全 文 ：中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月· 859·
·药材与资源·
青海省冬虫夏草的遗传变异及亲缘关系的形态性状和ISSR分析
梁洪卉1，程舟”，杨晓伶1，李珊1，周铜水2，张文驹。，陈家宽2
(1．同济大学生命科学与技术学院，上海200092I3．复旦大学生命科学学院生物多样性科学研究所
生物多样性与生态工程教育部重点实验室，上海200433)
摘要：目的探讨青海省不同地区冬虫夏草的鉴定方法，并评价其遗传变异、亲缘关系及地域分布。方法利用
形态性状和ISSR标记分析青海省11个县的冬虫夏草样品。结果青海省不同地区的冬虫夏草无论是形态性状还
是ISSR多态性都存在很大的遗传变异。根据形态性状数据，青海省的冬虫夏草大致分成3个组，即分别产于环青
海湖地区、青海中东部和南部，但仅基于形态性状来鉴定特定的冬虫夏草十分费力且不可靠。根据ISSR指纹图谱
能够鉴定不同产地的冬虫夏草，而且ISSR分析表明青海省的冬虫夏草可分成产于环青海湖地区和其他地区两大
类，其他地区一大类又可分成青海省南部、中部和东部产区3个平行分支。结论青海省的冬虫夏草在分布上表现
出明显的地域性。ISSR分子标记对于冬虫夏草的鉴定和亲缘关系检测是非常有效的手段，与形态性状分布相结合
效果更佳。
关键词：青海省，冬虫夏草；ISSR；亲缘关系；地域分布
中图分类号：R282．02 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)12—1859—06
GeneticvariationandaiffinityofCordycepssinensisinQinghaiProvincebasedonanalysis
ofmorphologiccharactersandinter—simplesequencerep atmarkers
LIANGHong—huil，CHENGZhoul，YANGXiao—ling‘，LIShanl，
ZHOUTong—shuil，ZHANGWenJu2，CHENJia—kuan2
(1．SchoolofLifeScienceandTechnology，TongjiUnivers ty·Shanghai200092，China；2-ChineseMinistry
ofEducationKeyLaboratoryofBiodiversityandEcologicalEngineering，InstituteofBiodiversityScience，
SchoolofLifeScience．FudanUniversity，Shanghai200433，China)
Abstract：ObjectiveToidentifyCordycepssinensisfromdifferenthabitatsinQinghaiProvinceof
Chinaandestimatetheirgeneticvariation．affinity，andregionaldistribution．MethodsMorp logical
charactersandintersimples quencerepeat(ISSR)markerswereanalyzedamongtheC．sinensissamples
from11 CountiesnQinghaiProvince．ResultsSignificantgeneticvariationsweredetectedinboth
morphologicalcharactersandISSRpolymorphismsamongtheseC．sinensissamples．Datafrom
morphologicalanalysishowedthatheseC．sinensissamplescouldbeapproximatelydividedintothree
groups，whichdistributedaroundtheQinghaiL ke，middleeast，andsouthareasinQinghaiProvince，
respectively．Howeveritwasarduousandambiguoustoidentifythespecificsamplesonlybymorphological
characters．BasedontheanalysisofISSRmarkers，C．sinensisofQi ghaiProvincecouldbeclassifiedinto
tWOmajorg oups．OneincludedthesamplesfromtheareasroundtheQinghaiL keandanotherfromthe
othertwoareas，oneofwhichouldbefurtherdividedintothreesubgroups，wellcorrelatedwiththe
differenthabitatsofsouth，center，andeastareasinQinghaiProvince，respectively．ConclusionC．
sinensisw thgeneticvariationandaffinityinQinghaiProvincedistributeswidelyaccordingtotheirliving
environment．ISSRanalysisisaneffectivetOOIinidentifyingC．sinensissamplesandeterminingtheir
geneticaffinityparticularlywhencombinedwiththeanalysisofmorphologicalcharacters．
Keywords：QinghaiProvince；Cordycepssinensi (Berk．)Saec·；inter—simplesequencerepeat
(ISSR)；geneticaffinity；regionaldistribution
冬虫夏草Cordycepssinensis(Berk．)Sacc．系子囊菌纲、肉座菌目、麦角菌科、虫草属(Cordyceps)
鉴鍪是留：至莲斋翁銎中药现代化专项(。。Dz。。。。，)
作者简介：梁洪卉(】972--)，吉林公主岭市人，同济大学生命科学与技术学院在读硕士生，主要从事植物遗传多样性的评价及利用研究
+通讯作#m程aih舟su腿謇a?8强if：；；：：絮1‘霰：(021)6598104lE—il：。h。。g曲。。@m川．。。。g皿。d。．。。
万方数据
·1860· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月
真菌寄生在鳞翅目蝙蝠蛾科昆虫幼虫上所形成的子
座及幼虫尸体的复合体““3，具有补肺益肾、止血化
痰等功效，是我国珍稀名贵中药材之一。青海省是我
国冬虫夏草的主要产地之一，分布在3000～5100
m的高寒草甸区。由于过度采挖，其资源已濒临枯
竭。为有效地保护青海省的冬虫夏草资源。使其能可
持续地开发利用，有必要对青海省不同地区的冬虫
夏草资源进行鉴定和遗传多样性的评价分析。陈永
久等“3用RAPD标记研究了青藏高原部分地区冬
虫夏草的遗传分化，没有专门评价青海省冬虫夏草
资源的遗传关系。此外，由于冬虫夏草价格昂贵，各
种来源的虫草涌人市场，使得市场鱼龙混杂。如何科
学、准确地鉴定冬虫夏草真伪及道地性就变得十分
重要。
简单序列重复(inter—simplesequencerep at，
ISSR)区间扩增多态性口”3是利用生物基因组中常
出现的简单序列重复SSR(simplesequ ncerepeat)
设计引物，检测多态性的一种分子标记。ISSR分子
标记技术具有操作简单、无须预先知道DNA序列、
比RAPD标记更为灵敏、稳定且实验重复性好等优
点，已用于甘蔗、乐昌含笑、怀地黄、华木莲等的鉴定
和遗传多样性的检测分析o““。
本研究的目的：1)采用形态特征和ISSR分析
对采自青海省11个县的冬虫夏草进行鉴定；2)评价
其遗传变异和亲缘关系，探讨青海省冬虫夏草资源
的分布格局。
1材料和方法
1．1试验材料：冬虫夏草样品分别采自青海省的
11个县和西藏的2个县(图1)，并由青海省畜牧兽
医科学院徐海峰鉴定为Cordycepssinensis(Berk．)
Saec．。西藏的样品和由安徽农业大学提供的中国被
毛孢Hirsutellasinensisx．J．Liu和中国拟青霉
PaecilomycessinensisChenetXiao菌丝体菌粉作为
对照。
1．2形态特征的观察测定：从各县的冬虫夏草样品
中随机选取10条虫草，测定虫草单株质量、虫体长
度、子座长度、虫体直径、子座直径、观察子囊孢子发
育状态。
1．3基因组DNA的提取：上述每个县的10个虫
草分别取子座10mg，中国被毛孢和中国拟青霉的
菌丝体菌粉各取20mg提取DNA。样品用液氮研磨
后转入离心管中，加入600btL预热的CTAB缓冲
液(2％CTAB、1．4mol／I．NaCl、0．2％肛巯基乙
醇、100mmol／LTrisHCl、20mmol／I。EDTA，pH
oML
ZD一杂多YS一玉树MQ一玛沁HN一河南XH一兴海
GN贵南GH一共和Hz湟中GC一刚察TJ一天峻
QL一祁连Lz林芝ML一米林
ZD—ZaduoYS—YushuMQMaqinHZHenanXH-Xinghal
GNGuinanGH—GongheHZ—HuangzhougGC—Gangcha
TJ—TianjunQL—QilianLZ—LinzhiMLMilin
圈1青海省冬虫夏草样品分布圈
Fig．1DistributionofC．sinensis
fromQlnghalProvince
8．0)，65vc保温1h。加入600止氯仿一异戊醇
(24：1)，轻摇混匀5min，室温12000r／min离心
10min。取上清，加入500皿氯仿一异戊醇(24：1)，
轻摇混匀10min，12000r／min离心10min。取上
清，加入1／10体积的3mol／LNaAc和2倍体积的
预冷的无水乙醇，颠倒混匀后在一20℃中保存30
min。100 0r／rain离心5min，取沉淀，用70％乙醇
清洗，5000r／min离心5min。取沉淀干燥后用100
pLTE缓冲液(10mmol／LTris—HCL，1mmol／L
EDTA，pH8．0)溶解，用0．7％的琼脂糖凝胶检测
DNA质量。
1．4 ISSR引物筛选和PCR扩增：分别将上述提取
的每个县的10个虫草DNA混合，作为该县冬虫夏
草DNA模板。用其中的4个DNA样品筛选100条
ISSR引物(TheUniversityofBritishColumbia
(UBCSSRPrimer(RAPD)SynthesisProject
OligonueletideS 100／9)。反应体积20“L含：2
mmol／I。MgCl2、0．25mmol／LdNTPs、0．2vmol／I。
引物、10“g模板、1×buffer和0．75UExTaqDNA
聚合酶(TaKaR)。使用EppendorfMastercycler
GradientPCR仪进行扩增反应，扩增条件为94℃
预变性5min；40个循环：94℃变性45s， 8～55℃
退火45s(退火温度随引物变化，见表1)，72℃延伸
45s；最后72℃延伸10min。
扩增产物在1．5％琼脂糖凝胶中电泳分离(以
100V恒压电泳35min)，以100bpDNALadder
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月· 861·
Plus(MBIFermentas)作为分子量标准，用lpg／
mL溴化乙锭染色后于UVP--GDS8000自动成像
仪中拍照、观察、记录并保存电泳图片。
从100条ISSR引物中选出扩增条带清晰、重
复性好的14条引物(表1)，用于所有样品的扩增。
裹1 14条ISSR引物的PCR扩增结果
Table1 Fragmentsamplifiedw th14ISSR
primersbyPCR
引物 序列
退火温总条多态性多态
度／c带数条带数率／％
1．5 数据处理：形态性状：用SPSSll．5统计软
件[133计算各县冬虫夏草形态性状的平均值、标准差
(standardeviation)，用最小显著差数法(LSD法)
比较、评估样本间的差异。对各变量(性状)标准化处
理后的数据得出6个变量的相关矩阵，并进行主成
分分析(PCA分析)。
ISSR：根据ISSR扩增条带的有无分别用⋯1’和
“o”表示。用Jaccard法(a肪一d)计算相似性系数，a
为两样品都有的条带，d为两样品都没有的条带，n
为多态性条带总数。UPGMA法聚类分析以及系统
树状图的绘制均采用NTSYS—pcNumerical
TaxonomySystem分析软件进行[1“。
2结果
2．1形态性状分析：青海省11个县的冬虫夏草的
6个形态性状数据归纳在表2。同一产地的冬虫夏草
样品内，从标准差可以看出6个形态性状的差异程
度不同。其中单株质量的差异最大，特别是HN和
ZD的样品。相对于其他性状，子囊孢子形态的变化
明显要小。不同产地的虫草样品之间用最小显著差
数法分析表明，其形态性状差异显著，尤其是单株质
量、虫体长度和子囊孢子形态。
衰2青海省11个县的冬虫夏草样品的形态性状特征及差异显着性分析
Table2 MorphologicalcharactersandsignificantdifferenceofC-sinensisfrom11CountiesinQinghaiProvince
样品编号同图l于囊孢于形态：O一于囊孢于不明显，l一子囊疆于较小，2一f囊孢于较肥太，3一于曩孤子肥太t4。子襞孢于极太M一平均值
ST-标准差标有不同字母舯同列平均值在5％水平上呈显著差异(最小显著差数法)。
Samplecod㈣⋯ametoFig．1Ascussporeform：Ounobvious，1smaller，2-littlebig，3-big，4一extremelybigM an．STstandard
deviationMeanslabelledindifferentl t erswithinsanleeolumearstatisticallydifferentat0．05levelofsignificanceb sedo“protectedleast
significantdifferencet∞t
主成分分析表明前2个主成分的特征值分别为 上可以看出，青海省11个县的冬虫夏草可分成3个
4．55和0．97，累计贡献率为91．95％(表3)。第1主组(图2)。QL、GC、TJ和GH构成一个比较紧凑的
成分的贡献率为75．83％，其中贡献较大的是单株组(第1组)，第1和第2主成分都为负值；HZ、XH、
质量、虫体长度、虫体直径和子囊孢子形态。第2主 GN、HN构成一个比较松散的组(第2组)，第1主
成分的贡献率为16．12％，贡献较大的是子座长度。 成分接近于o，第2主成分都为正值，其中HZ、XH
冬虫夏草的6个形态特征在分类中都起着非常重要 和GN比较接近；第3期由YS、ZD和MQ组成，第
的作用。从第1主成分和第2主成分作成的散点图 1主成分都为正值，第2主成分接近于0，YS和ZD
万方数据
·1862· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月
非常靠近，MQ则离得较远。青海省的冬虫夏草存在
明显的地域分布的差异，产地对冬虫夏草的分类起
一定的作用。
表3青海省11个县的冬虫夏草6个形态
性状相关矩阵的特征位
Table3 Eigenvaluesofcorrelationmatrixforsixmorpho—
logicalharactersonsamplesofC．sinensis
from11CountiesinQinghalProvince
莲
鼍
制
隶
褪
州
垛
≤ 》 。。
⑦ 迂 岁
MqYszI)0】，HzGcTJ GHxH(1NHNLz MLNqHBMBmarker
．3000
=}黜
：1；器
}700
NQM冲国拟青霉BMB-中国被毛孢Marker一100bpDNA
LadderPlus其余样品编号同图1
NQMP．sinensisBMB—H．sinens“Marker100bpDNA
LadderPtusOthersamplecodesaresametoFig．1
圈3 ISSR引物889扩增出的冬虫夏草指纹圈谱
Fig．3FingerprintofC．sinensisamplified
byISSRPrimer889
上和青海省其他产地的冬虫夏草明显分开。另一个
分支又可以分成3个小支，1)即MQ、YS和ZD；2)
xH、GN和HN；3)HZ。作为对照样品的西藏米林
县和林芝县的冬虫夏草以及中国被毛孢均在相似性
系数0．67的水平上和青海省的样品分开，但差异并
不太。而中国拟青霉则远离其他样品，在相似性系数
0．36水平上明显分开。
r————一Jv【V忙装
篚霎——厂——1二三巍
060 080 1 00
系数
图4基于ISSR数据用UPGMA法构建的
冬虫夏草亲缘关系的聚类分析树状围
Fig．4UPGMAdendrogramofgeneticaffinityof
C．sinensisbasedonJaccardsimilarity
coefficientfromISSRdata
3讨论
3．1 冬虫夏草的遗传变异和鉴定：冬虫夏草是菌虫
复合体。迄今为止。国内外学者已从冬虫夏草中分离
鉴定了10个属10多个种的无性型菌株o”；其寄生
蝙蝠蛾目前已报道的有5属38种之多”““。冬虫夏
草的鉴定一直是一个非常复杂的问题。市场上各种
似是而非的替代品层出不穷。因此，迫切需要建立一
个可用于准确鉴定冬虫夏草的有效方法和标准。此
外，对冬虫夏草的遗传多样性和亲缘关系仍缺乏
了解。
青海省11个县的冬虫夏草的6个形态性状尽
”如¨∽：宝∞哪圳：竿圳
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月· 863·
管在同一地方的样品内存在不同程度的差异，但有
些形态性状在不同地方的样品间的差异则更明显。
这表明不同地方的冬虫夏草间的遗传变异较大。虫
体长度在同一地方的样品内差异较小，而在不同地
方的样品间差异极大，且相对稳定，这可能与不同寄
主蝙蝠蛾种群以及生存环境有关。虫体长度可考虑
用于地区间冬虫夏草的分类。但所测得的形态性状
还不能作为鉴定某一特定地方冬虫夏草的指标。
与形态性状相比，用ISSR标记鉴定冬虫夏草
更有效。从ISSR分析结果可以看出，根据DNA指
纹图谱能够鉴定不同产地的冬虫夏草。中国被毛孢和
中国拟青霉也可通过ISSR标记明显地区分开来。因
此，ISSR标记对冬虫夏草的鉴定和亲缘关系以及冬
虫夏草无性型的有效检测都是非常有效的手段。
3．2冬虫夏草的亲缘关系和地域分布：根据形态性
状的主成分分析，将11个县的冬虫夏草大致分成3
个组，其地理位置与纬度有关，分别是环青海湖地
区、青海中东部和南部的虫草产区。这和陈永久等“]
的结果一致，他们认为青藏高原的冬虫夏草的遗传
分化发生于南北方向，即不同纬度之间。
基于笔者目前的1SSR数据分析，青海省的冬
虫夏草自成一类，有别于2个西藏的样品。环青海湖
地区的冬虫夏草的亲缘关系非常接近，形成一个分
支。而其余7个县的冬虫夏草在系统树状图中另成
一分支，其中又可细分为3个小支，分布包括了青海
省南部、中部和东部产区的冬虫夏草。ISSR分析和
形态性状分析结果大致吻合，表明青海省的冬虫夏
草在分布上表现出明显的地域性。
青海省的冬虫夏草在传统意义上一直被划分为
两大产区；即青南地区和环青海湖地区。笔者的研究
在遗传关系上对传统的产区划分提供了有力的支
持，同时也提出了新的见解。环青海湖地区的冬虫夏
草无论在形态形状还是亲缘关系上都与其他产地有
明显的差异，自成一产区。其虫草的特点为虫体小、
子座短、子囊孢子不明显。而传统意义上的青南产
区，根据本研究的结果又可分为2到3个区域。从形
态性状上可分为青海中部和青海南部2个区域，其
中HZ(湟中县)被分在青海中部区域。青海南部的
虫草虫体大、子座适中、子囊孢子明显，而青海中部
的虫草虫体中等、子座偏大、子囊孢子尚明显。Hz
属于环青海湖地区与青海东部(海东)地区的交界
处，由于中间受到日月山的间隔，其气候和植被都具
有自身的特点，其虫草的形态特征与青海中部产区
相似。ISSR分子标记分析认为，传统意义上的青南
产区至少可以分为青海省南部、中部和东部3个产
区。特别是海东地区的虫草在遗传上应该是并行于
“青南地区”和“青海中部地区”的第三个分支。因此，
青海省的冬虫夏草除了在不同纬度上形成了从南到
北的遗传分化外，特定区域的虫草也存在着一定的
遗传分化。
冬虫夏草不同种类寄主的分布主要是由生境中
植物群落决定的[“3，加上蝙蝠蛾的迁移能力不强等
原因，昆虫间存在种间隔离现象。据称青海省冬虫夏
草的寄主昆虫大致有8个种，进一步对其寄主昆虫
的遗传多样性的研究对阐明冬虫夏草遗传分化的原
因具有极其重要的意义。尽管用形态性状检测某一
特定产地的冬虫夏草依然十分困难，但是考虑到形
态性状在检测冬虫夏草的遗传变异和遗传关系方面
能起到一定的作用，因此将形态性状和分子标记结
合起来用于冬虫夏草的鉴定和亲缘关系检测效果更
佳。本研究根据形态性状和ISSR分析获得的青海
省冬虫夏草的地域分布资料为今后冬虫夏草资源的
保护和合理利用提供科学依据。
致谢：安徽农业大学樊关珍教授为本研究提供中
国被毛孢、中国拟青霉茵粉样品。此外，青海省畜牧兽
医科学院徐海峰对结果的分析提出了宝贵的意见
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茛菪发根培养体系的建立
陆倍倍1，张磊-，开国银z，张汉明1，丁如贤1，陈万生3’
(1．第二军医大学药学院生药教研室，上海200433；2，上海交通大学植物生物技术研究中心农业与生物学院复旦
交大一诺丁汉植物生物技术研发中心生命科学技术学院。上海200030；3．第二军医大学长征医院，上海200003)
摘 要：目的 建立莨菪Hyoscyamusniger的发根培养体系。方法分别用A4、LBA9402和C58C1三种发根农杆
菌菌株转化莨菪子叶受体，获得发根-测定发根的生长酋线和比较不同因素对发根生长量的影响；PCR鉴定转化发
根；莨菪发根中生物碱类含量的测定，结果首次利用发根农杆菌A4、LBA9402、C58C1三种菌株成功从莨菪中诱
导出发根，并建立了莨菪发根摄优的培养体系；经PCR鉴定证明Ri质粒的T—DNA已转化进莨菪的发根中。结论
莨菪发根培养体系的建立为利用遗传代谢工程手段调节莨菪次生代谢物含量和进行药用活性成分的工业化生产
奠定了基础。
关键词：莨菪；发根农杆菌；发根
中图分类号：R282．02 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)12186405
Establishmentof airyootcultureofHyoscyamusniger
LUBeibeil，ZHANGLeil，KAIGuo—yin2，ZHANGHanmin91，DINGRu—xianl，CHENWan—shen91
(1．DepartmentofPharmacognosy，SehoolofPharmacy，TheSecondMilitaryMedicalUniversity，Shanghai200433·
China：2．PlantBioteehnologyResearchCenterofShanghaiJi oTongUniversity．SchoolofAgricultureandBiology，
FudanSJTU—NottinghamPlantBiotechnologyReaearchandDevelopmentCenter．SchoolofLifeScienceandTechnology，
Shanghai200030，China；3．ChangzhengHospitaloft eSecondMilitaryMedicalUniversity，Shanghai200003，China)
Abstract：ObjectiveToestablishthecuhuralsystemforhairyootofHyoscyamusniger．Methods
HairyootofH．nigerwasobtainedfromcotyledonxplantsafterinfectedwithAgrobacteriumrhizogenes
strainsA4，LBA9402，andC58C1，respectively．Thegrowthcurvesweredeterminedandtheffectsof
differentfactorsnthegrowthof airyootwerecompared．ThetransformationofRiT—DNAwas
examinedbyPCR．Andthecontentsofalkaloidsinhairyootweredetermined．ResultsThehairyootof
H．nigerwasuccessfullyinducedbyusingA．rhizogenesstrainsA4，LBA9402，andC58C1forthefirst
timeandthebestsystemofhairyootculturewasestablished．ThetransformationofT—DNAfromRi
plasmidtothehairyootwasconfirmedbyPCRanalysis．ConelusionThestablishmentofcultural
systemforhairyootofH．nigerlaysfoundationforegulatingthesecondarymetabolismofH．nigerby
geneticengineeringtechniqueandforthelarge—scaleproductionofactivedrugcomponents．
Keywords：HyoscyamusnigerL．；Agrobacteriumrhizogenes；hairyroots
自从发根农杆菌Ri质粒被人们发现和认识以 来，它在许多领域都显示出极其广泛的应用前景。药
鉴釜品留：翌蒙薯写诗植物生物技术重点实验室开放基金(KJs03080)
尊翥摹器擎雉黯坚8。之：{爵器亏磊景鸯芋。譬恶毒：}耋恙：璺烹萼暑著烹薏兽工程方面的研究
O
l
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[
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万方数据
青海省冬虫夏草的遗传变异及亲缘关系的形态性状和ISSR分
析
作者： 梁洪卉， 程舟， 杨晓伶， 李珊， 周铜水， 张文驹， 陈家宽， LIANG Hong-hui，
CHENG Zhou， YANG Xiao-ling， LI Shan， ZHOU Tong-shui， ZHANG Wen-ju， CHEN
Jia-kuan
作者单位： 梁洪卉,程舟,杨晓伶,李珊,LIANG Hong-hui,CHENG Zhou,YANG Xiao-ling,LI Shan(同济大
学生命科学与技术学院,上海,200092)， 周铜水,张文驹,陈家宽,ZHOU Tong-shui,ZHANG
Wen-ju,CHEN Jia-kuan(复旦大学生命科学学院生物多样性科学研究所,生物多样性与生态工
程教育部重点实验室,上海,200433)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(12)
被引用次数： 22次

参考文献(16条)
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