全 文 ：纤维素酶在竹叶总黄酮提取中的应用
奚奇辉1,李士敏2X
( 1. 浙江大学 化学系,浙江 杭州　310027; 2. 浙江大学 分析测试中心,浙江 杭州　310029)
　　竹叶为禾本科竹亚科刚竹属毛竹 Phy llostachy s
heterocy cla var. pubescens的叶, 主产于浙江、江西、
四川等地。竹叶中含有丰富的黄酮,竹叶提取物在抗
自由基、抗氧化、抗衰老、调节血脂和血胆固醇、调节
免疫、抗菌、抗病毒等方面具有多种功效[ 1, 2]。
目前, 植物中总黄酮常以水、乙醇、甲醇作为溶
剂提取。水浸提成本低,但提取率也低;乙醇等有机
溶剂提取成本较高。竹叶中的总黄酮几乎都被以纤
维素为主体的细胞壁所包围。近年来,纤维素酶在国
内外广泛应用 [ 3, 4]。本实验将纤维酶应用于竹叶的提
取中,为纤维素酶在中药提取中的应用提供依据。
1　材料和仪器
竹叶采自浙江省德清县。纤维素酶由浙江省医
学科学院微生物研究所提供;芦丁对照品(中国药品
生物制品检定所) ;其他试剂均为分析纯。日立 U—
2000紫外可见分光光度仪。
2　方法与结果
2. 1　标准曲线的制备:准确称取干燥至恒重的芦丁
对照品 0. 100 1 g ,置于 50 mL 量瓶内,用 95%乙醇
溶解并稀释至刻度,即得芦丁储备液。精密吸取此溶
液 5. 0 mL 于 50 mL 量瓶中, 用 40%乙醇溶液稀释
至刻度, 即得芦丁对照品溶液。精确吸取 0, 0. 3,
1. 0, 2. 0, 3. 0, 4. 0, 4. 5 mL 芦丁对照品溶液于 10
mL 量瓶中,先加 5% NaNO 2 溶液 0. 3 mL, 放置 6
min,加 10% Al( NO3 ) 3 溶液 0. 3 mL, 放置 6 m in,
再加 4% NaOH 溶液 4 mL, 最后用 40%乙醇溶液
加至刻度,摇匀, 静置 15 m in 后在 510 nm 处测定吸
光度值。以吸光度对浓度作标准曲线,得方程: A =
0. 012 64C+ 0. 008 9 ( r = 0. 999 9) 表明芦丁在
6. 006～90. 09 Lg / mL 线性关系良好。
2. 2　供试品溶液的制备:取竹叶提取液浓缩后的水
溶液加热至沸并保持 5 min,自然冷却后离心( 3 000
r/ min) 15 min, 倒出上清液,在沉淀中加水搅拌后
再离心,合并上清液并定容至 100 mL。取溶液 5 mL
上已经预处理的聚酰胺柱( 14 cm×1 cm ) ,用水 100
mL 冲洗, 再用 95%乙醇溶液 50 mL 洗脱, 收集乙
醇洗脱液于 100 mL 量瓶中加水定容, 即得供试品
溶液。取上述供试品溶液 5 mL 于 10 mL 量瓶中, 按
标准曲线项下从“先加 5% NaNO 2溶液 0. 3 mL”起
同法操作,测定其吸光度并计算总黄酮含量。
2. 3　提取工艺研究: 多数黄酮由于不易溶于冷水,
水很难透过细胞壁将总黄酮溶解出来, 所以用水直
接提取得率比较低。纤维素酶可以用来破解细胞壁,
然后用水回流提取, 可提高提取效率。
　　称取干燥竹叶 20 g ,装入烧瓶中,按固液比 1∶
16 加水。加入催化剂 ZnCl2 , M gCl 2, MnCl2 各 0. 2
g。因素水平见表 1, 结果见表 2。
表 1　因素水平表
Table 1　Factors and levels
水平 因　　素
A 提取温度/℃ B pH 值 C酶用量/ g D 反应时间/ h
1 40 3. 5 0. 1 0. 5
2 50 4. 5 0. 2 1. 0
3 60 5. 5 0. 3 1. 5
表 2　L9( 34)正交试验结果
Table 2　Results of L9( 34) orthogonal test
实验号 A B C D 吸光度
1 1 1 1 1 0. 697
2 1 2 2 2 0. 789
3 1 3 3 3 0. 749
4 2 1 2 3 0. 946
5 2 2 3 1 0. 974
6 2 3 1 2 0. 860
7 3 1 3 2 0. 749
8 3 2 1 3 0. 801
9 3 3 2 1 0. 706
K 1 2. 235 2. 392 2. 358 2. 377
K 1 2. 781 2. 564 2. 441 2. 399
K 1 2. 256 2. 316 2. 473 2. 496
R 0. 546 0. 248 0. 116 0. 119
　　可知竹叶以酶处理的最佳条件为:反应温度 50
℃, pH 4. 5,酶 0. 3 g ,反应时间 1. 5 h。
　　分别用酶处理过的竹叶和未处理的竹叶进行对
比试验, 用水提取,物料比为 1∶16,提取 3次,合并
提取液,测定总黄酮, 结果酶处理组总黄酮的 A 值
为 0. 951,未处理组为0. 770 ( n= 3) ,经 t检验,两者
·166· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 2 期 2004年 2月
X 收稿日期: 2003-04-05
的黄酮含量差异具有显著性( P< 0. 001)。
3　讨论
　　植物药的细胞壁是由纤维素构成,植物的有效
成分往往被包裹在细胞壁内。纤维素由 B-D-葡萄糖
以 1, 4-B-葡萄糖苷键连结, 用纤维素酶酶解可以破
坏 B-D-葡萄糖键, 使细胞壁破坏。实验中经过纤维
素酶处理后再进行水回流提取, 总黄酮含量比直接
水提提高 23. 5%, 这可能是由于纤维素酶可充分破
坏竹叶以纤维素为主的细胞结构。
　　植物中总黄酮的含量测定方法大多是采用提取
液直接经显色反应后测定吸光度,然后计算含量。本
实验对竹叶总黄酮的含量测定方法做了改进,提取
液经过聚酰胺树脂纯化后再显色测定。提取液经过
聚酰胺柱, 水洗可以去除极性大的杂质,如糖类、多
酚类等,使显色反应干扰减小,从而使测得的总黄酮
含量准确度提高。
References:
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and it s capacity to s cavenge act ive oxygen radicals [ J] . J
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f lavonoid con tent and ant i f ree radical active of the leaves of
bamboo, Phyl lostachy s nig ra, and Ginkgo bi loba [ J] . Ch ina J
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[3]　Xing X F, M a J Y, Yu H F, e t al. Applicat ion of cellulas e in
ext ract ion of total f lavonoid of Rad ix P uerariae [ J] . Chin
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[4]　M a T T . Primary study of cellulase appl ied in Chinese drugs
ext ract ion [J ] . Chin T rad it H er b Drug s (中草药) , 1994, 25
( 3) : 123.
灵芝、香菇、黄芪、枸杞提取物中多糖的含量测定
张　立, 马　琼,何永利,张朋涛X
(西安高科实业股份有限公司天诚医药生物工程分公司, 陕西 西安　710075)
　　研究发现许多药用植物及真菌的多糖成分具有
独特的生物活性: 香菇多糖有抗肿瘤作用, 灵芝多糖
有调血糖和抗衰老的作用,枸杞多糖能提高机体免
疫力并能抗衰老, 黄芪多糖有双向调节血糖的作用。
苯酚-硫酸法是比较经典的多糖含量测定方法, 本实
验优化了显色条件,统一了样品处理条件, 同时测定
了灵芝、香菇、黄芪、枸杞提取物中多糖含量,得到了
稳定的检测结果。
1　仪器与试药
UV—2101PC 紫外-可见分光光度计 (日本岛
津) , KQ—250超声波清洗仪(昆山淀山湖仪器厂)。
　　葡萄糖等为分析纯,水为蒸馏水,灵芝、香菇、黄
芪、枸杞提取物由本公司提供。
2　方法与结果
2. 1　标准曲线制备: 精密称取 105℃干燥至恒重的
葡萄糖对照品约 50 mg 于 50 mL 量瓶中,加水溶解
并加至刻度。分别精密移取该溶液 1. 0, 2. 0, 3. 0,
4. 0, 5. 0 mL 于 50 mL 量瓶中,加水稀释并加至刻
度。各取 1. 0 mL 于25 mL 具塞刻度试管中,分别加
入 5%苯酚溶液 1. 0 mL,摇匀,加入5. 0 mL 浓硫酸
(加入浓硫酸时, 勿沿壁加入, 应将移液管口悬于试
管口,使浓硫酸垂直冲入液面) , 立即摇匀。沸水浴加
热 10 min,冰水浴冷却, 放至室温, 以蒸馏水同法做
空白参比, 在 485 nm 处测吸光度( A )。以 A 为横坐
标, 浓度为纵坐标,绘制标准曲线,得线性方程 Y =
94. 9X , r= 0. 998 8。线性范围: 20～120 Lg / mL。
2. 2　供试品溶液的制备: 精密称取提取物约 200
mg, 置 100 mL 量瓶中。按 200 mg 加入 100 mL 的
比例,计算并加入 80%乙醇溶液, 超声振荡 2 h。放
置至室温,滤过, 弃去滤液,用 80%乙醇溶液洗涤残
渣 3次。将残渣连同滤纸一同移入原 100 mL 量瓶
中, 加入沸水共约 80 mL, 超声振荡 1 h,放置至室温
定容,摇匀,滤过, 取续滤液 5. 0 mL 于 50 mL 量瓶
中(适于含量 10%～60%的样品, 对于含量过低或
过高样品,应适当改变移取体积) , 加水定容, 即得。
2. 3　精密度试验: 分别精密吸取 4种供试品溶液
1. 0 mL 于 25 mL 具塞试管中,依 2. 1 项下方法显
色,测定 A 值,求得其 RSD分别为 0. 78%, 0. 54% ,
1. 03%, 0. 62% ( n= 5)。
2. 4　显色稳定性:将 4种供试品溶液完成显色后, 2
h 内连续测定, 得其 A 值为一定值不变。
2. 5　重现性试验:取 4品种供试品, 分别精密称取
5份, 制备供试品溶液并测定多糖含量, 结果灵芝、
香菇、黄芪、枸杞多糖的含量分别为 13. 87% ,
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X 收稿日期: 2003-04-08