全 文 ：大青叶抗内毒素活性部位筛选
方建国,施春阳,汤　杰, 王文清,刘云海

(华中科技大学同济医学院附属同济医院 药学部, 湖北 武汉　430030)
摘　要: 目的　评价和比较大青叶 5 个化学部位的抗内毒素作用。方法　采用动态浊度法测定细菌内毒素浓度,观
察大青叶不同化学部位对放线菌素 D 敏化小鼠内毒素致死攻击的保护作用。并以内毒素制备家兔发热模型,测定
其肛温变化。结果　大青叶Ⅳ部位能直接中和降解内毒素, 显著降低内毒素的致热性和致死性。结论　大青叶Ⅳ部
位具有显著的体内外抗内毒素活性。
关键词: 大青叶; 抗内毒素; 活性部位
中图分类号: R282. 71; R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2004) 01 0060 03
Screening of active fraction of antiendotoxin from Folium Isatidis
FANG Jian-guo, SHI Chun-yang , TANG Jie, WANG Wen-qing , LIU Yun-hai
( Depart ment of Pharmacy , Tongji Hospital A ffiliated to T ong ji M edical Colleg e, Huazhong U niver sity
of Science and T echno lo gy , Wuhan 430030, China )
Abstract: Object　T o evaluate and compare the ant iendo toxin act ivity of f ive dif ferent f ract ions isolat-
ed from Folium I satidis. Methods　With kinet ic turbidimetric assay, the bacterial endo to xin content of the
test ing samples w as determ ined. The protect ion for the m ice sensit ized by act inomycin D from endotox in-
induced lethality w as invest igated. Changes of the r ectal temper ature w er e observ ed in feverous rabbits in-
duced by endotox in. Results　T he fr act ion Ⅳ f rom Folium I satid is can neutralise endotoxin direct ly, and
inhibit pyr ogenicity and lethality induced by endotox in. Conclusion　The fract ion Ⅳ f rom Folium I satidi s
show s to have remarkable ant iendotox in act ivity in v itro and in vivo.
Key words : Folium I satidi s; ant iendotox in; act ive f ract ion
　　大青叶 Fol ium I satidis 系十字花科植物菘蓝
I satis indigotica Fo rt . 的干燥叶, 是常用的清热解
毒类中药,临床上被广泛用于治疗流感、腮腺炎、肝
炎等。现代医学关于清热解毒功效的阐释目前主要
集中于以下两点: 一是抗细菌内毒素作用, 二是抗病
原微生物作用,尤其是抗内毒素活性为该类中药的
重要属性[ 1]。本实验采用体外细菌内毒素定量检查
法和小鼠体内抗内毒素致死攻击保护实验, 综合比
较大青叶各化学部位抗内毒素作用强度, 从而筛选
其活性部位; 在此基础上,结合内毒素致家兔发热效
应进一步验证、评价活性部位的抗内毒素作用。
1　材料
1. 1　药材及其化学部位制备: 大青叶采自安徽亳
州,经本院中药研究室方建国副主任药师鉴定为十
字花科植物菘蓝 I . ind igotica For t . 的干燥叶。药
材粉碎成粗粉, 95% 乙醇渗漉法提取, 减压浓缩至
无醇味,拌以硅藻土采用系统溶剂分离法,依次以石
油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇、水加热回流提取, 回
收溶剂得到 5个不同极性的化学部位浸膏 (按原生
药量计, 得率分别为 1. 5%, 1. 1% , 0. 7%, 1. 7% ,
1. 0% ,编以代码简称大青叶Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ, Ⅳ,Ⅴ部位)。
1. 2　动物: 昆明种小鼠,雄性, 体重 18～22 g ;日本
大耳白兔, 雌雄不拘, 体重 2. 0～2. 5 kg , 由华中科
技大学同济医学院实验动物中心提供。
1. 3　试剂: 细菌内毒素工作标准品 ( 20 EU /支,
010203) ,动态比浊法鲎试剂 ( KTA 鲎试剂, 灵敏度
0. 06 EU / mL, 001123) ,细菌内毒素检查用水 ( BET
水, 5 mL/支, 001222) , 稀释液 (Ⅱ) ( 4 mL/支,
010430) , 以上均购于湛江安度斯生物有限公司;放线
菌素 D ( ACTD, 0. 2 mg/支, 上海新亚药业有限公
司, 000402) ; 脂多糖 ( LPS, 5 mg/支, Sigma 公司,
69H4022) ; 地塞米松片 ( 0. 75 mg/片) , 天津柏海药
·60· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 1 期 2004年 1月

收稿日期: 2003-06-08基金项目:国家自然科学基金资助项目( 39800193)作者简介:方建国( 1965—) ,男,河南信阳人,副主任药师,博士,主要从事中药药效的物质基础与标准化研究;曾主持参加国家自然科学基金资助项目和省部级课题 8 项,发表学术论文 20 余篇,编写学术著作 2部。
T el: ( 027) 83624090, 83649095　E-mail: f jg3560@ sina. com
业有限责任公司, 011022) ; 其余试剂均为分析纯。
1. 4　仪器: EDS—98 细菌内毒素测定仪 (北京金山
川科技发展有限公司) ; RE—10E—100 型旋转蒸发
仪 (日本 SIBAT A 公司) ; XW—80A 型旋涡混合器
(上海医科大学仪器厂)。
2　方法与结果
2. 1　动态浊度法测定大青叶不同化学部位的体外
抗内毒素作用
2. 1. 1　动态浊度法原理:微量细菌内毒素可以激活
鲎试剂中的凝固酶原成为凝固酶, 进而切断凝固蛋
白原中特定位置的精氨酸肽键, 形成凝固蛋白产生
凝胶,造成浊度 (吸光度) 的变化。这一反应中存在
3 个变量: 吸光度 (浊度)、反应时间、内毒素浓度,
当固定吸光度的变化率为某一数值 (即临界值)
时,达到此临界值所需时间 ( T a,临界时间) 的对数
与内毒素浓度 ( C) 的对数呈线性关系,从而可以进
行定量测定。
2. 1. 2　实验准备: 参照细菌内毒素检查法[ 2] ,实验
所用器皿 (反应试管、毛细吸管等) 经高温严格处
理以除去可能存在的外源性内毒素。
2. 1. 3　供试药液的制备:取大青叶各化学部位浸膏
适量,加入 1% 聚山梨酯 80 增溶, 以无热原水定容
至 100 mL,使含生药量为 0. 4 g/ mL,用安瓿分装、
封口,流通蒸汽灭菌 30 m in 备用。
2. 1. 4　标准曲线的绘制:取细菌内毒素工作标准品
一支 ( 20 EU ) , 精密加入 1 mL BET 水, 混旋 15
min, 使浓度为 20. 0 EU / mL; 并依次稀释成 5. 0,
1. 0, 0. 2 EU / mL 的内毒素标准溶液。分别吸取 0. 1
mL 于反应试管中,加入 0. 1 mL KT A 鲎试剂, 混
合均匀,迅速插入内毒素仪检测孔内测定临界时间。
每一浓度平行作 3管,同时以 BET 水作阴性对照。
当阴性对照结果不超过
1(标准曲线最低浓度) 时,
将实验数据进行线性回归分析, 得标准曲线为:
logT a= 2. 711 14- 0. 301 49 logC, r= - 0. 991 7。结
果表明, 内毒素浓度在 0. 1～10. 0 EU/ mL 与临界
时间之间呈线性关系。
2. 1. 5　大青叶各化学部位体外抗内毒素活性的测
定:分别取 2. 1. 3 项制备药液各 0. 1 mL, 并以 1%
聚山梨酯 80无菌水溶液为空白对照,均采用稀释液
(Ⅱ) 作 40倍稀释; 取稀释后各组溶液 0. 4 mL,加
入 0. 1 mL 内毒素标准溶液 ( 20 EU/ mL) 于 37℃
下孵育 1 h,使药液与内毒素充分作用,吸取孵育后
的混合液 0. 1 mL 于反应试管中, 加入 0. 1 mL
KTA 鲎试剂, 迅速插入内毒素仪检测孔内测定临
界时间,每组供试品平行作 6 管, 各药物组测定结
果与空白对照组作 t 检验比较,并以临界时间均值
参照标准曲线计算内毒素经作用后的浓度及相应的
降解率,结果见表 1。
内毒素降解率= (空白对照组内毒素浓度- 药物组内毒
素浓度) /空白对照组内毒素浓度×100%
表 1　大青叶 5 个不同化学部位体外抗内毒素作用 ( n= 6)
Table 1　Antiendotoxin eff ect of five dif ferent fractions
f rom Folium Isatidis in vitro ( n= 6)
组　别 临界时间均值/ s
孵育后内毒素浓
度/ ( EU·mL- 1)
内毒素降解
率/ %
空白对照 　427±59 1. 86 -
Ⅰ部位 450±46 1. 56 16
Ⅱ部位 535±78* 0. 88 53
Ⅲ部位 592±65* * 0. 63 66
Ⅳ部位 649±48* * 0. 46 75
Ⅴ部位 504±45* 1. 07 42
乙醇总提取物 483±34 1. 24 33
　　与空白对照组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
　　* P < 0. 05　* * P < 0. 01 v s b lank cont rol group
　　由表 1可见,与空白对照组比较,内毒素经各组
药液 (终浓度为 8 mg / mL) 孵育作用后发生了不同
程度地中和降解, 其中大青叶Ⅳ部位对于内毒素的
降解率最大, 显示其体外抗内毒素活性最强; Ⅱ部
位、Ⅲ部位活性次之。
2. 2　对 A CT D 敏化小鼠内毒素致死攻击的影响:
昆明种小鼠 96 只, 按表 2 随机分成 8组, 每组 12
只。药物组按 50 g / kg 剂量 ig 给药, 2 h 后重复 1
次;阴性对照组给予相同体积生理盐水;阳性对照组
按 10 mg / kg ig 给予地塞米松;各组给药 1 h 后按 2
mg/ kg 剂量 ip ACT D致敏; 2 h 后按 1 mg / kg 剂量
尾 iv LPS, 3 d 内观察动物死亡情况, 计算动物死亡
率,并与阴性对照组比较,作
2检验。结果见表 2。
表 2　大青叶不同化学部位对 ACTD 敏化
小鼠内毒素致死攻击的影响
Table 2　Ef fect of dif f erent f ractions f rom Folium
Isatidis on endotoxin-induced lethality
in mice sensitized by ACTD
组　别 动物/只 死亡数/只 死亡率/ %
对照 　　　12 11 　　92
Ⅰ部位 12 11 92
Ⅱ部位 12 10 83
Ⅲ部位 12 7 58
Ⅳ部位 12 4 33*
Ⅴ部位 12 6 50
乙醇总提取物 12 8 67
地塞米松 12 4 33*
　　与对照组比较: * P < 0. 05
　　* P < 0. 05 v s con tr ol gr ou p
　　由表 2可见,相对于对照组,大青叶Ⅳ部位能够
·61·中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 1 期 2004年 1月
显著降低 ACT D 敏化小鼠的死亡率,有效地保护小
鼠免受内毒素的致死攻击,结果表明Ⅳ部位在动物
体内也具有拮抗内毒素毒害生物效应的活性。
2. 3　对内毒素诱导家兔发热的拮抗作用: 选择健康
家兔,每日测肛温 2次,连续 3 d,使之逐步适应;体
温应在 38. 0 ℃～39. 6 ℃, 且体温波动不超过 0. 3
℃。取体温合格家兔 18 只, 随机分成 3 组, 每组 6
只。药物组以 10 g / kg ig 大青叶Ⅳ部位,阴性对照组
ig 生理盐水, 阳性对照组以 200 mg/ kg ig 阿司匹
林。除阳性对照组外,其余各组每日给药 2 次, 连续
2 d。第 3天所有组间隔 3 h 连续给药两次,末次给
药后 1 h,测定家兔基础体温,共 3次, 取其均值。2 h
后,耳缘静脉 iv LPS 200 ng / kg, 于内毒素攻击后
0. 5, 1, 2, 3, 4 h 测定家兔体温,观察其变化情况,并
与基础体温相比较, 计算出最大温差 (
T )及发热
抑制百分率。结果见表 3。
发热抑制百分率= (阴性对照组平均最大体温- 药物组
平均最大体温) /阴性对照组平均最大体温×100%
表 3　大青叶Ⅳ部位对内毒素所致家兔
发热的抑制作用 ( x±s, n= 6)
Table 3　Inhibition of fraction Ⅳ f rom Folium
Isatidis on endotoxin-induced pyrogen
in rabbits ( x±s, n= 6)
组　别
T /℃ 发热抑制百分率/ %
对照 　　　1. 18±0. 23 -
Ⅳ部位 0. 68±0. 19* * 42. 4
阿司匹林 0. 78±0. 22* 33. 9
　　与对照组比较: * P< 0. 05　* * P < 0. 01
　　* P < 0. 05　* * P< 0. 01 v s cont rol group
　　结果表明大青叶Ⅳ部位对内毒素引起的发热效
应具有明显的拮抗作用, 其效果与阿司匹林 ( 200
mg / kg) 比较,差异无显著性 ( P> 0. 05)。
3　讨论
　　内毒素具有十分广泛的生物活性,临床上许多
疾病都与内毒素直接相关, 如休克、毒血症、成人呼
吸窘迫综合症、多器官功能衰竭等,因而抗内毒素药
物的开发研制逐渐成为人们关注的热点。现在, 众多
的实验方法被用于研究药物的抗内毒素作用——体
外研究以细菌内毒素检查法 (鲎试验法) 最为常
用, EDS—98 细菌内毒素测定系统能够通过多种方
法 (动态浊度法、动态比色法) 定量测定供试品中
内毒素的含量, 灵敏简便,能够客观评价和比较中药
的体外抗内毒素作用强度, 为中药相关领域的研究
提供了新的工具。基于细菌内毒素与鲎试剂的反应
是由于一系列酶促放大作用而产生的, 其干扰因素
众多,主要包括供试品的酸碱度、金属离子浓度、非
特异性鲎试剂激活物、对仪器检测光源 ( 405 nm )
的吸收干扰等[ 3]。因此本实验采用动态浊度法消除
供试品颜色的干扰,并采用稀释液 (Ⅱ) 稀释供试
品以调节其 pH 值在规定范围内 ( pH6～8) ; 同时严
格的操作程序和技巧也是必要的[ 3, 4]。
体内动物保护试验观察药物对内毒素所致动物
休克死亡的影响, 业已成为检测药物拮抗内毒素致
死效应的可靠方法。实验中采用 ACTD 损伤机体免
疫机制及清除内毒素的主要场所——肝脏,导致内
毒素灭活减少, 因而能显著增强小鼠对内毒素攻击
的敏感性[ 4]。同时, 以内毒素诱导家兔发热, 能够有
效地观察药物对内毒素致热性的抑制作用。显然, 结
合体内外实验筛选大青叶中的抗内毒素活性部位,
其结论相互印证,互为补充,值得信赖。
本实验结果表明大青叶Ⅳ部位具有显著的体内
外抗内毒素活性, 可以确认为大青叶主要的抗内毒
素活性部位。其药理活性强度与之所含的有机酸类、
氨基酸类等化学成分密切相关[ 5]。这些活性成分通
过直接灭活细菌内毒素、抑制其毒性生物效应或者
增强机体免疫机能抵御毒素侵袭从而发挥持久且有
益的抗内毒素作用,但其具体分子作用机制有待进
一步研究。
References:
[ 1]　Shen Y J. P harmacology of Chinese Mate ria Medica (中药药
理学) [ M ] . Beijing: People s Medical Pub lish ing House,
2000.
[ 2]　Ch P (中国药典) [ S] . 2000 ed. Vol Ⅱ.
[ 3]　Lao H Y, Luo Y F, Lin Q X. App licat ion of the kinet ic tur-
bidim et ric limulus test in the endotoxin as say of Shengmai In-
ject ion [ J] . A cad J Guangdong Col l P harm (广东药学院学
报) , 2002, 18( 1) : 21-23.
[ 4]　Deng W L , Xu J H, Wang W L, et al . S tu dies on ant iendo-
toxin ef fect of Reduping : A novel endotoxin antag on ist [ J] .
P harmacol Cl in Chin M ater Med (中药药理与临床) , 1995,
11( 2) : 16-19.
[ 5]　Wu X Y, Liu Y H , Sheng W Y, et al . Chemical const ituents
of Isati s ind ig oti ca [ J ] . P lanta M ed, 1997, 63: 55-57.
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