全 文 ：西红花酸对缺糖缺氧心肌细胞损伤的保护作用
饶淑云,钱之玉a
(中国药科大学 药理教研室,江苏 南京　210009)
摘　要: 目的　观察西红花酸 ( cro cetin) 对缺糖缺氧心肌细胞损伤的保护作用。方法　采用氰化钠和灌封高纯氮
气两种缺氧方法和低糖培养, 造成心肌细胞缺糖缺氧损伤, 测定其细胞培养液中乳酸脱氢酶 ( LDH)、肌酸激酶
( CK ) 的活力及心肌细胞中脂质过氧化产物丙二醛 ( MDA ) 的含量来观察西红花酸对心肌细胞的保护作用。结果
1×10- 6, 1×10- 7 mo l/ L 西红花酸能显著降低缺糖缺氧心肌细胞 MDA 的含量以及 LDH、CK 的活性。结论　西红
花酸对缺糖缺氧损伤的心肌细胞具有显著的保护作用。
关键词: 西红花酸; 心肌细胞; 缺氧; 丙二醛
中图分类号: R286. 2　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2004) 04 0427 03
Cardioprotective effect of crocetin against low glucose and hypoxia
injury in cultured rat cardiac myocytes
RAO Shu-yun, QIAN Zhi-yu
( Depar tment o f Pharmacolog y, China Pharmaceutical Univ ersity, Nanjing 210009, China )
Key words : crocet in; cardiac myocytes; hypoxia; MDA
　　西红花酸属类胡萝卜素类化合物,具有不饱和
共轭多烯酸结构, 是西红花的有效成分之一,文献报
道西红花酸具有抗肿瘤[ 1]、抗动脉粥样硬化[ 2]等多
种药理作用, 本实验室一直致力于从中药栀子中提
取分离西红花酸 ( crocet in) 及其药效机制研究,研
究发现西红花酸体外具有抗氧化作用[ 3] , 可增加冠
脉血流量,整体动物实验发现西红花酸可改善心肌
供血供氧,缩小通过组织化学法所显示的梗死区,对
异丙肾上腺素所致急性心肌缺血有保护作用[ 4] ,对
大鼠、犬由冠脉结扎引起的心肌缺血具有很好的保
护作用。本研究采用原代培养的乳鼠心肌细胞观察
西红花酸对缺糖缺氧心肌细胞损伤的保护作用。
1　材料
1. 1　药物与试剂:西红花酸,本实验室精制,含量>
90% ( HPLC 测定)。氰化钠, 中国药科大学库房提
供; 胰蛋白酶 ( T ypsin 1∶250, 上海生工生物工程
公司) ; DMEM 培养基 ( Gibco) , 高糖型和低糖型;
所用培养基均加双抗 (青霉素、链霉素各 100 U/
mL ) ; 5-溴-2-脱氧脲嘧啶 ( 5-br omo-2-deoxyuri-
dine, Sigma) ; 噻唑蓝 ( M T T, Amresco ) , 小牛血清
(杭州四季青生物工程材料有限公司)。丹参注射液
( 15 g / 10 mL, 批号 0204232,正大青春宝药业有限
公司 ) ; 葛根 素 注射 液 ( 100 mg / 2 mL, 批 号
0209171, 广东省大日生物化学药液有限公司) ;乳酸
脱氢酶 ( LDH) ,肌酸激酶 ( CK) 和丙二醛 ( MDA)
测试盒由南京建成生物工程研究所提供。
1. 2　动物: 新生 1～3 d 的 SD 乳鼠 30 只,由中国
药科大学动物房提供。
2　方法
2. 1　乳鼠心肌细胞的分离培养[ 5 ] : 新生 1～3 d 乳
鼠表面皮肤酒精消毒后, 开胸剪取心室放入平皿, 用
PBS 缓冲液反复清洗 3 遍, 剪成约 1 mm 3组织块,
放入三角瓶, 加入 8～10 mL 0. 1% 胰蛋白酶,磁力
搅拌器上 37 ℃ 水浴消化 10 m in,重复 6～8 次, 收
集各次离心下来的细胞, 加入 15% 小牛血清
DMEM 培养基, 100 mL 培养瓶 37 ℃ 孵箱中孵育
1. 5 h, 然后吸出心肌细胞悬液离心(非心肌细胞先
贴壁) ,加入含 15% 小牛血清 DMEM 培养基和 5-
溴-2-脱氧脲嘧啶 (终浓度为 0. 1 mmol / L ) ,调整细
胞浓度为 106 / mL,接种到 24 孔板, 每孔 1 mL; 96
孔板, 每孔 200 LL; 小培养瓶, 每瓶 3 mL; 继续培
养, 48 h 后细胞贴壁, 更换培养基为含 1% 小牛血
清 DMEM ,以后每 2天换1次液, 培养 4 d后实验。
2. 2　对氰化钠造成心肌细胞损伤的影响 [ 6] : 心肌细
·427·中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 4 期 2004年 4月
a 收稿日期: 2003-08-05作者简介:饶淑云( 1978—) ,女,江西南城人,在读硕士研究生,主要从事生化药理研究。
T el: ( 025) 83271322　E-m ail : raoshu yun@ hotmail. com
* 通讯作者　
胞悬液接种到 24孔板, 每孔 1 mL, 4 d 后开始造
模,分 6 组,每组 6孔。正常组 ( 1 mL 高糖 DMEM
培养基) ; 模型组和给药组加氰化钠, 终浓度为 5
mmol/ L , 模型组 ( 0. 9 mL 低糖 DMEM 培养基) +
0. 1 mL 50 mmol/ L NaCN) ; 西红花酸高、中、低剂
量组 ( 0. 8 mL 低糖 DMEM 培养基+ 0. 1 mL 50
mmol/ L NaCN + 0. 1 mL 1×10- 5 , 1×10- 6 , 1×
10
- 7
mol/ L 西红花酸) ,西红花酸终浓度分别为 1×
10
- 6
, 1×10- 7 , 1×10- 8 mo l/ L ; 阳性药丹参注射
液[ 7]组 ( 0. 8 mL 低糖 DMEM 培养基+ 0. 1 mL 50
mmol/ L NaCN+ 0. 1 mL 1. 5 g / L 丹参注射液)。24
h 后用分光光度法测定细胞上清液中 LDH、CK 活
力及细胞内 MDA 含量。
2. 3　氰化钠损伤的心肌细胞 MTT 实验: 心肌细胞
悬液接种到 96 孔板,分 6 组, 每组 8 孔, 分组及药
物处理同 2. 2项。另设无细胞空白组,消除培养基对
吸光度的影响。24 h后每孔加入 20 LL MTT ( 5 g/
L ) ,继续培养 4 h, 小心吸出细胞上清液, 加入 200
LL DMSO 裂解, 15m in后于 570 nm 波长处酶联免
疫仪上测定各孔吸光度 ( A ) 值。
2. 4　对高纯氮气密封致心肌细胞损伤的影响[ 7] :心
肌细胞悬液接种到 25 mL 培养瓶中,培养 4 d 后开
始实验。缺糖 DMEM 培养基预先通高纯氮气
( 99. 999%, 南京五十五动力气体公司提供) 0. 5 h,
备用。实验分 6组,每组 6瓶,正常组加 2 mL 高糖
DMEM 培养基;模型组加入 2 mL 氮气饱和的低糖
DMEM 培养基;西红花酸高、中、低剂量组分别加入
1. 8 mL 氮气饱和的低糖 DMEM 培养基和 0. 2 mL
1×10- 5 , 1×10- 6, 1×10- 7 mol/ L 西红花酸 (终浓
度分别为 1×10- 6 , 1×10- 7 , 1×10- 8 mo l/ L ) ; 阳性
药组加入 1. 8 mL 氮气饱和的低糖 DMEM 培养基
和 0. 2 mL 10 g / L 葛根素注射液[ 8] (终浓度为 1 g/
L )。除正常组外其余各组加药后再充高纯氮气 30
s,密封瓶口造成细胞缺糖缺氧。6 h 后取细胞培养
上清液测定 LDH, CK 活力及细胞内 MDA 含量。
3　结果
3. 1　对氰化钠损伤心肌细胞生化指标的影响: 结果
见表1。与正常组比较,模型组细胞 MDA 含量增加
( P < 0. 05) , LDH, CK 外漏显著增加 ( P < 0. 01) ,
说明模型组细胞损伤严重。西红花酸高、中剂量组中
LDH, CK 外漏减少 ( P< 0. 05) , MDA 含量降低。
3. 2　MTT 实验结果:见表 2。结果表明,与模型组
比较,西红花酸高、中剂量组及丹参组吸光度值均有
显著增加 ( P< 0. 05, 0. 01)。
表 1　西红花酸对氰化钠损伤的心肌细胞 LDH, CK
外漏和细胞 MDA 含量的影响 ( x±s, n= 6)
Table 1　Ef fect of crocetin on leakage of LDH, CK,
and MDA content in cardiac myocytes
injured by NaCN ( x±s, n= 6)
组　别 剂量
/ ( mol·L - 1)
LDH
/ ( U·L - 1)
CK
/ ( U·mL- 1)
M DA
/ ( nmol·mg- 1)
正常 - 100. 33± 8. 07* * 3. 08±0. 66* * 2. 74±0. 06*
模型 - 207. 36±17. 27 8. 91±1. 40 3. 17±0. 25
西红花酸 1×10- 6 172. 13±20. 07* * 5. 90±0. 95* * 2. 76±0. 16*
1×10- 7 163. 66±24. 84* * 5. 94±0. 82* * 2. 77±0. 31
1×10- 8 217. 39± 5. 06 6. 77±1. 91 2. 82±0. 19
丹参 0. 15 g / L 141. 81±27. 13* * 6. 55±1. 08* * 2. 95±0. 16
　　与模型组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
　　* P < 0. 05　* * P < 0. 01 v s m odel group
表 2　氰化钠损伤心肌细胞 MTT 实验结果 ( x±s, n= 8)
Table 2　Results of MTT assay of cardiac myocytes
injured by NaCN ( x±s, n= 8)
组　别 剂量/ ( mol·L- 1) A
正常 - 0. 18±0. 02*
模型 - 0. 14±0. 03
西红花酸 1×10- 6 0. 22±0. 09*
1×10- 7 0. 20±0. 04* *
1×10- 8 0. 16±0. 04
丹参 0. 15 g/ L 0. 25±0. 05* *
　　与模型组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
　　* P < 0. 05　* * P < 0. 01 v s m odel group
3. 3　心肌细胞生长状态的观察:分离下来的心肌细
胞孵育 48 h 后更换为 1% 血清的培养基可见细胞
的生长情况,心肌细胞贴壁后逐渐展开,形态多样,
从圆形到梭形, 三角形,星形, 多角形,此时可见单个
细胞搏动,频率较快,不一致, 90～120 次/ min,然后
多个临近的细胞伸出的伪足交联成细胞簇,单个细
胞搏动转变为细胞簇搏动, 最后多个细胞簇同步搏
动,频率 30～50 次/ m in。
3. 4　西红花酸对高纯氮气密封造成心肌细胞损伤
生化指标的影响:结果见表 3。高、中剂量西红花酸
能够显著降低 LDH, CK 的外漏及 MDA 的生成。
4　讨论
4. 1　心肌细胞培养方法:乳鼠心肌经胰酶消化下来
的细胞除了心肌细胞,还有很多杂细胞,主要包括成
纤维细胞和内皮细胞,本实验采用差速贴壁的方法,
同时在心肌细胞培养开始的 48 h 加入含终浓度为
0. 1 mmo l/ L 的 5-溴-2-脱氧脲嘧啶 ( 5-Brdu) [ 6, 9～11]
的 15% 血清培养基培养, 48 h 后更换为含 1% 小
牛血清的培养基培养。15% 血清有利于心肌细胞贴
壁, 加入 5-Brdu 的目的是用来抑制成纤维细胞的
增殖,提高心肌细胞的纯度; 48 h 后 15% 血清培养
·428· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 4 期 2004年 4月
表 3　西红花酸对低氧损伤的心肌细胞 LDH, CK
外漏和细胞 MDA 含量的影响 ( x±s, n= 6)
Table 3　Ef fect of crocetin on leakage of LDH, CK,
and MDA content in cardiac myocytes
injured by hypoxia ( x±s, n= 6)
组　别 剂　量
/ ( mo l·L- 1)
LDH
/ (U·L- 1)
CK
/ ( U·mL - 1)
MDA
/ ( nmo l·mg - 1)
正常 - 113. 85±30. 17* * 2. 12±0. 92* * 1. 48±0. 08* *
模型 - 370. 65±65. 85 9. 78±1. 75 2. 39±0. 07
西红花酸 1×10- 6 183. 43±38. 15* * 6. 15±0. 76* * 2. 03±0. 05* *
1×10- 7 290. 96±47. 50* 7. 14±1. 08* 2. 08±0. 13* *
1×10- 8 381. 40±66. 46 7. 91±1. 52 2. 15±0. 35
葛根素 1 g/ L 282. 10±63. 90* 6. 10±1. 94* * 2. 01±0. 12* *
　　与模型组比较: * P< 0. 05　* * P < 0. 01
　　* P < 0. 05　* * P< 0. 01 v s model group
基更换为 1% 血清培养基[ 10]是为了防止 15% 血清
刺激成纤维细胞的增殖,也防止无血清培养基促进
心肌细胞凋亡 [ 11]。同时心肌细胞培养的时间不宜过
长,一般培养 3～4 d 可见心肌细胞成簇搏动,即可
开始造模。目前部分文献仅采用差速贴壁的办法提
高心肌细胞的纯度,这是值得商榷的。
4. 2　缺氧缺糖模型:心肌是体内摄氧量最高的组
织,这一特点决定了心肌细胞对各种能引起心肌缺
血缺氧的因素特别敏感,而短时间急剧缺血缺氧比
长时间持续轻度缺氧更易造成心肌损伤。本实验选
用两种方法造模, 用 5 mmo l/ L 氰化钠阻断呼吸链
缺糖培养 24 h 造成心肌细胞化学性缺氧损伤, 另外
采用传统方法灌封高纯氮气,密封培养,使细胞氧分
压过低,同时缺糖培养 6 h 造成损伤。结果发现西红
花酸对化学性缺氧和生理性缺氧损伤的心肌细胞都
具有一定的保护作用。
4. 3　MTT 实验结果可以反应活细胞及琥珀酸呼
吸链的状态, 结果表明西红花酸高、中剂量组细胞活
性与模型组比较显著增加,说明西红花酸对氰化钠
造成的心肌细胞损伤有一定保护作用。
心肌细胞富含氧化酶,当心肌细胞因缺血缺氧
受到损伤时, 膜的完整性遭到破坏, 细胞通透性增
加,胞内的酶外漏, 测定细胞培养上清液中 LDH,
CK 水平能反应细胞损伤的程度。本实验两种方法
造成心肌细胞缺糖缺氧损伤, 模型组 LDH , CK 释
放增加,与正常组比较差异极显著,表明细胞损伤严
重,而西红花酸 1×10- 6 , 1×10- 7 mol/ L 能够显著
降低 LDH , CK 的外漏,说明西红花酸对损伤心肌
细胞有一定保护作用。MDA 是体内氧自由基攻击
生物膜脂质过氧化的产物, 测定细胞内 MDA 含量
能够间接反应细胞损伤程度, 结果显示西红花酸
1×10- 6 mo l/ L 能显著降低 MDA 含量, 推测药物
具有抗自由基[ 12]和稳定细胞膜的作用。
实验分别采用了两种常用的药物丹参和葛根素
作为阳性对照, 结果显示西红花酸减少 MDA 的含
量比丹参强,减少 LDH、CK 的外漏与丹参、葛根素
相当,但西红花酸的使用剂量小于这两种药物,该结
果提示西红花酸有可能成为一种高效低毒的心血管
药物,其深入的作用机制正在研究。
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