全 文 ：中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第8期2005年8月·1221·
喜树胚轴细胞悬浮培养的优化和喜树碱的积累
潘学武，刘 欣，吕应堂。
(武汉大学生命科学学院植物发育教育部重点实验室，湖北武汉430072)
摘要：目的优化喜树胚轴细胞悬浮培养体系生产喜树碱。方法将由喜树种子下胚轴诱导的愈伤组织进行悬
浮培养，研究了基本培养基、激素和培养条件对培养物生长的影响，测定了培养细胞生长和喜树碱积累的动态变
化。结果悬浮培养细胞在MS培养基中细胞生长良好，细胞分散性和喜树碱积累优于在其他培养基中。最佳激素
组合为2，4-D0．2mg／L+NAA0．5mg／L+6-BA0．5mg／L，细胞继代周期以12d左右为宜，悬浮细胞适合在
22～26‘C，120r／min下生长。悬浮培养细胞在第4～20天为对数生长期，细胞倍增时间为￡(d)一3．92d～，细胞千
重至第20天达到最大，为27．44g／L。在细胞对数生长期内，喜树碱积累与细胞生长呈线形正相关性，第20天喜树
碱质量分数达到最大值9．319×10一，喜树碱产量为2．56mg／L。结论MS基本培养基适合喜树胚轴细胞悬浮培
养，细胞生长前20天内，培养体系中喜树碱积累与细胞生长呈正线形相关性。
关键词：喜树；喜树碱；悬浮培养；基本培养基；培养条件
中图分类号：R282．13 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)08—1221—05
OptimizationofcellsuspensionculturesinhypocotylsofCamptothecaacuminata
andcamptothecinaccumulation
PANXue—WU，LIUXin，LUYing—tang+
(KeyLaboratoryforPlantDevelopmentalBiologyofMinistryofEducation，CollegeofLifeSci nces，
WuhanUniversity，Wuhan430072，China)
Abstract：ObjectiveTooptimizecellsuspensingculturesystemofcallusinitiatedfromhypocotylsin
Camptothecaacuminatatoproducecamptothecin．MethodsThcallusinitiatedfromhypocotylsofC．
acuminataseedsweresuspensing—cultured，theeffectsofbasicm dia，plantgrowthregulatorsandculture
conditiononcellgrowthwerestudiedanthedynamicchangesofcellgrowthandcamptothecinaccumula—
tionweremonitored．ResultsSuspensionculturecellsgrewwellinMSmediumandcellhomogeneityand
eamptothecinconte tweresuperiortothoseinothermedia．Theoptimumplantgrowthregulatorswe e2，
4一D0．2mg／L+NAA0．5mg／L+6一BA0．5mg／L，propersubculturetimwasabout21andsuspension
cellsdevelopedwellin22—26℃at120r／min．Thelogarithmphaseforcellgrowthwasfrom4thdayto
20thdayanduringthistimethedoublebiomassccumulationtimewas3．92d．Meanwhile，duringloga—
rithmphase，camptothecinwaspositivelylinearcorrelativetoCellgrowth．Consequently，at20thdaythe
maximumcelldryweight，camptothecin，andyieldwere27．44g／L，9．319×10～，and2．56mg／L，
respectively．ConclusionMSbasicmediumadaptedoestablishcelluspensionculturesystemofcallus
initiatedfromhypocotylsinC．acuminataandcamptothecinispos tivelylinearcorrelativetocellgrowth
duringthecellgrowthuntilthefirstday．
Keywords：CamptothecaacuminataDec isne；camptothecin；suspensionculture；basicm d um；
culturecondition
喜树碱(camptothecin)是一种色氨酸衍生的萜
烯类吲哚生物碱，是美国的Wall博士于1966年从
我国引种的特有树种喜树Camptothecaacuminata
Decaisne茎的提取物中首次分离得到的抗癌活性物
质Ⅲ，而直到1985年，Hisang等发现喜树碱通过抑
制肿瘤细胞内拓扑异构酶I(TopoI)的活性而具
抗癌效应＆3，才真正引起众多研究者的兴趣，因为喜
树碱类药物是迄今为止发现的唯一一类专门通过抑
收稿日期：2004—11-20
作者简介：潘学武(1975一)，男，湖北恩施人，武汉大学在读博士研究生，研究方向为植物次生代谢和植物细胞发酵工程。
*通讯作者 吕应堂Tel：(027)68752619Fax：(027)87666380E—mail：yingtlu@whu．edu．cn
万方数据
·1222· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第8期2005年8月
制拓扑异构酶I发挥细胞毒性的抗癌药物。目前，喜
树碱作为继紫杉醇之后又一木本植物来源的天然抗
肿瘤植物药，已成为又一新的世界性热门研究课
题[3]。其中，喜树碱的两种衍生物Irinothecan和
Topothecan已于1996年得到美国FDA的批准用
于临床，同时，9一硝基喜树碱已由美国SuperGen公
司完成针对晚期胰腺癌的Ⅲ期临床研究，正向美国
FDA提出新药申请。其他的如10一羟基喜树碱、Ex—
atecan(DX一895lf)、Lurtotecan(GG一211)等正处于
各级临床实验。所有的衍生物都以喜树碱为原料而
合成，据Sudo等2002年的估计[4]，喜树碱的全球年
需求量约为200kg，喜树碱类药物全球年销售额大
约是10亿美元，因此，作为一种原料药，喜树碱具有
相当的研究价值。
利用植物细胞大规模培养技术生产高价值次生
代谢产物在多种药用植物中取得了成功，随着人们
对喜树碱类抗癌药物需求的增加，单纯靠从植株中
提取喜树碱已不能满足市场的需求，利用植物细胞
培养法生产喜树碱是一有益的新探索。在这方面，国
外的一些研究小组率先进行了研究[4“]，相比而言，
国内虽有报道[73却大为滞后。悬浮培养体系的建立
和优化是大规模培养的基础，因此，本实验以喜树胚
轴来源的愈伤组织为材料，建立并优化细胞悬浮培
养体系，研究了喜树碱积累的动力学过程，旨在为喜
树细胞工程生产喜树碱类药物奠定基础。
1材料与方法
1．1 材料来源：成熟的喜树种子于秋季采自武汉大
学校园内成年大喜树。
1．2下胚轴愈伤组织的诱导与继代培养：种子经常
规方法表面消毒后，用接种针剥去种皮，切取下胚轴
接人Mg+2．4一D0．2mg／L+蔗糖2．5％+琼脂粉
0．8％，pH5．8诱导培养基中，材料置于(25±1)℃
温室中暗培养20d左右可成功诱导出愈伤组织，用
上述培养基作继代培养基，培养条件不变，扩大培养
愈伤组织，每15天继代1次。
1．3悬浮培养的建立与优化：将继代培养8～10次
左右的愈伤组织，接入装有100mL液体培养基的
250mL三角瓶中，新鲜细胞接种量为10％，蔗糖40
g／L，黑暗中于(25±1)℃温室中在摇床上进行振荡
培养。通过不同基本培养基的选择、激素的筛选、培
养条件的改变等来优化喜树悬浮培养，细胞开始褐
变时即20d取样(特别说明除外)测定悬浮细胞生
长速率和细胞聚集体的分配情况。
1．4参数测定
1．4．1细胞聚集体的分拈：参照文献的方法[8]，收
获的新鲜细胞通过不同孔径的筛网，将细胞分拈成
不同直径范围的细胞聚集体。
1．4．2细胞生物量和培养液pH值的测定：将待测
的悬浮细胞通过真空抽滤将培养液与细胞分开，用
pH计测定培养液pH值，收获细胞于50℃鼓风烘
箱烘干至恒重后称质量，生长速率以每升培养液产
生的细胞干重来表示。
1．4．3喜树碱的测定：样品中喜树碱的提取和检测
参照文献[4，5]的方法稍加改进而成。精密称取干细
胞100mg，研细加入甲醇5mL，超声30min，吸出
甲醇层，重复3次，合并甲醇层干燥成结晶物。结晶
物用2mL氯仿一水(8：2)萃取3次，合并氯仿层成
结晶即为喜树碱粗据物，1mL甲醇(色谱纯)溶解定
容后用于HPLC分析。液相色谱分析采用Agilent
1100series高效液相色谱仪，色谱柱：ZORBAX
EclipseXDB—C18柱(150mm×4．6mm，Agilent公
司)，流动相：甲醇一水一40：60，体积流量：1mE／
min，荧光检测(激发波长365nm，吸收波长428
nm)，定量参数为峰面积，喜树碱标准样品购自美国
的Sigma公司，喜树碱的质量分数用愈伤组织于质
量的百分数或每升培养基细胞产生的喜树碱总量来
表示。
1．4．4重复性：试验中各处理至少重复3次。
2结果与分析
2．1 适合喜树悬浮培养基本培养基的选择：将生长
迅速，分裂旺盛，疏松易碎的淡黄色或无色愈伤组织
接人不同的液体培养基中，本实验选取4种基本培
养基：MS、B5、N6、H和WP，各附加0．2mg／L的
2，4一D和40g／L的蔗糖。每20天继代1次，每继代
1次测定细胞的生长速率(结果见图l-A)。连续继
代4次后，愈伤组织逐渐适应了液体培养环境，这时
测定悬浮培养细胞在不同的基本培养基中细胞聚集
体的分配情况(结果见图1一B)和喜树碱(结果见图
l-C)的质量分数。从图中可以看出，在继代过程中，
喜树细胞在B5培养基生长最快，细胞干重可达到
18．23g／L，在MS培养基中生长其次，可达到
16．09g／L，在N6培养基中最差，细胞干重仅有
11．07g／L。在继代过程中，生长在B5和N6培养基
中的细胞容易聚集成团，每次继代要去掉大部分细
胞，而在其他几种基本培养基中，细胞分散性较好，
因此，笔者在悬浮细胞继代到第4代时测定了细胞
聚集体的分配情况，从图1一B中可以看出以上现象。
在MS培养基中，悬浮细胞聚集体大多集中在o～3
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第8期2005年8月·1223·
mm，而在B5培养基中细胞聚集体大多集中在4
mm以上。悬浮培养细胞喜树碱的合成能力在几种
培养基中也各不相同，在MS培养基中质量分数可
达6．69×10一，产量可达1．055mg／L，在N6培养
基中最差。综合考虑，本实验选择MS培养基作为适
合喜树细胞悬浮培养的基本培养基。
基本培养基
基本培养基
基本培养基
图1喜树悬浮培养细胞在不同基本培养基中的生长
速率(A)、细胞聚集体大小(B)和喜树碱积累(c)
Fig．1Growthrates(A)，cellaggregationsizes(B)
andcamptothecinac umulation(C)ofSUS—
pensionculturecellsC．acumunata
invariousba icmedia
2．2激素的筛选：在愈伤组织培养和细胞悬浮培养
过程中，2，4-D具有明显促进细胞分裂的作用，但高
质量浓度的2，4一D也明显抑制了喜树碱的生物合
成(数据未列出)，因此，实验中2，4-D质量浓度不
变，考察另外两种在实验中效果较好的激素，即生长
素NAA和细胞分裂素6一BA的不同配比对细胞生
长的影响，结果如表1所示。NAA和6一BA都为0．5
mg／L时细胞生物量为最大值25．82g／L，高质量浓
度的激素明显抑制细胞的生长。
2．3继代时间，培养温度和摇床转速的影响：植物
悬浮培养细胞在生长过程中，外部培养条件起着非
常重要的作用。从图2一A可以看出，细胞继代时间
不宜过长，以21d左右为宜。喜树胚轴悬浮培养细
胞对温度的适应范围相对较宽，在22～26℃即细胞
在(23±1)‘C和(25±1)℃的温度条件下生长良好
(图2一B)。摇床转速对细胞生长影响明显，从图2一C
中可以看出，细胞在低转速条件下生长迟缓，较高的
转速抑制细胞生长，最适转速为120r／min。
2．4 喜树胚轴细胞悬浮培养的生长特性和喜树碱
的动态积累：喜树胚轴悬浮培养细胞在MS培养基
中，附加2，4一D0．2mg／L，NAA0．5mg／L，6一BA
0．5mg／L，蔗糖40g／L，在(25土1)‘C，120r／min
条件下培养，每4天取样，测定悬浮培养细胞的生物
量、培养液pH值和喜树碱的质量分数，结果如图3、
4所示。喜树胚轴细胞悬浮培养的生长曲线近为“S”
形(图3)。细胞生长的延滞期约为4d，培养的第4
天之后为对数生长期，细胞迅速增殖，细胞倍增时间
t(d)=3．92d～，至第20天，细胞于重达最大值为
27．44g／L。第20天后，细胞生长速度减慢，细胞干
重缓慢下降。悬浮培养液pH值(图3)在开始4d内
迅速下降，第4天为5．28g／L。然后缓慢回升，直到
第32天达到最大值为6．82g／L。在此过程中，培养
液pH值在第16天达到5．7，接近培养基初始pH
值5．8。
图4表明，喜树细胞接人新鲜培养液后，培养物
中喜树碱随细胞生长增殖而不断积累，第20天达最
表1 NAA和6-BA的不同配比对细胞生长的影响
Table1 EffectsofdifferentcombinationsofNAAand6-BAoncellgrowth
万方数据
·1224· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第8期2005年8月
一30
L25
垒9 20
商15
H-lO
翟 一
器 5
O
-I- 壬 壬 A
n
7 14 2l 28
t|矗
19±l21±123±l25±127±129±1
培养温度／C
8D 100 120 140 1bu
摇床转速／(r·min一1)
图2继代时间(A)、培养温度(B)和摇床转速(c)
对细胞生长的影响
Fig．2Effectsofsubculturetim (A)，temperature
(B)，andshakingspeed(C)oncellgrowth
遥
2
鬃
糕
豳
0 4 8 12 16 202428 32
r／d
图3喜树悬浮培养细胞生长特性
Fig．3Cellgrowthcharacteristicinsuspension
cultureofC．acumunata
大值，质量分数为9．319×10一，细胞生长进入稳定
期，喜树碱迅速降低。在细胞生长前20d内，喜树碱
(y)与细胞生长(X)呈正线形相关性，Y一0．0005
x一0．0022，R2—0．9015。喜树碱产量(y)的变化
趋势与含量趋势相同，也在细胞生长前20d内与细
胞生长呈正线形相关性，y一0．1233X一0．8198，
Rz一0．984，第20天达最大值，喜树碱产量为2．56
mg／L。培养液中没有检测到喜树碱的产生，证明喜
树悬浮培养细胞中喜树碱合成后贮存在细胞内，难
以分泌到培养液中去。喜树碱质量分数(9．319×
0．012
0．010
姜0．008
羹o．006
忡0．004
0．002
0．000
O 4 8 12 16 20242832
t谴
图4喜树悬浮细胞培养喜树碱积累的动力学曲线
Fig．4Dynamiccurveofcamptothecinaccumulation
incellsuspensioncultureofC·acumunata
10_s)低于来源植物，根据分析的组织不同，植株中
喜树碱大约在0．02％～0．5％凹J。
3讨论
据文献描述m’11|，一个成功的悬浮培养体系必
须满足如下条件：一是悬浮培养物分散性良好，细胞
团较小；二是均一性好，细胞形状和细胞团大小大致
相同；三是生长迅速。本研究结果表明，基本培养基
的选择直接影响着建立的悬浮细胞系的质量。胚轴
来源的喜树悬浮培养细胞虽然在B5培养基中生长
旺盛，但是细胞的分散性和均一性较差。而在MS培
养基中生长也很快，细胞分散性和均一性也优于在
其他培养基中，因此，本实验采用MS培养基作为喜
树悬浮培养的基本培养基。同时，细胞分散性和均一
性较好的细胞在次生代谢产物合成能力也强于分散
性和均一性较差的细胞，这在实验中(见图1一C)和
其他的实验中已得到证实[81。从试验中还可以看出，
激素的配比，继代周期的长短，培养温度以及摇床转
速等也是影响悬浮培养细胞生长的重要因素，这些
条件的选择也会决定悬浮培养成功与否[1”12]。
在喜树胚轴细胞悬浮培养体系中，生物量和喜
树碱的积累均在第20天达最大值，此后，细胞进入
稳定期，细胞生长逐渐停止并缓慢下降，而次生代谢
物急剧下降，第32天几乎检测不到喜树碱的含量。
与别的研究者‘5’73所建立的喜树细胞悬浮培养体系
相类似，悬浮培养液中也没有检测到喜树碱的产生。
植物细胞次生代谢物的生产和细胞生长之间存在偶
联型、半偶联型和非偶联型3种关系[10’13]。比较图3
和4可知，喜树胚轴悬浮细胞中喜树碱的合成与细
胞的生长呈紧密偶联型，喜树细胞中喜树碱的合成
与细胞生物量积累趋势相同，这与Van—Henge等的
报道相似口]。喜树细胞培养生产喜树碱在国内外都
有报道，多数研究结果也表明[5~7]，细胞培养中喜树
碱一开始很难达到或超过母本植株，只有Wieden—
reid等‘63的部分细胞超过母本植株，质量分数高达
一1-J≥5＼碘牝髻嚣摊
O
5
0
5
O
5
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3
2
2
1
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m，O
^下rI毛一＼槲．上鲤异
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7
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L昌∞弱加峙m
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一下r】矗一＼嘲牛霉疑
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第8期2005年8月·1225·
0．236％，但未见后续报道。本实验体系中喜树碱量
仍低于野生植株，因此有必要从改进培养方式和代
谢调控等诸多方面对喜树细胞悬浮培养体系进行深
人研究以期提高其喜树碱量，为喜树细胞体外培养
生产的工业化提供技术支持。
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罗汉果脱毒苗的快速繁殖研究
付长亮1，马小军¨，白隆华2，缪剑华2，宋经元1
(1．中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所，北京100094；2．中国医学科学院中国协和医科大学药用
植物研究所广西分所广西药用植物园，广西南宁 530023)
摘要：目的筛选适宜的罗汉果脱毒苗茎段增殖培养基，研究培养温度与光照对茎段增殖培养的影响。方法采
用正交试验设计和完全随机实验设计筛选罗汉果脱毒苗茎段增殖培养基。正交L。(34)实验以在MS+BA0．1mg／
L+NAA0．1mg／L上培养30d的罗汉果脱毒苗单芽姊妹系的单节茎段为外植体，以培养基中BA，NAA，IBA及
蔗糖为试验因子，各因子设3个水平，以在不同处理得到的增殖系数为测定指标；在此基础上进一步研究了培养基
中BA和蔗糖质量浓度对增殖效果的影响；采用完全随机实验设计研究温度，光照对茎段增殖培养生成试管苗的
影响。结果 通过对正交实验结果的极差分析及方差分析表明，在4个因子中，对罗汉果茎段增殖系数影响最大的
是BA，其次是蔗糖的NAA，IBA的影响最小；BA，NAA，IBA及蔗糖对增殖系数的影响都达到极显著。根据新复极
差检验的结果，当前研究得到的罗汉果离体茎段的最佳增殖培养基为MS+BA0．5mg／L+NAA0．01mg／L+
IBA0．1mg／L+蔗糖40g／L，罗汉果茎段在此培养基上培养30d后增殖系数为13．13；不同浓度BA与蔗糖对茎
段培养的研究结果表明，BA在1．0mg／L增殖系数最大。考虑为保持试管苗的遗传稳定性，BA为0．5mg／L为宜。
增殖培养基中的蔗糖适宜质量浓度为4．o％；罗汉果茎段培养适宜条件为培养温度25．c，培养光强10003000
lx。结论 增殖培养基的成功筛选及培养温度与光强的选择，有助于实现罗汉果脱毒苗的工厂化生产。
关键词：罗汉果；脱毒苗；茎段培养；快速繁殖
中图分类号：R282．21 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)08—1225一05
RapidpropagationofMomordicagrosvenorivirus-freeplantlets
FUChang—lian91，MAXiao—junl，BAILong—hua2，MIAOJian—hua2，SONGJing—yuanl
(1．InstituteofMedicinalPl ntDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，
收稿日期：2004—1l—02
*通讯作者马小军Tel：(010)62890692E—mail：xjma@public．bta．net．cn
万方数据
喜树胚轴细胞悬浮培养的优化和喜树碱的积累
作者： 潘学武， 刘欣， 吕应堂， PAN Xue-wu， LIU Xin， L(U) Ying-tang
作者单位： 武汉大学生命科学学院,植物发育教育部重点实验室,湖北,武汉,430072
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(8)
被引用次数： 5次

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of Pueraria lobata seedling[期刊论文]-中草药 2003(07)

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1. 刘展眉.崔英德.LIU Zhanmei.CUI Yingde Ri质粒诱导喜树毛状根培养基中喜树碱的研究[期刊论文]-生态环境
2007,16(4)
2. 刘文哲 通过组织培养筛选高含量喜树碱细胞系[期刊论文]-实验生物学报2003,36(4)
3. 朱殿生.张彧.于营.朱靖博.ZHU Dian-sheng.ZHANG Yu.YU Ying.ZHU Jing-bo 喜树碱生物转化优良菌株的筛选
及其转化条件初步研究[期刊论文]-大连轻工业学院学报2007,26(1)
4. 顾青.宋达峰.GU Qing.SONG Da-feng L-色氨酸对喜树愈伤组织中喜树碱合成的影响[期刊论文]-浙江农业学报
2007,19(3)
5. 高桂珍.周吉源.秦凡 不同化学因子对喜树细胞悬浮培养生长效应的研究[期刊论文]-生物技术2003,13(3)
6. 高桂珍 喜树悬浮培养细胞生理特性的初步研究[学位论文]2003
7. 贺芳.曾耀英.王通.邢飞跃.林羿.梁佩燕.肇静娴.HE Fang.ZENG Yao-ying.WANG Tong.XING Fei-yue.LIN Yi.
LIANG Pei-yan.ZHAO Jing-xian 喜树碱诱导的HL-60细胞凋亡过程中线粒体的变化[期刊论文]-细胞与分子免疫学
杂志2006,22(2)
8. 刘晓明.安利佳.王红梅.包永明.段延龙.林熙然.LIU Xiao-ming.AN Li-jia.WANG Hong-mei.BAO Yong-ming.
DUAN Yan-long.LIN Xi-ran 喜树碱抗血管生成作用的研究[期刊论文]-中华皮肤科杂志2005,38(3)
9. 黄宝美.姚程炜.边清泉.王秀峰.莫金垣.HUANG Bao-mei.YAO Cheng-wei.BIAN Qing-quan.WANG Xiu-feng.MO
Jin-yuan 喜树果中喜树碱含量的高效毛细管电泳安培法测定[期刊论文]-分析测试学报2008,27(3)
10. 刘展眉.崔英德.方岩雄.Liu zhanmei.Cui Yingde.Fang yianxiong 从喜树果中综合提取喜树碱及脂肪酸的工
艺研究[期刊论文]-广东化工2006,33(5)

引证文献(5条)
1.张瑞.刘佳.郑健.王少明.张生.王洋 UPLC法测定小鼠粪便中的10-羟基喜树碱[期刊论文]-中成药 2013(5)
2.潘学武.董妍玲.石亚亚 抗褐变剂对喜树细胞悬浮培养的影响[期刊论文]-林业实用技术 2010(11)
3.张彦波.龚霞峰.胡江琴.庞基良.王利琳 喜树愈伤组织诱导与抑制褐化的研究[期刊论文]-安徽农业科学
2007(36)
4.董妍玲.潘学武 Cu2+诱导刺激对喜树悬浮培养细胞喜树碱生物合成的影响[期刊论文]-安徽农业科学 2010(23)
5.汪贵斌.蔡金峰.何肖华 涝渍胁迫对喜树幼苗形态和生理的影响[期刊论文]-植物生态学报 2009(1)


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