全 文 ：·药理与临床·
苦参碱对 H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及对免疫功能的影响
马凌娣, 文世宏, 张　彦, 何於娟, 刘小珊, 康格非, 蒋纪恺Ξ
(重庆医科大学 检验系, 重庆　400016)
摘　要: 目的　研究苦参碱的体内抑瘤效应与荷瘤机体免疫功能的关系, 初步探讨苦参碱抑瘤作用的免疫学机制。
方法　采用M T T 法观察不同剂量苦参碱对荷瘤小鼠外周血淋巴细胞 (PBL ) 增殖能力的影响; 采用小鼠 H 22肝癌
细胞实体瘤模型进行苦参碱的体内抑瘤实验, 测定肿瘤生长抑制率 ( IR ) , 观察荷瘤小鼠免疫器官质量和病理学形
态的改变; EL ISA 法检测小鼠血清中白细胞介素22 ( IL 22) 和白细胞介素212 ( IL 212) 水平。结果　高、低剂量苦参
碱对小鼠 H 22实体瘤生长具有明显抑制作用, 抑瘤率分别为 6017% 和 6215% (P < 0101) ; 体外增殖试验显示, 苦
参碱单独作用时, 对荷瘤小鼠静止 PBL 体外增殖的抑制作用较明显, 但对刀豆蛋白A (ConA ) 活化的荷瘤小鼠
PBL 的体外增殖反应表现出一定的促进作用, 随苦参碱质量浓度的增高, 促进作用随之减弱; 苦参碱治疗后小鼠的
脾脏和胸腺质量减轻, 其中以脾脏变化更为明显 (P < 0101) , 病理切片显示胸腺皮质变薄; 苦参碱不能提高荷瘤小
鼠血清 IL 22 和 IL 212 水平 (P > 0105)。结论　苦参碱在体内具有较强的抗肿瘤作用, 但在体内、体外都表现出一
定的免疫抑制作用, 显示苦参碱的抗肿瘤活性不是通过提高机体的免疫功能来实现的。
关键词: 苦参碱; 肿瘤; 免疫
中图分类号: R 286191　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 12 1374 04
An titum or eff icacy of ma tr ine and its effect on imm une function in H22 tum or-bear ing m ice
M A L ing2di, W EN Sh i2hong, ZHAN G Yan, H E Yu2juan,
L IU X iao2shan, KAN G Ge2fei, J IAN G J i2kai
(D epartm ent of C lin ical L abo rato ry M edicine, Chongqing U niversity of M edical Science, Chongqing 400016, Ch ina)
Abstract: Object　To invest iga te the rela t ion sh ip betw een in v ivo an t itumo r eff icacy of m atrine and
its effect on imm une funct ion in H 22 tumo r2bearing model m ice and discu ss the imm une m echan ism of m a2
t rine in inh ib it ing tumo r grow th. M ethods　M T T assay w as u sed to ob serve the influence of m atrine on
p ro lifera t ion of periphera l b lood lymphocytes (PBL ) st im u la ted by ConA in v itro from H 22 tumo r2bearing
m ice. H 22 tumo r2bearing model m ice w ere app lied to evaluate in v ivo an t itumo r eff icacy of m atrine. T he tu2
mo r grow th inh ib ito ry ra te ( IR ) w as calcu la ted. M u rine serum IL 22 and IL 212 w ere detected by m ean s of
EL ISA assay. Results　M atrine had rem arkab le inh ib ito ry effect on tumo r grow th in H 22 tumo r2bearing
model m ice. T he IR w ere 60. 7% and 62. 5% (P < 0101) in the group s trea ted w ith low 2 and h igh2do se of
m atrine, respect ively. M atrine show ed an increasingly inh ib ito ry effect on in v itro p ro lifera t ion of m u rine
PBL w ith an elevat ion of m atrine do sage and a lessen S I sco res compared w ith that of con tro l panel w hen it
w as p rescribed in single, w h ile a com b ined effect on p ro lifera t ion of m u rine PBL act ivated by ConA ob2
served in M T T assay, and a decreasing inh ib ito ry effect w as also found along w ith the elevat ion of m atrine
do sage. T he w eigh ts of bo th sp leen and thym u s of H 22 tumo r2bearing model m ice trea ted w ith m atrine be2
cam e less than that of con tro l panel, and sp leen decreased mo re than thym u s gland (P < 0101). Paraff in
slice H and E sta in ing revealed thym u s co rtex becam e th inner. T he increasing of serum IL 22 and IL 212 had
no t appeared in H 22 tumo r2bearing model m ice trea ted w ith m atrine (P > 0105). Conclusion　M atrine has
m arked in v ivo an t itumo r effect, bu t it can no t imp rove the imm une funct ion of H 22 tumo r2bearing m ice
bo th in v ivo and in v itro. T h is inferred that imp roving imm une funct ion m ay no t be the m ain m echan ism
fo r m atrine to exert its an t itumo r effect.
Key words: m atrine; tumo r; imm un ity
·4731· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 12 期 2004 年 12 月
收稿日期: 2004204218
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (30171150)
作者简介: 马凌娣 (1973—) , 女, 山东人, 助教, 在读博士, 主要从事中药抗肿瘤的分子学机制和肿瘤免疫学方面的基础研究。
T el: (023) 68485216　E2m ail: lingdim a@ho tm ail. com
　　近年来, 苦参及其有效成分苦参碱的抗肿瘤作
用正逐渐受到人们的关注。研究表明, 苦参碱能有效
抑制体外培养的人肝癌细胞株 H epG2 的增殖, 且
抑制作用有时间和剂量依赖性[1 ]; 诱导人白血病
K562 细胞向正常形态分化, 明显抑制肿瘤细胞端
粒酶活性的表达[2, 3 ]。此外, 苦参碱可诱导肿瘤细胞
发生凋亡, 明显抑制肿瘤细胞与内皮细胞间的黏附,
阻止肿瘤的转移。笔者采用动物试验对苦参碱的抗
癌作用进行了研究, 发现苦参碱可以明显抑制小鼠
H 22移植瘤生长, 抑瘤率达 60% 以上, 并进一步观察
苦参碱对荷瘤小鼠免疫功能的影响, 以期从免疫学
角度探讨苦参碱的抗肿瘤作用机制。
1　材料与方法
111　药物: 苦参碱, 纯度为 99% , 由日本大正制药
公司提供, 以无菌生理盐水溶解, 配成 10 m gömL
储备液, 0122 Λm 抽滤除菌后 4 ℃ 保存。环磷酰胺,
上海华联制药有限公司生产, 每支 200 m g, 批号
000211, 以无菌生理盐水配成 10 m gömL。
112　实验动物与细胞株: 清洁级BALB öC 小鼠, 体
重 18～ 22 g, 雌雄兼用, 重庆医科大学实验动物中
心提供。BALB öC 小鼠 H 22腹水瘤细胞由重庆医科
大学基础医学院病理生理教研室惠赠。
113　试剂与仪器: R PM I 1640 培养基 (Gibco 产
品) , 胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司
产品。小鼠淋巴细胞分离液: 天津灏阳生物制品科技
有限公司出品。刀豆蛋白A (ConA ) , 美国 Sigm a 公
司产品, 以无菌 PBS 配成 10 m gömL。M T T [ 32(4,
5) 2双甲基222噻唑2(2, 5) 2二甲基溴化四氢唑盐 ]为
美国 Sigm a 公司产品, 以 pH 7. 2 的无菌 PBS 配成
5 m gömL , 0122 Λm 抽滤除菌, 避光 4 ℃ 保存。小鼠
IL 22 和 IL 212 EL ISA 试剂盒购自广州晶美生物工
程有限公司。H itach i—600 透射电子显微镜; O lym 2
pu s 光学显微镜;M OD EL 550 型酶联免疫吸附检测
仪, 美国B IO 2RAD。
114　体内试验
11411　荷瘤小鼠模型的建立: 无菌条件下抽取肝癌
小鼠腹水中的 H 22细胞, 用无菌 PBS 将收集到的肿
瘤细胞浓度调整为 1×106ömL , 于BALB öC 小鼠左
下腹部行无菌皮下接种, 每只小鼠接种 012 mL 细
胞悬液, 细胞总数为 2×105。
11412　实验动物分组及处理: 小鼠接种后 24 h 称
重分组, 随机分为苦参碱高、低剂量 (100、50 m gö
kg) 组, 环磷酰胺 (CTX, 20 m gökg) 组为阳性对照
组, 另设阴性对照组, 给以等量生理盐水 (N S)。各
组均 ip 给药, 每只 012 mL , 每日 1 次, 连续 15 d。
11413　苦参碱对荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用: 停药后
次日处死小鼠, 剥瘤称质量, 计算肿瘤生长抑制率
(抑瘤率)。
抑瘤率= (对照组平均瘤质量- 治疗组平均瘤质量) ö对
照组平均瘤质量×100%
11414　苦参碱对荷瘤小鼠免疫器官的影响: 各组小
鼠停药后次日处死, 完整取出胸腺和脾脏后称质量,
计算胸腺指数和脾脏指数。胸腺、脾脏病理学切片行
H E 染色观察。
11415　苦参碱对荷瘤小鼠血清 IL 22 和 IL 212 水平
的影响: 各组小鼠停药后次日摘眼球放血, 静置后
( 3 000 röm in 离心 10 m in) , 得到血清。用 EL ISA
法检测荷瘤小鼠血清中 IL 22 和 IL 212 水平。测定方
法详见试剂盒说明书。
115　苦参碱对荷瘤小鼠外周血淋巴细胞 (PBL ) 体
外增殖活性的影响
11511　荷瘤小鼠 PBL 的分离: 将荷瘤小鼠颈椎脱
臼处死, 无菌取脾, 在盛有无菌 H ank s 液的平皿中
用玻璃小瓶轻轻捻碎脾组织, 以 250 目不锈钢筛网
滤过, 收集得到脾细胞悬液。用小鼠淋巴细胞分离液
按常规方法操作, 分离得到小鼠 PBL 悬液。台盼蓝
排除计数法计数活细胞数在 95% 以上, 以含 10%
胎牛血清的 R PM I 1640 培养液配成 1×106ömL 细
胞悬液。
11512　淋巴细胞转化试验 (M T T 法) : 试验组为含
和不含 5 ΛgömL ConA 的小鼠 PBL 悬液, 加入苦参
碱溶液, 使其终质量浓度分别为 100、200、500 Λgö
mL , 阳性对照组仅含 5 ΛgömL ConA , 空白对照组
为加入等体积 PBS 溶液的 PBL 悬液。将上述细胞
悬液分别加入到 96 孔细胞培养板中, 每孔 200 ΛL ,
各组均设 6 个复孔。96 孔培养板置 37 ℃、5% CO 2
孵箱中培养 68 h 后, 离心弃上清液 150 ΛL , 再加入
R PM I 1640 液 150 ΛL 和M T T 溶液 (5 m gömL )
20 ΛL , 继续培养 4 h。培养结束后每孔加入 150 ΛL
二甲基亚砜, 振荡 2 m in 溶解沉淀, 混匀后以酶标仪
于 570 nm 波长处读取各管吸光度 (A 570) 值。计算
刺激指数 (S I)。
S I= (实验孔 A 570均值öConA 孔 A 570均值)×100%
116 　统计学处理: 数据均以 x ± s 表示, 使用
SPSS1010 统计学软件进行单向方差分析 (one2w ay
ANOVA ) , 并进行组间比较。
2　结果
211　苦参碱对荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用: 不同剂量
·5731·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 12 期 2004 年 12 月
苦参碱对 BALB öC 小鼠 H 22实体瘤均有明显抑制
作用。100、50 m gökg 苦参碱组及 CTX 组抑制率
(x ±s, n= 15) 分别为 6017%、6215% 和 7816% ,
与对照组比较差异显著 (P < 0101) , 苦参碱高、低剂
量组间差异不显著 (P > 0105)。
212　苦参碱对荷瘤小鼠免疫器官的影响: 结果见表
1。与对照组相比, 低剂量苦参碱组小鼠的胸腺指数
无明显改变 (P > 0105) , 脾指数明显降低 ( P <
0101) ; 高剂量苦参碱组小鼠的胸腺指数与脾指数均
低于对照组 (P < 0105) , 以脾指数的降低更为明显
(P < 0101) , 显示苦参碱对小鼠的胸腺、脾脏有一定
的抑制作用, 受抑程度以脾脏更明显。病理形态学观
察: 苦参碱处理组小鼠脾脏体积缩小, 质量减轻, H E
染色见白髓结构轻度破坏, 有少量坏死淋巴细胞, 红
髓淋巴细胞减少, 脾窦扩张充血, 巨核细胞散在分
布; 胸腺小叶结构清楚, 皮髓质界限清楚, 网状上皮
细胞及纤维细胞增生, 血窦扩张。CTX 组小鼠脾脏
和胸腺明显萎缩, 脾窦扩张充血, 大量淋巴细胞坏
死, 纤维组织增生; 胸腺皮质变薄, 有的分叶不清, 呈
灰白色, 皮髓质界限欠清。
表 1　苦参碱对 H22荷瘤小鼠免疫器官
的影响 (x±s, n= 15)
Table 1　Effect of matr ine on immune organ s of H22
tumor-bear ing model m ice (x±s, n= 15)
组　别
剂　量ö(m g·kg- 1) 胸腺指数ö(m g·kg- 1) 脾指数ö(m g·kg- 1)
苦参碱 　　　50 　1117±01073 　6175±11753 3
100 0197±01333 6190±11933 3
CTX 20 0173±01503 3 6137±21193 3
对照 　　　- 1111±0162 10115±2193
　　与对照组比较: 3 P < 0105　3 3 P < 0101
　　3 P < 0105　3 3 P < 0101 vs con tro l group
213　苦参碱对荷瘤小鼠 IL 22 和 IL 212 水平的影
响: 结果见表 2。苦参碱治疗后, 小鼠血清 IL 22 和
IL 212 的水平无明显改变 (P > 0105) , 苦参碱低剂
量组小鼠的 IL 22 水平虽稍有升高, 但与对照组相比
差异无显著性 (P > 0105) , 提示苦参碱不能提高荷
瘤小鼠血清 IL 22 和 IL 212 水平。
214　苦参碱对荷瘤小鼠 PBL 体外增殖活性的影
响: 结果见表 3。苦参碱单独作用时, 可明显抑制荷
瘤小鼠静止 PBL 的体外增殖, 苦参碱各组 S I 均小
于空白对照组 (P < 0101) , 但对 ConA 活化了的小
鼠 PBL 增殖表现出一定的协同刺激作用, 除苦参碱
500 ΛgömL 组外, 两者共同作用的 S I 较单用 ConA
或单用苦参碱者都高, 但刺激作用随苦参碱质量浓
表 2　苦参碱对 H22荷瘤小鼠 IL -2 和 IL -12
水平的影响 (x±s, n= 15)
Table 2　Effect of matr ine on serum IL -2 and IL -12 levels
in H22 tumor-bear ing model m ice (x±s, n= 15)
组　别
剂　量ö(m g·kg- 1) IL 22ö(pg·mL - 1) IL 212ö(pg·mL - 1)
苦参碱 　　　50 　18814±4212 　8718±3014
100 18019±3914 8514±3512
CTX 20 18317±3515 8815±2212
对照 　　　- 18112±3911 9010±2614
表 3　苦参碱对 H22荷瘤小鼠 PBL 体外
增殖活性的影响 (x±s, n= 6)
Table 3　Effect of matr ine on PBL prol iferation in vitro
of H22 tumor-bear ing model m ice (x±s, n= 6)
组　别 质量浓度ö(Λg·mL - 1) A 570 S Iö% 　
苦参碱 100 0140±0108 　563 3
200 0136±0107 503 3
500 0125±0105 353 3
空白对照 - 0145±0112 64
苦参碱+ ConA 100 1172±0120 2423 3 △△
200 1144±0112 2003 3 △△
500 0165±0110 913 3
ConA - 0171±0130 1003 3
　　与空白对照组比较: 3 3 P < 0101
　　与 ConA 组比较: △△P < 0101
　　3 3 P < 0101 vs con tro l group; 　△△P < 0101 vs ConA group
度的增加而降低。
3　讨论
　　小鼠 H 22肝癌是抗肿瘤药物研究中常用的动物
移植性肿瘤模型。本实验利用此模型观察了苦参碱
的体内抑瘤作用。研究发现苦参碱对小鼠 H 22实体
瘤的生长有明显的抑制作用, 抑瘤率达 60% 以上,
显示出苦参碱作为一种抗肿瘤药物潜在的临床应用
价值。
大量的研究资料表明, 肿瘤的发生、发展和转移
都与机体的免疫功能密切相关。免疫功能受损, 导致
机体易患肿瘤, 而当宿主免疫功能恢复和提高时, 就
能有效的排斥肿瘤, 控制肿瘤的生长和转移。研究发
现, 肿瘤患者都有不同程度的免疫功能低下状态, 如
N K 细胞活性、CD 4öCD 8比值、IL 22 含量下降等, 这
也是导致肿瘤无限制增长和免疫逃避的一个重要因
素。因此, 正确评价荷瘤机体的免疫功能是研究抗肿
瘤药物作用机制的重要前提。T 淋巴细胞转化实验
是检测淋巴细胞增殖活性的一种有效的方法, 常用
于评价药物对细胞免疫功能的影响。本实验选用
ConA 为刺激物, 刺激 T 细胞发生转化, 结果显示,
苦参碱单独应用时对小鼠 PBL 的体外生长有较明
显的抑制作用, 对 ConA 所致的 T 淋巴细胞活化增
·6731· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 12 期 2004 年 12 月
殖有一定的刺激作用, 但随着苦参碱质量浓度的增
高, 这种协同刺激作用又随之下降。此结果提示苦参
碱不能促进静止的小鼠 PBL 的增殖反应, 对 ConA
活化了的小鼠脾细胞增殖, 高质量浓度的苦参碱也
有一定的抑制作用, 显示了其具有免疫抑制剂的特
征。苦参碱对静止和活化的小鼠 PBL 体外增殖活性
的不同影响, 也可能与机体的免疫状态有关, 本实验
中所制备的 PBL 来自荷瘤小鼠, 受肿瘤影响, 小鼠
PBL 对刺激原的反应性与正常情况可能有所不同。
苦参碱对荷瘤机体免疫效应细胞活性的影响和具体
的作用机制还有待于深入研究。
本研究中, 苦参碱作用后小鼠的胸腺外观与对
照组几乎无差异, 胸腺指数无明显改变, 而脾指数明
显低于对照组, 以高剂量苦参碱作用更甚, 表明苦参
碱在一定程度上抑制了荷瘤小鼠的免疫功能, 其中
对脾脏的抑制作用强于胸腺。病理形态学观察也证
明了这一点。
在机体的抗肿瘤免疫反应中, IL 22 和 IL 212 是
发生细胞免疫应答所必需的两种细胞因子, 通过多
种途径发挥免疫调节作用。本研究中, 苦参碱治疗后
小鼠血清 IL 22 和 IL 212 水平没有增高, 提示苦参碱
不能增强荷瘤小鼠的抗肿瘤细胞免疫应答反应。但
也不能排除肿瘤发生时, 机体所产生的免疫抑制因
子的作用。
本研究发现, 苦参碱对肿瘤所致的小鼠免疫功
能低下状态没有明显改善作用, 同时体内、体外实验
都显示其有一定的免疫抑制效应, 表明苦参碱的抑
瘤活性不是通过提高机体自身的免疫机能来实现
的, 还存在其他的作用机制, 其确切的抗肿瘤作用尚
待深入研究。
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W e ight-reduction and fat-decrease effects in rats of extracts
from f ive k inds of Ch inese herbs
ZHAN G Chong2ben, ZHAN G X iao2lan, SHAN G Ke2gang, D EN G Hong2ku i, D IN G M ing2x iao Ξ
(D epartm ent of Cell B io logy and Genetics, Co llege of L ife Sciences, Pek ing U niversity, Beijing 100871, Ch ina)
　　Abstract: Object　To evaluate the effects of the ex tracts from five k inds of Ch inese herb s (5ECH ) on
w eigh t2reduct ion and fa t2decrease in ra ts, as w ell as their m echan ism s. M ethods　R ats w ere fed by h igh2
calo rie food and adm in ist ra ted w ith tw o differen t do ses of 5ECH as experim en ta l group s, w ith Q um ei and
Xuezh ikang as po sit ive con tro l group s, and w ith carboxym ethyl cellu lo se sodium as negat ive con tro l group
by ig adm in ist ra t ion w ith relevan t drugs in each group s. Concen tra t ion s of t rig lycerides (T G) and to ta l
cho lestero l (TC) in the b lood w ere determ ined by a H ITA CH I—7170A au to2b iochem ical analyzer. T he ac2
t ivit ies of fa t ty acid syn thase (FA S) and acyl2coenzym e A syn thetase (A CS) w ere determ ined by spec2
t ropho tom etry and iso top ic2labeling, respect ively. T he item s of body w eigh t increase (BW I) , body fa t
(BF) , and food in take (F I) w ere determ ined by regu lar w eigh ing. Results　5ECH reduces BW I, BF, T G,
TC, and F I in a do se2dependen t m anner inh ib its FA S act ivity, and enhances A CS act ivity in a do se2depen2
den t m anner. T he BW I is h igh ly co rrela ted to the F I; the T G and TC levels in the b lood are h igh ly co rre2
la ted to the act ivit ies of FA S and A CS, and the BF is h igh ly co rrela ted to bo th the F I and the tw o
enzym es’act ivit ies. Conclusion 　T he 5ECH in th is research has sign if ican t w eigh t2reduct ion and fa t2
decerase effects on ra ts. T he effects are associa ted w ith appet ite supp ression, FA S inh ib it ion, and A CS
·7731·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 12 期 2004 年 12 月
Ξ 收稿日期: 2004204222
基金项目: 国家高科技研究发展计划 (863)项目资助课题 (2003AA 2Z3432)
作者简介: 张崇本 (1963—) , 男, 辽宁省人, 讲师, 理学博士, 研究方向为细胞遗传学。
T el: (010) 62751858 62757430　E2m ail: zhangcb@pku. edu. cn