全 文 ：羊栖菜多糖体外抗肿瘤作用及其作用机制的研究
季宇彬 ,高世勇
(哈尔滨商业大学药物研究所 博士后科研工作站 ,黑龙江 哈尔滨　 150076)
摘　要: 目的　通过体外抗肿瘤实验观察羊栖菜多糖 ( SFPS)对 6种不同组织肿瘤的抑制作用及其对肿瘤治疗的
组织特异性 ,并揭示其作用机制。方法　采用 M TT法和集落形成实验法观察 SFPS体外抗肿瘤作用 ;采用流式细
胞仪观察 SFPS对肿瘤细胞周期及细胞凋亡的影响 ;采用 Fluo-3 /AM 探针标记 ,激光共聚焦技术观测细胞内
[ Ca2+ ]i。结果　 SFPS对人胃癌细胞 SGC-7901和人直肠癌 COLO-205有较好的疗效。可阻滞 SGC-7901人胃癌
细胞由 G0 /G1期进入 S期 ,升高细胞凋亡指数 ( APO )。可使 SGC-7901细胞内 [ Ca2+ ]i先升高后下降 ,给 CaCl2后
[ Ca2+ ]i又升高。 结论　 SFPS对人胃癌细胞和直肠癌细胞效果较好 ,这一作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡达到的。
SFPS诱导肿瘤细胞凋亡是通过升高肿瘤细胞内 [Ca2+ ]i达到的 , [Ca2+ ]i升高时 Ca2+ 来源于细胞内钙库释放。
关键词: 羊栖菜多糖 ; SGC-7901; 细胞凋亡 ; [ Ca2+ ]i
中图分类号: R286. 91　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 12 1111 04
Studies on antitumor activities of Sargassum fus iforme
polysaccharide in vitro and its mechanism
JI Yu-bin, G AO Shi-yong
( Postdocto ral Resear ch Sta tion, Institute o f Materia Medica, Ha rbin Commercial Univ ersity , Harbin 150076, China)
Abstract: Object　 To study the inhibi to ry ef fect o f Sargassum f usi forme ( Ha rv. ) Setch. poly saccha-
ride ( SFPS) on six di fferent kinds of tissue tumo r by antitumor experiments in v itro, and to observ e tissue
speciality of tumor t reatment and reveal anti tumo r effect mechanism. Methods　 M TT and colony-forming
methods w ere adopted to study the antitumor activi ty o f SFPS in vi tro. Inf luences o f SFPS on cell cycle
and apoptosis w ere observ ed. LCM was adopted to measure [Ca2+ ] i o f the cells marked by Fluo-3 /AM
probe. Results　 SFPS had content antitumor activ ities to SGC-7901 and CO LO-205. It prev ented the
t ransforming of SCG-7901 from G0 /G1 period to S period. And i t increased the apopto sis index ( APO% ) .
Applying SFPS, [Ca
2+ ]i increased first and then decreased. Fur ther, after giv ing CaCl2 , [Ca
2+ ]i increased
again. Conclusion　 By inducing the apoptosis o f tumor cells, SFPS show s content antitumor activ ities to
SGC-7901 and CO LO-205. SFPS could increase the [Ca2+ ]i in SGC-7901. And the Ca2+ are f rom cellula r
storage.
Key words: Sargassum f usi forme poly saccharide ( SFPS) ; SGC-7901; apoptosis; [Ca2+ ]i
　　羊栖菜 Sargassum f usi forme ( Ha rv. ) Setch.
俗名为海大麦、海茜菜、大麦菜、破网、胡须泡、海菜
芽、鹿角尖等 ,为褐藻门马尾藻科植物 ,在我国辽东
半岛、山东、浙江、福建、广东浅海域均有生长 ,日本
和韩国也有生长 [1 ]。羊栖菜已作为中药“海藻”长期
应用 ,能够软坚散结 ,用于瘿瘤瘰疬、痰饮水肿等的
治疗 [2 ] ,民间也有用其治疗肿瘤的报道 ,疗效较明
显。由于传统中药剂型以水煎剂为主 ,而羊栖菜水提
物中有效成分以羊栖菜多糖 ( sa rg assum fusifo rme
poly saccha ride, SFPS)为主 ,因此本实验主要研究
SFPS的抗肿瘤作用并进一步观察其对肿瘤细胞凋
亡的诱导作用 ,及对人胃癌细胞 SGC-7901细胞内
[ Ca
2+ ]i的影响 ,以揭示其抗肿瘤作用机制。
1　材料
1. 1　药品: SFPS,纯度 98% ,由哈尔滨商业大学药
物研究所提供 ;羊栖菜购自哈尔滨市药材公司 ,并经
哈尔滨师范大学生物系鉴定 ; 5-Fu,上海制药十二
厂 ,批号 990601。
1. 2　试剂: RPM I 1640培养基、小牛血清 , Gibco产
品 ; M TT为 Sigma产品 , Fluo-3 /AM荧光探针 ,美
国 Molecular Probe公司。
1. 3　肿瘤细胞系:人肝癌 Bel-7405、人宫颈癌克隆
·1111·中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 12期 2003年 12月
收稿日期: 2003-04-13基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30271598) ; 黑龙江省普通高等学校骨干教师创新能力资助计划项目 ( 2001015)作者简介:季宇彬 ( 1956— ) ,男 ,博士 ,教授 ,博士生导师 ,多年来一直致力于中药药理、肿瘤药理、分子药理学研究。
cc-801、人乳腺癌 MCF-7、人直肠癌 COLO-205、人
胃癌 SGC-7901、人食管癌 Eca-109均由中国医学
科学院药物研究所提供。
1. 4　主要仪器: O PT IMAX L— 100K超速离心机 ,
贝克曼公司 ; Fo rm 3121二氧化碳培养箱 ,美国生命
科学集团 ; EL311酶标仪 ,美国 BIO-T EK公司 ;
FACSCalibur流式细胞仪 ,美国 BD公司 ; CO2恒温
培养箱 ,日本三洋公司 ; SW— C J— 2FD超净工作
台 ,苏州安泰 ;激光共聚焦系统 ,德国 Leica公司。
2　方法
2. 1　 MT T实验:按文献 [ 3]方法操作。
2. 2　集落形成实验:按文献 [3 ]方法操作。
2. 3　对细胞周期及细胞凋亡的影响:按文献 [3 ]方法
操作。
2. 4　肿瘤细胞内 [Ca2+ ]i的测定
2. 4. 1　肿瘤细胞培养:人胃癌细胞系 SGC-7901常
规复苏后 ,培养于质量分数为 0. 1的小牛血清 RP-
M I 1640培养液中 ,在 37℃ , 5% CO2及 95% 湿度
的 CO2培养箱中培养 , 2～ 3天传代 1次。
2. 4. 2　 SGC-7901细胞株的处理 [4 ]:用 RPM I 1640
培养液调细胞至 3× 106 /mL,接种于培养皿中 ,培
养 48 h后 ,弃去培养皿内旧培养液 ,用 PBS及无钙
台氏液洗两次 ,然后加入 1 mL无钙台氏液 ,加入
100μL含 Flu-3 /AM ( 1 mg /mL)荧光探针 , 37℃
避光孵育 1 h,弃去上清液 ,再用无钙台氏液洗一
次 ,然后加入 1 mL无钙台氏液 ,以备上机检测。
2. 4. 3　激光共聚焦检测 SFPS对 SGC-7901细胞
内 [Ca2+ ]i的影响: 实验条件: 激发激光 488 nm ,
Pinhole 500μm,扫描激光强度 30% , PM TI 30% ,
物镜 40X。空白对照组 [ Ca2+ ] i的测定: 将负载
Fluo-3 /AM的 SGC-7901细胞置于载物台上 ,选定
观察目标 ,观察未给药细胞内荧光强度 ,即 [Ca2+ ] i
水平 ,时间 600 s。给药后 [ Ca2+ ] i的测定:弃上清
液 ,加入 100μL ( 50μg /mL) SFPS,置 CO2培养箱
( 37℃ , 5% CO2 ) 1 min,上机观察 SGC-7901细胞
内 [Ca2+ ]i变化 ,观察时间 500 s。加入 CaCl2后细胞
内 [ Ca2+ ] i的变化: 弃上清液 ,加入 100μL ( 10
mmol ) CaCl2 ,观察 SGC-7901细胞内 [Ca2+ ]i的变
化 ,观察时间 500 s。
2. 5　数据处理: 结果均以 x± s表示 ,数据统计分析
进行组间 t检验。
3　结果
3. 1　 SFPS对肿瘤细胞株的杀伤作用:结果见表 1。
3. 2　 SFPS对肿瘤细胞株集落形成的影响: 结果见
表 2。
3. 3　 SFPS对人胃癌 SGC-7901细胞周期及细胞凋
亡的影响:结果见表 3。
表 1　 SFPS对 6种肿瘤细胞株的抑制作用
Table 1　 Inhibitory ef f ect of SFPS on six
dif f erent kinds of tissue tumor
组　别 IC50 / (μg· mL
- 1)
Bel-7405克隆 cc-801 MCF-7 CO LO-205 SGC-7901 Eca-109
SFPS 　 71. 71 　 23. 41 44. 32 　 16. 95 　 10. 14 29. 71
5-Fu 0. 8 0. 2 1. 1 0. 4 0. 6 0. 5
表 2　 SFPS对肿瘤细胞株集落形成的影响 (x± s, n= 10)
Table 2　 Effect of SFPS on colony-forming of diff erent
kinds of tumor cell (x± s, n= 10)
组　别 剂　量
/( mg· mL- 1 )
集落形成率 /%
SGC-7901 CO LO-205
对照 　　　 - 　 97. 73± 6. 27 　 98. 97± 5. 45
5-Fu 　　　 0. 05 82. 66± 4. 74* * 80. 36± 5. 32* *
SFPS 0. 10 84. 45± 5. 61* * 83. 36± 7. 78* *
0. 05 89. 88± 5. 81* 90. 79± 7. 97*
0. 025 92. 75± 5. 97 93. 66± 5. 39
　　与对照组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
　　* P < 0. 05　* * P < 0. 01 vs cont rol g roup
表 3　 SFPS对人胃癌 SGC-7901细胞周期及细胞凋亡的影响
Table 3　 Effect of SFPS on cell cycle
and apoptosis of SGC-7901
组　别 t /h 细胞周期 /%
G0 /G1 S G2+ M
APO /%
对照 4 56. 34 42. 16 1. 50 　 1. 16± 0. 46
8 44. 85 50. 87 4. 28 1. 75± 0. 27
12 42. 23 56. 67 1. 10 1. 43± 0. 32
24 58. 72 40. 21 1. 07 1. 56± 0. 67
48 67. 47 31. 13 1. 42 1. 55± 0. 46
SFPS 4 64. 17 34. 56 1. 27 1. 23± 0. 78
8 78. 19 20. 04 1. 73 1. 65± 0. 76
12 87. 76 10. 32 1. 92 12. 17± 0. 88* *
24 83. 77 13. 97 2. 26 20. 33± 0. 69* *
48 82. 23 18. 46 1. 31 18. 77± 0. 68* *
　　与对照组比较: * * P < 0. 01
　　* * P < 0. 01 vs cont rol g roup
3. 4　 SFPS对 SGC-7901细胞内 [Ca2+ ]i的影响:
结果表明给药前 SGC-7901细胞内 [Ca2+ ]i处于一
个相对恒定的浓度 ,见图 1。给药后 [Ca2+ ]i迅速升
高然后又降低 ,加入 CaCl2后 [Ca2+ ]i又升高 ,见表
4及图 2。
4　讨论
　　笔者曾对羊栖菜的体内抗肿瘤作用及对免疫功
能的影响作了一些研究 [5, 6 ] ,发现其对 S180 A, EAC
及白血病 L615小鼠肿瘤有较好的抑制作用 ,为了进
一步观察其对人肿瘤的组织特异性 ,本研究采用了
M TT法和集落形成实验两种体外方法分别观察了
·1112· 中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 12期 2003年 12月
表 4　 SFPS对人胃癌 SGC-7901细胞内 [Ca2+ ] i的影响 ( x± s , n= 30)
Table 4　 Effect of SFPS on [Ca2+ ] i of SGC-7901 cell (x± s, n= 30)
测定时间 [ Ca
2+ ]i /FI
50 s 100 s 150 s 200 s 250 s 300 s 350 s 400 s 450 s 500 s
给药前 600±10 609± 11 602± 12 598±12 612± 8 590±14 589± 10 601± 7 596± 12 604± 8
给药后 614±14* * 618± 10* * 644± 17* * * 674± 8* * * 710± 15* * * 750±12* * * 704± 9* * * 670± 5* * * 621± 11* * * 580± 12* * *
加入 CaCl2后 570±14 572± 10 568± 19 579±11 597± 12△△△ 615± 8△△△ 634± 9△△△ 655±11△△△ 697± 12△△△ 710± 9△△△
　　　与给药前比较: * * P < 0. 01　* * * P < 0. 001; 与加入 CaCl2时比较: △△△ P < 0. 001
　　　* * P < 0. 01　* * * P < 0. 001 vs p re-adminis tration; △△△ P < 0. 001 vs point af ter added in Ca Cl2
图 1　给药前 SGC-7901细胞内 [Ca2+ ] i
Fig. 1　 [Ca2+ ] i of SGC-7901 cells pre-admin istration
图 2　给药后及加入 CaCl2后 SGC-7901细胞内 [Ca2+ ]i
Fig. 2　 [Ca2+ ] i of SGC-7901 cells post- admini-
stration and after added in CaCl2
SFPS对人肝癌 Bel-7405、人宫颈癌克隆 cc-801、人
乳腺癌 MCF-7、人直肠癌 COLO-205、人胃癌 SGC-
7901、人食管癌 Eca-109等 6种人癌细胞株的细胞
毒作用 ,结果发现 SFPS对 6种人癌细胞株均有一
定的抑制作用 ,而尤以对人胃癌 SGC-7901和直肠
癌 CO LO-205效果最为明显。
　　本研究还观察了 SFPS对人胃癌细胞 SGC-
7901细胞周期及细胞凋亡的影响 ,试图阐明其抗肿
瘤作用机制。通过对给药后 4, 8, 12, 24, 48 h细胞凋
亡的观察 ,发现 SFPS组各时间段 G0 /G1期细胞都
多于对照组 ,即 SFPS能够阻滞肿瘤细胞由 G0 /G1
期进入 S期 ,诱导细胞凋亡 ;实验测得细胞凋亡指
数也反映出这一特点 , SFPS给药 12 h后 ,凋亡指数
较相应时间段空白对照组明显升高 ( P < 0. 01)。
新的观点认为肿瘤的发生不仅是因为细胞分裂
失控所导致细胞过度增生 ,还可能是细胞凋亡通路
受阻所致 ,凋亡的诱导和抑制与信号转导通路有关。
而 Ca2+ 作为第二信使其功能与细胞信号转导密切
相关 ,因此 Ca2+ 与凋亡密切相关。
本实验表明 SFPS通过诱导人胃癌 SGC-7901
细胞凋亡而达到抗胃癌作用 ,为进一步阐明 SFPS
诱导细胞凋亡的分子机制 ,本实验还观察了 SFPS
对人胃癌 SGC-7901细胞内 [Ca2+ ]i的影响。
本实验采用激光共聚焦技术 ,在其 Time series
程序下对给药前后人胃癌 SGC-7901细胞每隔 50 s
进行一次扫描 ,观测细胞内 [Ca2+ ]i的变化 ,结果发
现给药前 SGC-7901细胞内 [Ca2+ ]i处于一个相对
恒定的水平 ,给药后 [Ca2+ ]i迅速升高然后又降低 ,
这表明 SFPS作用于 SGC-7901细胞后 ,可引起肿
瘤细胞内 [ Ca2+ ] i升高 ,细胞内 Ca2+ 具有两个来
源: 细胞外钙内流和细胞内钙库释放。由于 SGC-
7901细胞处理过程中已用无钙台氏液处理 ,细胞外
无 Ca2+ ,因此细胞内 [Ca2+ ]i的升高只能来源于细
胞内钙的释放。而 [Ca2+ ]i在升高后又降低 ,则可认
为 [ Ca2+ ]i升高后 ,激活了细胞凋亡机制 ,随着凋亡
的发生 ,生物膜的一些生物学特性发生一些改变 ,而
引起细胞内 Ca2+外流 ,从而使 [Ca2+ ]i在升高到一
定程度后又降低。 这一结论也可从加入 CaCl2后
[ Ca
2+
] i的改变得以验证 , CaCl2加入后 ,细胞内
[ Ca
2+
]i又升高 ,表明加入 CaCl2后 ,细胞外有 Ca2+ ,
而抑制了加 CaCl2前细胞内 Ca2+ 的顺浓度梯度转
运 ,此时细胞外 [ Ca2+ ]大于细胞内 [Ca2+ ]i ,而使
Ca
2+ 由细胞外流入细胞内 ,进而细胞内 [Ca2+ ] i再
一次升高。因此通过本实验结果我们推断: SFPS能
通过引起肿瘤细胞内钙库 Ca2+ 的释放而升高肿瘤
细胞内 [Ca2+ ] i浓度 ,从而达到诱导肿瘤细胞凋亡
而抗肿瘤的作用。
References:
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mor-burden ed mice [ J] . Ch in J Mar Drug s (中国海洋药物
杂志 ) , 1995, 54( 2): 10-14.
白藜芦醇和抗坏血酸对预防非典型肺炎方剂Ⅰ 和Ⅵ 所致
小鼠外周血液淋巴细胞 DNA损伤的保护作用
金顺姬 1 ,段　链 1 ,黄　梅 1 ,杨静玉 1 ,于　海 1 ,赵余庆 2 ,吴春福 1
( 1. 沈阳药科大学 药理教研室 ,辽宁 沈阳　 110016; 2. 辽宁中医学院新药研究中心 ,辽宁 沈阳　 110000)
摘　要: 目的　研究白藜芦醇和抗坏血酸对预防非典型肺炎方剂Ⅰ 和Ⅵ 致小鼠外周血液淋巴细胞 DN A损伤的保
护作用。方法　采用单细胞凝胶电泳方法研究白藜芦醇和抗坏血酸对预防非典型肺炎方剂Ⅰ 和Ⅵ 致小鼠外周血液
淋巴细胞 DNA损伤的保护作用。 结果　白藜芦醇 ( 50, 100, 200 mg /kg× 3 d) 和抗坏血酸 ( 50, 100, 200 mg /kg×
3 d) 对方剂Ⅰ 和Ⅵ (临床等效量× 3 d) 所致的小鼠外周血液淋巴细胞 DNA损伤呈剂量依赖性的保护作用 (P <
0. 05)。结论　白藜芦醇和抗坏血酸能够保护预防非典型肺炎方剂Ⅰ 和Ⅵ 对小鼠外周血液淋巴细胞 DN A的损伤。
关键词: 白藜芦醇 ; 抗坏血酸 ; 预防非典型肺炎方剂 ; DNA损伤 ; 单细胞凝胶电泳
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 12 1114 04
Protective effect of resveratrol and ascorbic acid on lymphocyte DNA damage in mice
induced by prescriptionsⅠ andⅥ of Chinese materia medica against SARS
JIN Shun-ji
1 , DU AN Lian
1 , HU ANG M ei
1 , YANG Jing-yu
1 , YU Hai
1 , ZHAO Yu-qing
2 , WU Chun-fu
1
( 1. Depar tment o f Pharmaco lo g y, Shenyang Pharmaceutical Univ er sity , Shenyang 110016, China;
2. Resea rch Center o f New Drug , Liaoning Colleg e of TCM , Shenyang 110000, China)
Abstract: Object　 To evaluate the pro tectiv e effect o f resv erat rol and ascorbic acid on lymphocyte
DN A damage in mice induced by prescriptions Ⅰ and Ⅵ of Chinese ma teria medica against SARS.
Methods　 Resverat rol , asco rbic acid and tw o prescriptions against SARS w ere o rally administered to the
mice fo r three days. The effect on DN A damage w as measured in mice lymphocytes by means of single cell
g el elect ropho resis assay ( SCGE, o r Comet assay ) . Results　 Resverat rol ( 50, 100, 200 mg /kg× 3 d) o r
asco rbic acid ( 50, 100, 200 mg /kg× 3 d) could do se-dependently restore the DN A damage induced by
prescriptionⅠ and Ⅵ ( equivalent clinical do se× 3 d ) . Conclusion　 Resverat rol and asco rbic acid could
pro tect the lymphocyte DN A damage in mice induced by prescriptionsⅠ andⅥ o f Chinese ma teria medica
against S ARS.
Key words: resv era trol; asco rbic acid; prescriptions against SARS; DN A damage; sing le-cell g el elec-
trophoresis
　　为预防非典型肺炎在社会上进一步流行 ,经国
家卫生部非典型肺炎防治领导小组审定 ,国家中医
药管理局向社会推荐了 6个预防非典型肺炎的中
药方剂。这些方剂在社会上得到了较广泛的应用。前
期研究发现上述方剂中方剂Ⅰ ,Ⅴ ,Ⅵ 对小鼠外周血
液淋巴细胞 DNA具有明显的损伤作用 [1 ] ,提示健
康人服用某些中药来预防非典型肺炎应慎重。
多种因素可以引起 DNA的损伤 ,其中脱氧核
糖核酸的氧化是造成 DNA损伤的重要因素之一。
白藜芦醇和抗坏血酸具有显著的抗氧化活性。有文
献报道 ,白藜芦醇和抗坏血酸对氧化造成的 DNA
损伤具有一定的保护作用 [2, 3 ]。 为此 ,本实验应用国
际公认的单细胞凝胶电泳技术 ( single cell g el elec-
tropho resis assay , SCGE) ,又称慧星试验 ( Comet
·1114· 中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 12期 2003年 12月
收稿日期: 2003-07-17作者简介:金顺姬 ( 1975— ) ,女 ,吉林省通化市人 ,药理学硕士 ,主要从事中药药理研究。
* 通讯作者: Tel, Fax: ( 024) 23843567　 E-mail: w ucf@ syphu. edu. cn