全 文 ：桃仁蛋白梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳的研究
张　波 1 ,谭　峰 1 ,唐金强 2 ,黄开颜 3 ,张克纯 1
( 1. 湖南中医学院 基础部生物化学教研室 ,湖南 长沙　 410007;　 2. 湖南中医学院 基础部中医诊断研究所 ,湖南 长沙　
410007; 3. 湖南中医学院第一附属医院 药剂科药检室 ,湖南 长沙　 410007)
　　电泳作为一种分离蛋白质的手段已是含蛋白中
药材鉴定的常用方法。 聚丙烯酰胺凝胶电泳
( PAGE)是利用丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合形
成的立体网状物作为载体对不同的带电物质进行分
离的电泳方法。梯度 PAGE是 PAGE的改进方法 ,
可用来将不同大小的蛋白质分开 ,配合标准相对分
子质量蛋白可以对待测蛋白质进行相对分子质量测
定。从已有的资料来看 ,用于鉴定的电泳方法有平板
PAGE
[1 ] ,圆盘 PAGE[ 2 ] , SDS-PAGE[3 ] ,高效毛细管
电泳 [4 ] ,同功酶等电聚焦 [5 ] ,醋酸纤维薄膜电泳 [ 6]
等。到目前为止 ,还未见用梯度 PAGE法进行中药
鉴定的报道 ,为此 ,作者对 3种不同来源桃仁的蛋白
质利用梯度 PAGE进行比较分析。
1　实验部分
1. 1　仪器与设备: DYY-Ⅲ -8B电泳仪 , DYY-Ⅲ
28B电泳槽 , HL-1恒流泵 , T H-1梯度混合器 , TGL-
16离心机。
1. 2　实验材料: 1号桃仁取材于湖南中医学院第一附
属医院药房 ,经鉴定来源于蔷薇科植物山桃 Prunus
davidiana ( Carr. ) Franch. 的成熟种子经 制去皮
所得。 2号桃仁采集于湖南安乡 ,为桃 P . persica ( L. )
Batsch的成熟种子去皮所得 , 3号桃仁采集于湖南长
沙 ,为桃 P. persica的成熟种子去皮所得 ,以上样品均
由黄开颜主管药师鉴定。
1. 3　蛋白样品制备: 以 pH7. 4的 TE缓冲液 ( 0. 1
mol /L Tris, 5 mmol /L EDTA)为提取缓冲液 ,将
0. 5 g样品先在研钵中室温粉碎 ,加 10 mL冰冷提
取缓冲液到研钵中 ,与研磨过的样品混匀 ,然后倒入
干净的玻璃匀浆器中插入冰中匀浆 10 min, 12 000
r /min 4℃离心 5 min,取上清 0. 5 mL,加入 0. 4 mL
20%的蔗糖水溶液 , 0. 1 mL溴酚蓝指示剂 ,混匀
后 - 70℃冰箱保存备用。
1. 4　梯度 PAGE:按文献 [7 ]提供的方法制备 4%～
30%的梯度聚丙烯酰胺凝胶 , 250 V预电泳 20 min,
然后每孔上样 25μL, 250 V恒压电泳 23 h。
1. 5　染色与脱色: 用考马斯亮蓝 R-250染色液固
定染色 45 min,脱色液脱色至背景无色为止。
1. 6　成像:梯度凝胶利用 BTS-20-M凝胶分析系
统成像。
2　结果与讨论
2. 1　蛋白质的梯度电泳图谱条带清晰:由图 1可知
梯度 PAGE电泳图谱条带很清楚。梯度 PAGE分离
蛋白质是利用蛋白质分子的大小以及形状差异 ,与
蛋白质所带电荷的多少无关 ,分子越大 ,迁移率越
小。 中药材中蛋白质分子常有部分带电基团脱落或
部分降解 ,但对蛋白质分子的大小和形状影响有限 ,
不会对梯度电泳的结果产生大的影响 ,因此中药材
蛋白质的梯度电泳图谱具有高清晰度的特点。梯度
PAGE分离蛋白要求的电泳时间比较长 ,不能少于
2 000 V· h,要取得好的分离效果 ,一般要 3 000
V· h以上 ,即 300 V恒压电泳 10 h以上。
图 1　桃仁梯度 PAGE图谱
　　 Fig. 1　 Spectra of proteins in Semen
Persicae by gradient PAGE
2. 2　不同来源桃仁通过梯度 PAGE所得电泳带谱存
在差别:由图 1可知 1号桃仁样品与 2号、 3号桃仁样品
只有 3条带迁移率相同 ,它们的带谱存在巨大差异 ,因此
利用梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳可以很容易地将来源于
Prunus davidiana的桃仁与来源于 P . persica的桃仁
区分开来。 2号与 3号桃仁都来源于 P. persica只是取
材地不同 ,它们之间的带谱也存在细微差别 (图 1中箭头
所指 )。为了排除偶然性 ,我们进行了多次重复 ,结果都一
样。这一现象可能是由于两地相隔远 ,长期的生物隔离使
两地桃仁产生变异 ,生成的蛋白质发生细微改变的结果。
·378· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 4期 2003年 4月
收稿日期: 2002-09-23作者简介:张　波 ( 1968- ) ,男 ,湖南安乡县人 ,湖南中医学院讲师 ,硕士 ,主要从事中药的生物化学与分子生物学机理研究。
Tel: ( 0731) 5381150　 E-mai l: zb lhy 2002@ yahoo. com. cn
这一结果暗示梯度 PAGE很可能能够用来区分道地药
材与非道地药材。
由此可见 ,梯度 PAGE以其蛋白质谱带的高清
晰度与高灵敏度可以用于含蛋白中药材的鉴定 ,是
含蛋白中药材鉴定的好方法。
References:
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决明子与混淆品茳芒决明的比较鉴别
朱山寅 1 ,徐洪杰 2 ,徐木根 3
( 1. 浙江省嘉兴市药品检验所 ,浙江 嘉兴　 314001;　 2. 浙江省嘉兴医药集团公司 ,浙江 嘉兴　 314001;　 3. 浙江省桐乡市
第二人民医院 ,浙江 桐乡　 314511)
　　决明子为常用中药 ,具有清热明目 ,润肠通便的功
效 ,来源于豆科植物决明 Cassia obtusi folia L.或小决
明 C . tora L.的干燥成熟种子 [1 ]。目前发现有将豆科植
物茳芒决明 C. sophera L.的干燥成熟种子充当决明子
出售。为了防止混淆误用 ,对两者的性状、显微特征、薄
层色谱及紫外吸收光谱进行了比较研究。
1　仪器与材料
1. 1　仪器: UV -265WF型可见紫外分光光度计 (日本
岛津 )。
1. 2　材料:决明子 Cassia obtusi folia L. 为本所标
本 ;茳芒决明 C. sophera L.在接受中药真伪质量咨
询时获得并经朱山寅鉴定 ;大黄素、大黄酚对照品购
自中国药品生物制品检定所 ;硅胶 H为青岛海洋化
工厂生产 ;其它化学试剂均为分析纯。
2　药材性状
　　决明子:呈四棱方形或短圆柱形 ,两端平行倾斜 ,其
中一端钝圆或平截 ,另一端具一斜尖。长 0. 3～ 0. 6 cm ,
宽 0. 2～ 0. 4 cm。表面棕绿色或暗棕色 ,有光泽 ,背腹面
各有一条突起的棱线 ,两侧各有一条细带状淡黄棕色略
下凹的纹理。质坚硬 ,不易破碎。横断面可见灰白色胚乳 ,
期间有两 S形桔黄色子叶。 气微 ,味微苦。
茳芒决明: 呈扁圆形 ,一端具喙状突起 ,长 0. 3～
0. 5 cm ,宽 0. 3～ 0. 4 cm,厚约 0. 2 cm。表面灰棕色 ,
有椭圆形下凹的纹理 ,颜色明显较周围深。横断面子
叶两片 ,桔黄色 ,平直。气微 ,味淡。
3　显微特征
3. 1　横切面: 决明子:栅状细胞位于表皮下方 ,由一列
栅状细胞组成 ,壁多木化增厚 ,光辉带位于上下部 1 /3
处 ,内含棕色物 ,子叶 2,呈“ S”形折曲并重叠 (图 1-A)。
茳芒决明: 栅状细胞位于表皮下方 ,由一列栅状
细胞组成 ,光辉带在栅状细胞外缘处 ,内胚乳多粘液
化 ,内含棕褐色物。 子叶 2,并列 (图 1-B)。
3. 2　粉末:决明子: 为绿褐色粉末。种皮栅状细胞多
成片 ,无色或淡黄色 ,横断面观细胞 1列 ,长 40～ 55
μm,宽 7～ 11μm,壁较厚 ,胞腔明显。表面观呈多角
形 ,壁微皱缩。种皮支持细胞 1列 ,无色 ,侧面观哑铃
状 ,长 14～ 24μm,表面观类圆形 ,直径 30～ 60μm,
可见环状增厚壁。角质层碎片厚 10～ 20μm,可见多
角形网格样纹理。草酸钙簇晶存在于营养层薄壁细
胞中 ,直径 10～ 25μm。 有少量草酸钙方晶 ,内胚乳
细胞壁多粘液化 ,胞腔内含黄棕色物。子叶碎片可见
(图 2-A)。
·379·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 4期 2003年 4月
收稿日期: 2002-10-16作者简介:朱山寅 ( 1958- ) ,男 ,浙江嘉兴市人 ,副主任中药师。曾从事过药学教学工作 ,现任药检所中药室主任 ,主要从事中药的分析检验及药品质量控制的研究工作 ,在专业杂志上发表科研论文 36篇 ,其中多篇论文获奖。 　 Tel: ( 0573)2073235