全 文 ：3. 1　本实验采用正交设计及统计软件对葛根芩连
汤方进行分析, 结果表明,在 0. 05 水平下,葛根、黄
连对黄芩苷的含量的影响差异具有显著性, 这说明
葛根、黄连在该汤中使黄芩苷含量降低。甘草对黄芩
苷的含量的影响差异无显著性,黄连、葛根、甘草三
者两两交互作用影响差异不显著。
3. 2　黄连使黄芩苷的含量降低,有一些文献报道认
为降低的原因系小檗碱与黄芩苷形成复合物所致。
鉴于目前没有人真正获取复合物并确定其结构,因
此是否产生了复合物还有待进一步的研究证实。实
验中发现含黄连、黄芩煎液 pH 值低于黄芩单煎液。
由于黄芩苷在较低 pH 值下由盐的形式转化为酸的
形式导致溶解度降低, 因此导致黄芩苷含量降低的
原因也有可能是 pH 值的降低之故。
3. 3　在本实验色谱条件下没有发现新的色谱峰。
3. 4　实验中发现凡是含黄连、黄芩的配伍煎液在放
冷的过程中均产生大量的沉淀,而单煎液在同样的
条件下沉淀很少。对含黄连、黄芩各配伍产生沉淀的
分析表明,沉淀中所含的主要成分之一为黄芩苷(约
占沉淀物的 30%～40% ) , 其原因可能是由于黄连
中小檗碱主要以盐酸盐的形式存在,煎液为酸性, 而
黄芩中的黄芩苷也有部分以盐的形式存在, 在 pH
值较低的情况下转化为黄芩苷而析出。
3. 5　葛根能降低方中黄芩苷的含量,其原因可能是
葛根中含有和黄芩苷结构相似的成分, 与黄芩苷存
在竞争溶剂的作用, 其机制有待进一步的研究证实。
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蜂毒素的 SDS-PAGE质控方法研究
翟东霞, 刘　岭,张亚妮,凌昌全X
(第二军医大学附属长海医院 中医科,上海　200433)
摘　要: 目的　建立以 SDS-PAGE 进行蜂毒素质量控制的方法。方法　将通过凝胶色谱法从蜜蜂毒中分离纯化所
得到的蜂毒素, 以 SDS-PAGE 法测定其相对分子质量,并通过凝胶成像扫描测定蜂毒素纯度。结果　蜂毒素样品
电泳后在凝胶块上显示为均一条带, 相对分子质量约为 2 800, 含量为( 90. 59±0. 85) % , 与 HPLC 测定结果平行。
结论　SDS-PAGE 法作为蜂毒素的质控方法,结果准确、可靠、简便。
关键词: 蜂毒素; SDS-PAGE; 银染;凝胶扫描
中图分类号: R286. 02　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 07 0600 03
Study on quality control of melittin by SDS-PAGE method
ZHAI Dong-x ia, LIU Ling , ZHANG Ya-ni, LING Chang-quan
( Depar tment o f TCM , Changhai Hospital, Second M ilit ary Medical U niver sity , Shanghai 200433, China )
Abstract: Object　T o establish a SDS-PAGE method on quality cont ro l of melit tin. Methods　Melit-
tin w as ex tr acted and purified f rom bee venom by gel chr omatogr aphy. Purity and mo lecular mass of melit-
tin w ere determined by SDS-PAGE. Results　In the gelat inous board, the sample w as a sing le pept ide-
chain w ith a mo lecular mass of about 2 800 dalton as revealed by SDS-PAGE . T he pur ity w as ( 90. 59±
0. 85) % , w hich w as in parallel w ith the result tested by HPLC. Conclusion 　SDS-PAGE is accurate, r eli-
able and simple for the determinat ion of melit t in.
Key words : melit t in; SDS-PAGE; silver-dyed; g el image scanning
　　蜜蜂毒是中华蜜蜂 Ap is cerana Fabricius或意
大利蜜蜂A . mell if era Linnaeus尾部蛰刺腺内分泌
的有毒液体,含有多种不同化学结构的活性物质。蜂
毒素( melitt in)是蜜蜂毒中的主要成分,约占蜂毒含
·600· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 34 卷第 7 期 2003年 7月
X 收稿日期: 2002-09-26基金项目:军队“九五”重点课题( 98JD-3269) ;上海市科学技术委员会资助项目( 02DE19109)作者简介:翟东霞( 1977—) ,女,江苏扬州人,硕士研究生,研究方向:中西医结合。Tel: ( 021) 25070720　E-m ail : zh aidong xia@ 163. net
量的 40% ,系由 26个氨基酸构成的小分子多肽,相
对分子质量约为 2 840 [ 1]。蜂毒素具有很高的生物活
性,现代药理研究表明蜂毒素能够抗炎、镇痛、抑制
血小板凝集[ 2]。本实验结合以凝胶色谱法从蜜蜂毒
中分离和纯化峰毒素的方法[ 3] , 建立了十二烷基硫
酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PA GE )法结合硝
酸银染色测定蜂毒素相对分子质量,通过凝胶扫描
检测其含量, 并将测定结果与高效液相色谱
( HPLC)法的结果进行比较。
1　仪器和试剂
Elect ropho resis-301型电泳仪(瑞典 Amersham
Pharmacia公司) , SX-300扫描分析系统(上海四星
生物技术实业有限公司) , Sixing Bio Image 分析软
件 2. 0版本(上海四星生物技术实业有限公司)。
蜂毒素样品(长海医院中医科实验室制备, 冻干
品 ) , 蜂毒素对照品(色谱纯, 纯度达 100%, 美国
Sigma 公司, 产品号: M 1407) , 30%丙烯酰胺溶液
(上海华舜生物公司) , 十二烷基硫酸钠(电泳纯,美
国 Sigma 公司) ,三羟甲基氨基甲烷(电泳纯, 美国
Sigma 公司) , TEMED(电泳纯, Sigma 公司) , 过硫
酸铵(电泳纯,上海华舜生物公司) ,蛋白质相对分子
质量标准(瑞典 Amersham Pharmacia 公司) , 其他
试剂均为分析纯级。
2　方法与结果
2. 1　凝胶配制
2. 1. 1　分离胶配制: 采用 20%浓度的配方制胶。将
水 0. 69 mL, 30%丙烯酰胺溶液 6. 66 mL, 1. 5
mol / L T ris ( pH 8. 8) 2. 5 mL, 10% SDS 0. 1 mL,
10%过硫酸铵 0. 05 mL, TEMED 5 LL 混匀, 按照
文献的方法[ 4]制胶。
2. 1. 2　积层胶配制: 将水 6. 35 mL, 30%丙烯酰胺
溶液 1. 0 mL, 1. 0 mol / L Tris ( pH 6. 8) 2. 5 mL,
10% SDS 0. 1 mL, 10%过 硫 酸 铵 0. 05 mL,
TEMED 5 LL 混匀, 直接灌注在已聚合的分离胶
上,立即插入梳子,静置待胶凝固后拔去梳子。置入
电泳槽中。
2. 2　对照品溶液的制备: 取蜂毒素对照品, 加入去
离子水充分溶解,制成 1. 0 mg / mL 蜂毒素溶液,作
为对照品溶液。
2. 3　样品溶液的制备:精密称取蜂毒素样品适量于
25 mL 容量瓶中,加入去离子水约 20 mL, 超声振荡
30 min后,静置至室温,定容。用 0. 22 Lm 的微孔滤
膜过滤,即得样品溶液。
2. 4　处理:精密量取蜂毒素对照品溶液、样品溶液、
蛋白质相对分子质量标准( mark)各 15 LL,置于微
量 Eppendor f管中,加入等体积电泳缓冲液混匀后,
放入沸水浴中 3 min,上样。以 8 V/ cm 恒定电压电
泳, 至溴酚蓝前沿进入分离胶后, 提高电压到 15
V / cm ,直至溴酚蓝到达分离胶底部时停止电泳。剥
下凝胶后,参照文献方法 [ 4]进行银盐染色,依次置固
定液 30 min,浸泡液 30 min,蒸馏水漂洗 5 min重复
3次,再置入银染液中 20 min,再次漂洗后置于显色
液, 室温下缓慢平摇, 直至条带清晰, 置入终止液中
终止显色反应。银染结果见图1。蜂毒素样品与对照
品的条带位于相同的迁移距离,显示为均一条带, 证
实了样品与对照品的相对分子质量相同。
A -蛋白质相对分子质量标准混合物
B-蜂毒素对照品　C-蜂毒素样品
A-mar kers　B-mel it tin reference substance　C-melit t in sample
图 1　银染结果
Fig. 1　Results of slive-dyed
2. 5　标准曲线绘制:根据已知标准蛋白质相对分子
质量的常用对数值及电泳条带相对迁移率Rf, 以Rf
为横坐标,相对分子质量的对数值为纵坐标, 绘制标
准曲线,计算得回归方程: Y= 53 524X- 21 896, r=
0. 999 5。对照品的 Rf= 0. 81,样品 Rf= 0. 80,由标
准曲线读出样品的相对分子质量约为2 800。相对迁
移率( Rf ) = 蛋白带迁移距离/溴酚蓝迁移距离×
100%。标准相对分子质量曲线见图 2。
2. 6　蜂毒素含量测定:银染后的凝胶经 SX-300扫
描仪扫描后,通过 Six ing Bio Image 分析软件计算
样品中蜂毒素的纯度。取条带亮度与有效面积的乘
积作为评判因子,系统软件分析结果显示,供试品纯
度为 90. 73%。称取3批样品,分别置20 mL 容量瓶
中定容,依照前述电泳条件,测定样品中蜂毒素的含
量,每批样品检测 3次,结果见表 1。
2. 7　与 HPLC 结果的比较: 将同样 3 批样品以
HPLC 法[ 3] 进行检测, 测得百分含量为 ( 96. 14±
0. 52) %。改变样品浓度, 同等条件下重复实验,依次
采用 HPLC 法检测, 发现以 SDS-PAGE 法检测出
纯度较高的样品在 HPLC上纯度也高,半定量扫描
·601·中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 34 卷第 7 期 2003年 7月
a-卵清蛋白( 45 000)　b-碳酸酐酶( 30 000)　c-胰蛋白酶抑制剂
( 20 100) 　d-溶菌酶 ( 14 300)　e-抑肽酶( 6 500) 　f-胰岛素 B
链( 3 500)　g -胰岛素A 链( 2 500)
a-ovalbumin ( 45 000)　b-carbonic anhydrase ( 30 000)
c-parenzyme inhib itant ( 20 100)　d-lys ozym ( 14 300)
e-aprot inin ( 6 500)　f-insu lin B ( 3 500)　g-insul in A ( 2 500)
图 2　标准相对分子质量曲线
Fig. 2　Curve of standard molecular weight
浓度高的样品在 HPLC 上吸收峰面积也大, 3批样
品测得含量依次为 96. 09% , 97. 11% , 94. 22%,
RSD 分别为 0. 44% , 0. 50%, 0. 69% ( n = 3)。与
SDS-PAGE 结果呈大致平行关系。
表 1　3批蜂毒素样品含量测定结果( n= 9)
Table 1　Determination results of melittin
in three groups ( n= 9)
批号 样品/ mg 纯度/ % R SD /%
20020209 12. 00 90. 58 1. 01
20020314 11. 00 91. 45 1. 06
20020521 10. 10 89. 75 1. 17
3　讨论
　　由于蛋白质的迁移率与相对分子质量成相关关
系,因而可以用 SDS-PAGE法测定蛋白质的相对分
子质量。对于相对分子质量小于 15 KD的小分子多
肽, 浓度越高的聚丙烯酰胺凝胶电泳其分辨率越
高[ 5]。蜂毒素系小分子多肽,本实验采用了 20%浓
度的凝胶,使各组分获得良好分离,避免某些蛋白质
迁移不规则而导致的相对分子质量测定误差;银染
法对于单一蛋白质条带,能检出的蛋白质最低量为
2 ng ,其灵敏度较考马斯亮蓝法约提高了 100倍[ 6] ,
适于检测样品蛋白的单一性。故高浓度的 SDS-
PAGE结合银染法,对分离小分子多肽,具有高度准
确性和分辨能力。
　　在蛋白质类物质的分离纯化和纯度检测中, 单
以一种方法进行,往往难以得到准确结果,习惯上采
用两种以上的方法[ 6]。SDS-PAGE 扫描所测得的含
量略低于 HPLC 结果,主要是由于电泳条带略有弥
散,在截取有效面积时有所损失,导致结果偏低。将
SDS-PAGE与半定量分析系统配合使用, 可以在获
取样品相对分子质量信息的同时较准确地测定样品
含量, 其检测结果与 HPLC 接近, 且两者的检测结
果之间具有平行关系。因此, 本研究在已有蜂毒素
HPLC质控方法的基础上,建立了 SDS-PAGE 法用
于蜂毒素的定性定量分析。
与 HPLC 法比较, SDS-PAGE 虽然检测结果的
准确性及灵敏度略低,但一次电泳可同时完成 10个
样品的上样检测, 效率高且操作简便,实验成本低
廉,因此, 就蜂毒素等小分子及其相关产品的质控而
言,采用 SDS-PAGE 法是基本可行的。
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白质化学研究技术与进展 ) [ M ] . Bei jing: Science Pres s,
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　　(上接第 597页)
号,结合1HNMR, 初步认为符合贝壳杉烷型四环二
萜类化合物的谱学特征 [ 4]。D67. 1、70. 6提示为连有
羟基的伯碳和叔碳信号, 分别确定为 C-17位和 C-
18位信号。1HNMR( C5D5N)谱给出 D4. 43( 1H, d,
J= 10. 8 Hz, H18-Ha) , 4. 40 ( 1H, d, J = 10. 8 Hz,
H18-Hb ) , 4. 02( 1H, d, J = 10. 8 Hz, H17-Ha ) , 3. 99
( 1H, d, J= 10. 8 Hz, H17-Hb) , 3. 66( 1H, s, H-16)和
1. 12( 3H , s, C20-CH3 )等信号。该化合物与文献 [ 3]对
照基本一致,故鉴定该化合物为对映-16AH, 17, 18-
二羟基-贝壳杉烷-19-羧酸。
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·602· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 34 卷第 7 期 2003年 7月