全 文 ：物总离子流 (T IC) 峰面积包含萃取产物总量及其极
性分布信息, 在测量条件相同及产物共存组份数量
和比例变化不大的情况下, 选择离子峰面积在总离
子流峰面积的百分比 (归一化法)能在一定程度上反
映目标产物在总萃取产物中的含量相对关系。本实
验利用这一特性对所选改性剂的萃取和选择性进行
了对比和选择, 简捷而直观。
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制备高效液相色谱分离纯化茶氨酸对照品
肖伟涛, 朱小兰, 陈　波3 , 姚守拙Ξ
(湖南师范大学化学研究所, 湖南 长沙　410081)
摘　要: 目的　研究制备型高效液相色谱分离纯化茶氨酸对照品的方法。方法　原料水提后的水相用被水饱和的
氯仿萃取, 水相蒸发浓缩后离心, 上清液进行H PL C 分离制备, 收集液冷冻干燥, 粗产品用甲醇清洗即得。结果　该
法所得产品用外标法定量, 纯度大于 98% , 制备收率大于 60%。结论　本法生产周期短, 产品质量高, 方法简便, 生
产费用低, 茶氨酸产品可用作分析方法的对照品。
关键词: 茶氨酸; 对照品; 制备高效液相色谱
中图分类号: R 28412; R 286102　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 02 0148 03
Prepara tion and pur if ica tion of thean ine reference substance by prepara tive HPLC
X IAO W ei2tao , ZHU X iao2lan, CH EN Bo, YAO Shou2zhuo
( Inst itu te of Chem istry, H unan N o rm al U niversity, Changsha 410081, Ch ina)
Abstract: Object　To estab lish an iso la t ion m ethod of thean ine reference sub stance by p repara t ive
H PL C. M ethods　A fter raw m ateria l ex tracted by w ater, the w ater phase w as ex tracted by ch lo rofo rm
satu ra ted w ith w ater, then concen tra ted on a thermo sta t. A fter cen trifuged, supernatan t w as iso la ted and
pu rif ied by p repara t ive H PL C. F ract ion w as frozen and dried by F lex i2D rier. C rude p roduct w as rin sed by
m ethano l. T he pu rity of p roduct w as determ ined by analyt ica l H PL C. Results　T he pu rity of p roduct is
h igher than 98% and thean ine yield from raw m ateria l by th is m ethod exceeds 60%. Conclusion 　T he de2
veloped m ethod is simp le, rap id, and at low p roduct ion co st. T he p roduct ow n s the quality of reference
sub stance.
Key words: thean ine; reference sub stance; p repara t ive H PL C
　　茶氨酸 (N 2乙基2Χ2L 2谷氨酰胺) 是影响茶叶品
质的重要组成部分[1 ]。茶氨酸是茶叶氨基酸中一种
非蛋白氨基酸, 约占茶叶中游离氨基酸的 40% 以
上, 占茶叶干重的 1%～ 2% [2 ] , 并使茶汤鲜爽、有焦
糖味[3 ]。药理学研究表明茶氨酸能拮抗咖啡碱引起
的神经系统的兴奋作用和降血压[4, 5 ]。随着茶氨酸的
保健功效逐渐为人们所认识, 对茶氨酸的需求量不
断上升。目前关于茶氨酸对照品的合成、分离方法的
研究报道甚少。茶氨酸可采用化学合成、微生物发酵
法合成[6, 7 ]。现仅日本有少量的茶氨酸对照品, 且价
格较贵, 限制了对其进一步的研究与应用。本实验采
用制备高效液相色谱技术, 对 25% 茶叶提取物中茶
氨酸进行制备、分离纯化。
1　制备与分离
111　仪器与试剂: W aters P rep L C4000 高效液相
制备色谱仪,W aters 2487 D ual ΚA b so rbance 紫外
检测器, 10 mL 定量环,W aters M illenn ium 32色谱工
作站, JCX—250W 超声波清洗器 (山东济宁电子仪
·841· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 2 期 2004 年 2 月
Ξ 收稿日期: 2003205216
基金项目: 国家“十五”攻关资助项目 (2001BA 746C, 2001BA 804A 21)3 通讯作者　E2m ail: dr2chenpo@vip. sina. com　Fax: (0731) 8865515
器厂) , LD 4—2A 离心机 (北京医用离心机厂) ,
T GL —16C 高速离心机 (上海安亭科学仪器厂) , K i2
net ics F lex i—D ryTM M P 冷冻干燥机 ( FT S○R sys2
tem s, N Y, U SA )。二次蒸馏水, 试剂均为分析纯。
茶叶提取物由本实验室制备, 其中茶氨酸含量约为
25%。
112　制备条件
11211　原料的预处理: 称取 1 g 茶叶提取物于 20
mL 具塞试管中, 加二次蒸馏水至刻度, 超声 10
m in, 4 500 röm in 离心, 上清液用等体积水饱和的氯
仿萃取 1 次。水相置于水浴锅上蒸发浓缩至 10 mL ,
再以 11 000 röm in 离心 3 m in, 所得溶液备用。
11212　色谱条件: 色谱柱: 反相W aters P rep N ova2
pak○R HR C 18柱 (300 mm ×19 mm , 6 Λm ) ; 柱温: 室
温; 检测波长: 215 nm ; 流动相: 011% 甲酸水溶液;
流速: 5 mL öm in。制备色谱图见图 1。
图 1　茶氨酸的制备 HPLC 谱图
F ig. 1　Preparative HPLC chromatogram of thean ine
113　H PL C 收集液的处理方法: 收集液冷冻干燥得
淡黄色粉末状晶体, 用无水甲醇将晶体超声 10 m in
后, 离心, 如此反复两次, 得白色晶体。
2　产品质量分析
211　仪器与试剂:W aters 2695 分离单元, PDA 996
二极管阵列UV 检测器,W aters M asslynxTM 315 色
谱管理系统。乙腈为色谱纯, 甲酸为分析纯, 水为二
次蒸馏水。茶氨酸对照品由日本东京化成工业株式
会社提供, 纯度大于 98%。
212　色谱分析: 色谱柱: Spherigel C 18柱 (5 Λm , 250
mm ×416 mm ) ; 柱温: 30 ℃; 检测波长: 200 nm ; 流
动相: 011% 甲酸水溶液; 流速: 1 mL öm in。产品与对
照品的色谱图见图 2, 3。
3　结果与讨论
图 2　相应制备收集液的 HPLC 色谱图
F ig. 2　HPLC chromatogram s of relevan t fraction s
图 3　茶氨酸对照品 (A)和产品 (B)的 HPLC 图谱
F ig. 3　HPLC chromatogram s of thean ine reference
substance (A) and product (B)
311　制备分离波长的选择: 因制备分离所用检测器
为分析型紫外检测器, 灵敏度高, 当大量样品溶液进
入色谱柱后, 所分离的目标成分绝对量较大, 采用
200 nm 检测时, 已远超出检测器的检测线性范围,
无法监控组份分离情况; 因此在本实验中采用响应
灵敏度较低的 215 nm 进行分离检测, 可有效解决
检测灵敏度与制备分离量不相匹配的问题。
312　产品纯度分析及收得率: 1 g 茶叶提取物可制
备约 160 m g 茶氨酸, 面积归一化定量确定产品纯
度为 98186%。外标法定量确定产品纯度为 98% 以
上。按 98% 的纯度来计算原料中茶氨酸的收率为
62172%。
313　前处理条件的优化
31311　提取: 由于茶氨酸在水中溶解度很大, 用 20
mL 去离子水处理茶叶提取物, 茶氨酸基本提取完
全。将一次提取的不溶物再用 20 mL 去离子水重新
处理, 发现茶氨酸含量很低, 仅为原来的 2% 左右,
而咖啡因等杂质含量很高, 这些杂质的引入将会干
扰后面的分离纯化, 故原料仅提取一次。若提取物用
80% 甲醇水溶液进行处理, 亦能提取 98% 茶氨酸,
·941·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 2 期 2004 年 2 月
但将该甲醇水溶液进制备色谱, 不能将茶氨酸分离
出来。
31312　萃取: 在前处理过程中若不用被水饱和的氯
仿萃取 1 次, 原料中咖啡因、可可豆碱等将会干扰后
面的分离纯化。被水饱和的氯仿萃取后, 不仅能将咖
啡因、可可豆碱萃取一大部分, 而且茶氨酸没有损失。
314　进样量的选择: 约 1 g 茶叶提取物用 20 mL 去
离子水处理, 每次进样 115 mL , 分离效果很好, 但制
备量偏小, 上柱量不足 20 m g; 当进样 2 mL , 突破了
检测极限, 不能准确收集产品。将 20 mL 水溶液浓
缩至 10 mL 左右, 每次进样 2 mL , 上柱量约 50 m g,
不影响分离度, 纯度亦符合质量要求 ( 98% ,
H PL C)。且根据分析色谱仪对相应收集液进行跟踪
检测, 可知Ë 部分为目标物茶氨酸的收集液 (图 2)。
315　制备柱的清洗与再生: 原料经水提、萃取、浓缩
离心等预纯化, 尽管将茶氨酸的含量大幅提升, 但溶
液中仍含有一些杂质, 如咖啡因、可可豆碱等, 在进
行 H PL C 分离时, 杂质亦同步进入制备柱中, 且在
制备流动相条件下无法完全被洗脱。这不仅严重损
害柱寿命, 而且影响下一次分离效果。因此, 必须在
每次分离纯化后用约 150 mL 分析纯乙腈冲洗制备
柱, 然后再用甲酸水溶液平衡色谱柱, 进行下一次的
分离纯化。
316　粗产品纯化条件的优化: 收集到的溶液, 经冷冻
干燥后, 得淡黄色的粉末状晶体。面积归一化法定量,
其纯度为 98% 以上。但采用外标法, 其纯度仅为 90%
左右。于是对粗产品进一步纯化条件进行了探讨。
　　粗产品溶于水用活性炭进行处理后, 发现淡黄
色溶液变得澄清, 但茶氨酸被活性炭强烈吸附, 吸附
率为 35% , 故用活性炭处理不可取。
茶氨酸易溶于水, 不溶于甲醇、乙醇等。通过考
察茶氨酸在甲醇、乙醇中的溶解情况表明, 茶氨酸在
二者中仅一小部分被溶解 (约 3% )。采用甲醇超声,
离心得白色粉末状晶体, 经外标法分析, 其纯度为
98% 以上, 且得率在 95% 以上。
4　结论
　　本实验建立的茶氨酸对照品的分离纯化方法通
过原料预纯化, H PL C 分离制备, 结晶过程, 能得到高
收率、高纯度的茶氨酸对照品, 且该方法具有生产周
期短, 产品质量高, 方法简便, 生产费用低廉等特点。
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超临界CO 2 流体萃取迷迭香中抗氧化活性成分的工艺研究
黄纪念1, 2, 屠鹏飞13 , 蔡同一2Ξ
(11 北京大学药学院, 北京　100083; 21 中国农业大学食品学院, 北京　100094)
摘　要: 目的　考察影响超临界CO 2 流体萃取迷迭香中抗氧化物质的因素。方法　采用正交试验设计, 以两级萃取
物中主要抗氧化活性成分鼠尾草酸含量作为考察指标, 对影响超临界 CO 2 流体萃取鼠尾草酸工艺的因素进行研
究。结果　得到了萃取鼠尾草酸的最佳工艺条件。一级分离的最佳试验工艺条件为: 萃取压力 40 M Pa、萃取温度 55
℃、分离压力 5 M Pa、分离温度 70 ℃; 二级分离的最佳试验工艺条件为: 萃取压力 20 M Pa、萃取温度 75 ℃、分离压
力 15 M Pa、分离温度 80 ℃。结论　超临界CO 2 流体萃取技术可用于迷迭香中抗氧化成分鼠尾草酸的提取。
关键词: 迷迭香; 超临界 CO 2 流体萃取; 鼠尾草酸; 高效液相色谱
中图分类号: R 28412; R 286102　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 02 0150 04
·051· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 2 期 2004 年 2 月
Ξ 收稿日期: 2003204211
作者简介: 黄纪念 (1971—) , 男, 河南省汝南县人, 在读博士生, 研究方向为天然抗氧化剂。E2m ail: h jin ian@ sohu. com3 通讯作者　T el: (010) 62091702　Fax: (010) 62092750