全 文 ：羊栖菜多糖体外抗肿瘤作用及其诱导肿瘤细胞凋亡的研究
季宇彬 ,高世勇 ,张秀娟
(哈尔滨商业大学药物研究所 博士后科研工作站 ,黑龙江 哈尔滨　 150076)
摘　要: 目的　通过体外抗肿瘤实验观察羊栖菜多糖 ( SFPS)对 6种不同组织肿瘤的抑制作用及其对肿瘤治疗的
组织特异性 ,同时揭示其作用机制。 方法　采用 M TT法和集落形成实验法观察 SFPS的体外抗肿瘤作用 ;采用流
式细胞仪观察 SFPS对肿瘤细胞周期及细胞凋亡的影响。 结果　 SFPS对人胃癌细胞 SGC-7901和人直肠癌 CO-
LO-205有较好的疗效。 SFPS可阻滞 SGC-7901人胃癌细胞由 G0 /G1期进入 S期 ,升高细胞凋亡指数 ( APO )。结
论　 SFPS对人胃癌细胞和直肠癌细胞效果较好 ,这一作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡达到的。
关键词: 羊栖菜多糖 ; SGC-7901; 细胞凋亡 ; 抗肿瘤
中图分类号: R286. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 07 0638 03
Studies on anti-tumor activities and apoptosis inducement
of sargassum fus iforme polysaccharide in v itro
JI Yu-bin, GAO Shi-yong , ZHANG Xiu-juan
( Po stdoc to ra l Resea rth Sta tion, Institute of Ma teria Medica, Harbin Commercial Univ er sity , Harbin 150076, China )
Key words: sargassum fusiforme po lysaccharide ( SFPS) ; SGC-7901; apoptosis; anti-tumo r
　　羊栖菜 Sargassum f usi forme ( Ha rv. ) Setch.
俗名为海大麦、海茜菜、大麦菜、破网、胡须泡、海菜
芽、鹿角尖等 ,为褐藻门马尾藻科植物 ,在我国辽东
半岛、山东、浙江、福建、广东浅海域均有生长 ,日本
和韩国也有生长 [1 ]。羊栖菜已作为中药“海藻”长期
应用 ,能软坚散结 ,用于瘿瘤瘰疬、痰饮水肿等的治
疗 [2 ] ,民间也有用其治疗肿瘤的报道 ,疗效较明显。
由于传统中药剂型以水煎剂为主 ,而羊栖菜水提取
物有效成分中以羊栖菜多糖 ( sa rg assum fusifo rme
poly saccha ride, SFPS)为主 ,因此本实验主要研究
SFPS的抗肿瘤作用并进一步观察其对肿瘤细胞凋
亡的诱导作用以揭示其抗肿瘤作用机制。
1　材料
1. 1　药品: SFPS,纯度 98% ,由哈尔滨商业大学药
物研究所提供 ;羊栖菜购自哈尔滨市药材公司 ,并经
哈尔滨师范大学生物系鉴定 ; 5-Fu,上海制药十二
厂提供 ,批号 990601。
1. 2　试剂　 RPM I 1640培养基、小牛血清 , Gibco
产品 ; M T T, Sigma产品。
1. 3　肿瘤细胞系: 人肝癌 Bel-7405、人宫颈癌克隆
cc-801、人乳腺癌 MCF-7、人直肠癌 COLO-205、人
胃癌 SGC-7901、人食管癌 Eca-109均由中国医学
科学院药物所提供。
1. 4　主要仪器:超速离心机 O PTIMA X L-100K,
贝克曼公司 ;二氧化碳培养箱 Form 3121,美国生命
科学集团 ;酶标仪 EL311,美国 BIO-TEK公司 ;流
式细胞仪 FACSCalibur,美国 BD公司 ; CO2恒温培
养箱 ,日本三洋公司。
2　方法
2. 1　 MT T实验 [3 ]: 用含 10% 胎牛血清的 RPM I
1604培养液将待测细胞株配成单个细胞悬液 ,以每
孔 1 200个细胞接种于 96孔培养板中 ,每孔 200
μL。同时设溶剂对照 ,每个剂量设 3个平行孔 ,常规
培养 24 h后 ,加入受试药物 ,置 37℃ , 5% CO2培养
箱中培养 4 d,向每孔加入 M TT 储液 10μL ( 5
mg /mL) ,震荡混匀后 ,继续培养 4 h,加入 10% 酸
化的十二烷基磺酸钠 ( SDS) 100μL ( pH 4. 7) ,过
夜用 EL311型酶标仪测定吸光度 ( A )值 ,测定波长
570 nm,参考波长 630 nm,计算 IC50值。
2. 2　集落形成实验 [4 ]: 将待测细胞株以 100个细
胞 /皿分别接种于 10 mL 37℃ 预温培养液的培养
皿中 ,常规培养 , 24 h后加入受试药物 , 37℃ , 5%
CO2及饱和湿度环境下 ,培养 10 d,弃去培养液 ,用
PBS ( 0. 01 mol /L , pH7. 4)小心浸洗 3遍 , 10% 甲
·638· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 7期 2003年 7月
收稿日期: 2002-12-04基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30271598) ; 黑龙江省普通高等学校骨干教师创新能力资助计划项目 ( 2001015)作者简介:季宇彬 ( 1956— ) ,男 ,博士 ,教授 ,博士生导师 ,多年来一直致力于中药药理、肿瘤药理、分子药理学研究 , 1999年进入哈尔滨医科大学博士后科研流动站工作。
醇固定 , 15 min后弃去固定液 , 0. 25% 龙胆紫染色 ,
显微镜计数大于 50个细胞的克隆数 ,对照组以培
养液代替受试药物 ,结果以克隆形成率 (% )表示
(克隆形成率= 克隆数 /接种细胞数× 100% )。
2. 3　对细胞周期及细胞凋亡的影响 [5 ]:选择对数生
长期的人胃癌 SGC-7901细胞 ,常规消化后 , 37℃ ,
5% CO2湿化培养箱内孵育 24 h,随机分为空白对
照组和给药组 ,给药组药物终浓度为 50μL /mL,对
照组加入等量的培养液 ,给药后 4, 8, 12, 24和 48 h
各组分别取样 , 1体积细胞悬液加 9体积 70% 乙醇
于 - 20℃ 固定 12 h,离心 , PBS液洗涤除尽乙醇 ,
离心后悬于 PI染液中室温染色 30 min,流式细胞
仪测定 ,以凋亡指数 ( APO) 表示细胞凋亡情况
( APO= 凋亡细胞数 /所测细胞数× 100% )。
3　结果
3. 1　 SFPS对肿瘤细胞株的杀伤作用:结果见表 1。
表 1　 SFPS对 6种肿瘤细胞株的抑制作用
Table 1　 Inhibitory ef fect of SFPS on six
diff erent k inds of tissue tumor
组别 IC50 / (μg· mL
- 1 )
Bel-7405克隆 cc-801 M CF-7 COLO-205 SGC-7901 Eca-109
SFPS 　 71. 71 　 23. 41 44. 32　 16. 95 　 10. 14 29. 71
5-Fu 0. 8 0. 2 1. 1 0. 4 0. 6 0. 5
3. 2　 SFPS对肿瘤细胞株集落形成的影响:见表 2。
表 1　 SFPS对肿瘤细胞株集落形成的影响 ( x± s , n= 10)
Table 1　 Ef fect of SFPS on colony-f orming of dif ferent
kinds of tissue tumor (x± s , n= 10)
组别 剂　量
/ ( mg· mL- 1)
集落形成率 /%
SGC-7901 COLO-205
对照 　　　 - 　 97. 73± 6. 27 　 98. 97± 5. 45
5-Fu 　　　 0. 05 82. 66± 4. 74* * 80. 36± 5. 32* *
SFPS 0. 10 84. 45± 5. 61* * 83. 36± 7. 78* *
0. 05 89. 88± 5. 81* 90. 79± 7. 97*
0. 025 92. 75± 5. 97 93. 66± 5. 39
　　与对照组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
　　* P < 0. 05　* * P < 0. 01 vs cont rol group
3. 3　 SFPS对 SGC-7901人胃癌细胞周期及细胞凋
亡的影响:结果见表 3。
4　讨论
　　羊栖菜在中药中以“海藻”入药 ,有多年的应用
历史 ,其方剂对肝癌、宫颈癌、乳腺癌、胃癌、肠癌等
有较好疗效 [6 ] ,笔者曾对羊栖菜的体内抗肿瘤作用
及对免疫功能的影响作了一些研究 [ 7] ,发现其对
S180 A、 EAC及白血病 L615小鼠肿瘤有较好的抑制作
用 ,为了进一步观察其对人肿瘤的组织特异性 ,本研
究采用了 MT T法和集落形成实验两种体外方法分
表 3　 SFPS对 SGC-7901人胃癌细胞周期及细胞凋亡的影响
Table 3　 Inf luence of SFPS on cell cycle
and apoptosis of SGC-7901
组别 细胞周期 /%
G0 /G1 S G2+ M
APO /%
对照 4 56. 34 42. 16 1. 50 　 1. 16± 0. 46
8 44. 85 50. 87 4. 28 1. 75± 0. 27
12 42. 23 56. 67 1. 10 1. 43± 0. 32
24 58. 72 40. 21 1. 07 1. 56± 0. 67
48 67. 47 31. 13 1. 42 1. 55± 0. 46
SFPS 4 64. 17 34. 56 1. 27 1. 23± 0. 78
8 78. 19 20. 04 1. 73 1. 65± 0. 76
12 87. 76 10. 32 1. 92 12. 17± 0. 88* *
24 83. 77 13. 97 2. 26 20. 33± 0. 69* *
48 82. 23 18. 46 1. 31 18. 77± 0. 68* *
　　与对照组比较: * * P < 0. 01
　　* * P < 0. 01 vs cont rol g roup
别观察了 SFPS对人肝癌 Bel-7405、人宫颈癌克隆
cc-801、人乳腺癌 MCF-7、人直肠癌 CO LO-205、人
胃癌 SGC-7901、人食管癌 Eca-109等 6种人癌细
胞株的细胞毒作用 ,之所以选取这 6种人癌细胞
株 ,是因为目前文献报道了含羊栖菜的几首方剂分
别对这几种肿瘤有较好的治疗作用 [6 ]。本研究结果
显示 SFPS对 6种人癌细胞株均有一定的抑制作
用 ,而尤以对人胃癌 SGC-7901和直肠癌 CO LO-
205效果最为明显。
本研究还观察了 SFPS对人胃癌细胞 SGC-
7901细胞周期及细胞凋亡的影响 ,试图阐明其抗肿
瘤作用机制。目前认为许多肿瘤的发生是由于肿瘤
细胞凋亡通路受阻而引起的 ,因此诱导肿瘤细胞凋
亡是一条抗肿瘤的有效途径 ,各种抗癌药物通过激
活一个固有基因介导的细胞程序死亡而实现抗肿瘤
作用 [7, 8 ]。本研究通过对给药后 4, 8, 12, 24, 48 h细
胞凋亡的观察 ,发现 SFPS组各时间段 G0 /G1期细
胞都多于对照组 ,即 SFPS能够阻滞肿瘤细胞由
G0 /G1期进入 S期 ,诱导细胞凋亡 ;实验所测得细胞
凋亡指数也反映出这一特点 , SFPS给药 12 h后 ,凋
亡指数较相应时间段空白对照组明显升高。
综上所述 , SFPS对胃癌疗效较为突出 ,通过诱
导 SGC-7901人胃癌细胞凋亡而达到抗胃癌的作
用 ,同时对肝癌、宫颈癌、乳腺癌、直肠癌亦有一定疗
效 ,但效果不显著。
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射干中异黄酮成分清除自由基的作用
秦民坚 ,吉文亮 ,刘　峻 ,赵　俊 ,余国奠
(中国药科大学中药学院 ,江苏 南京　 210038)
摘　要: 目的　研究射干 Belamcanda chinensis中分离的 4种异黄酮类成分清除 O2÷ ,· OH和 H2O2自由基的能
力。方法　采用生物化学发光法测定。结果　射干根茎中分离得到的异黄酮成分野鸢尾苷元 ( irg enin,Ⅰ ) ,鸢尾苷
元 ( t ecto rigenin,Ⅱ ) ,鸢尾苷 ( tecto ridinⅢ ) , 5, 6, 7, 4′-四羟基-8-甲氧基异黄酮 ( 5, 6, 7, 4′-tetrahydroxy-8-men-
thoxyisoflav one,Ⅳ ) 均具有清除自由基的作用 ,其中鸢尾苷元对 O2÷ ,· O H和 H2O2氧自由基清除作用的能力最
强。 结论　射干根茎中的 4种异黄酮类成分具有清除自由基的作用。
关键词: 射干 ;异黄酮 ;自由基 ;生物化学发光法
中图分类号: R286. 75　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 07 0640 02
Scavenging effects on radicals of isoflavones from rhizome of Belamcandae chinens is
QIN Min-jian, JI Wen-liang , LIU Jun, ZHAO Jun, YU Guo-dian
( Co lleg e of Chinese Materia Medica, China Pharmaceutical Univ ersity, Nanjing 210038, China )
Key words: rhizome o f Belamcandae chinensis ( L. ) DC. ; isof lav ones, radical; bio chemiluminescence
　　近年研究发现 ,中草药中某些有效成分具有清
除自由基的作用。 例如甘草中甘草酸和甘草次酸具
有不同程度的抑制 O2÷的作用 [1 ] ,云芝糖肽和灵芝
多糖具有清除活性氧的作用 ,与其提高机体免疫能
力和防癌抗癌机制有关 [2 ]。 不同的天然产物对不同
类型的自由基清除效果各异 ,机制各不相同 ,所以应
建立不同的自由基模型来评价药物的抗氧自由基活
性。本实验采用邻苯三酚 -鲁米诺 ( luminol )-碳酸缓
冲液 ( pH 10. 2) ,邻菲罗啉 -Cu2+ -抗坏血酸 -H2O2 ,
H2O2-鲁米诺 ( luminol) -碳酸缓冲液 ( p H 9. 5) 3个
产生活性氧和化学发光体系 ,检测射干 Belamcanda
chinensis ( L. ) DC. 中 4种异黄酮单体成分清除
O2
÷ 、· OH和 H2O2的作用 ,为射干类中药筛选自由
基清除剂提供一条有效的途径。
1　仪器与试剂
1. 1　仪器: SHG-C生物化学发光测量仪 (上海上
立检测仪器厂 ) ,分析天平 (上海天平仪器厂 ) ,
PHS-25型酸度计 (上海雷磁仪器厂 ) ,旋涡混合器
(上海环宇仪器厂 )。
1. 2　试剂: 无水碳酸钠 (天津化学试剂厂 ,优级
纯 ) ,碳酸氢钠 (上海虹光化工厂 ,分析纯 ) ,乙二胺
四乙酸二钠 ( EDT A) (上海化学试剂总厂 ,标准
纯 ) ,焦性没食子酸 (邻苯三酚 ) (遵义第二化学厂 ,
分析纯 ) , 3-氨基邻苯二甲酰肼 (鲁米诺 , luminol,
Sigma公司 ) , NaH2 PO4· 2H2O (南京化学试剂厂 ,
分析纯 ) , Na2HPO4· 12H2O (上海试剂二厂 ,分析
纯 ) ,四硼酸钠 (硼砂 ) (太仓化工二厂 ,分析纯 ) , 1,
10-菲罗啉 (邻菲罗啉 ) (上海试剂三厂 ,分析纯 ) ,
CuSO4· 5H2O (合肥工大化学试剂厂 ,分析纯 ) ,
30% 过氧化氢 (上海桃浦化工厂 ,分析纯 )。
·640· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 7期 2003年 7月
收稿日期: 2002-09-21基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30170103) ; 江苏省自然科学基金资助项目 ( BK97085)