小片段，保证了文库中含有较大的cDNA分
子，有利于文库的后续筛选工作[6]。
(4)载体与cDNA连接效率的高低会直接关系
到文库构建是否成功。文库连接与一般的片段克隆
的连接不一样，一般的片段克隆连接是固定长度的
载体与固定长度的目的DNA连接，而文库连接是固
定长度的载体与非固定长度的目的DNA连接，目的
基因cDNA长的有lokb以上，短的只有400bp或
更短。因此，须对两者的连接比例进行摸索。在实验
中，建立了几个平行反应，得出两者的连接比为1
时，文库滴度最高。
cDNA文库的质量一般包括文库滴度、重组率
及插入片段大小。实验表明，所构建的何首乌cDNA
文库初始滴度为1．07×106pfu／mL，重组率为
98．5％，插入片段在0．5～2．0kb，文库的质量满足
随后的EST测序及文库筛选要求，目前，本实验室
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(上接第1636页)
G一1)，74．17(G一2)，79．29(G一3)，71．16(G一4)，78．91
(G一5)，62．57(G-6)。以上数据与文献对比[73鉴定化
合物为3—0一pD一吡喃葡萄糖基(1—3)一a—L一吡喃鼠李
糖基(1—2)-a-L一吡喃阿拉伯糖基一常春藤皂苷元一28—
0一肛D一吡喃葡萄糖酯苷。
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万方数据
何首乌cDNA文库的构建及分析
作者： 谭雪梅， 申彦晶， 严萍， 郑传进， 赵树进， TAN Xue-mei， SHEN Yan-jing， YAN
Ping， ZHENG Chuan-jin， ZHAO Shu-jin
作者单位： 谭雪梅,郑传进,赵树进,TAN Xue-mei,ZHENG Chuan-jin,ZHAO Shu-jin(广州军区广州总医院
,广东,广州,510010)， 申彦晶,严萍,SHEN Yan-jing,YAN Ping(华南理工大学,广东,广州
,510640)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(11)

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