全 文 ：但将该甲醇水溶液进制备色谱, 不能将茶氨酸分离
出来。
3. 3. 2　萃取:在前处理过程中若不用被水饱和的氯
仿萃取 1次, 原料中咖啡因、可可豆碱等将会干扰后
面的分离纯化。被水饱和的氯仿萃取后,不仅能将咖
啡因、可可豆碱萃取一大部分,而且茶氨酸没有损失。
3. 4　进样量的选择: 约1 g 茶叶提取物用 20 mL 去
离子水处理, 每次进样 1. 5 mL,分离效果很好,但制
备量偏小,上柱量不足 20 mg ;当进样 2 mL,突破了
检测极限, 不能准确收集产品。将 20 mL 水溶液浓
缩至10 mL 左右,每次进样 2 mL,上柱量约 50 mg,
不影响分离度, 纯度亦符合质量要求 ( 98%,
HPLC)。且根据分析色谱仪对相应收集液进行跟踪
检测,可知Ⅲ部分为目标物茶氨酸的收集液(图 2)。
3. 5　制备柱的清洗与再生:原料经水提、萃取、浓缩
离心等预纯化,尽管将茶氨酸的含量大幅提升, 但溶
液中仍含有一些杂质, 如咖啡因、可可豆碱等,在进
行 HPLC 分离时, 杂质亦同步进入制备柱中, 且在
制备流动相条件下无法完全被洗脱。这不仅严重损
害柱寿命,而且影响下一次分离效果。因此,必须在
每次分离纯化后用约 150 mL 分析纯乙腈冲洗制备
柱,然后再用甲酸水溶液平衡色谱柱,进行下一次的
分离纯化。
3. 6　粗产品纯化条件的优化:收集到的溶液,经冷冻
干燥后,得淡黄色的粉末状晶体。面积归一化法定量,
其纯度为98%以上。但采用外标法, 其纯度仅为 90%
左右。于是对粗产品进一步纯化条件进行了探讨。
　　粗产品溶于水用活性炭进行处理后, 发现淡黄
色溶液变得澄清,但茶氨酸被活性炭强烈吸附,吸附
率为 35%,故用活性炭处理不可取。
茶氨酸易溶于水,不溶于甲醇、乙醇等。通过考
察茶氨酸在甲醇、乙醇中的溶解情况表明,茶氨酸在
二者中仅一小部分被溶解(约 3% )。采用甲醇超声,
离心得白色粉末状晶体, 经外标法分析, 其纯度为
98%以上,且得率在 95%以上。
4　结论
　　本实验建立的茶氨酸对照品的分离纯化方法通
过原料预纯化, HPLC 分离制备, 结晶过程,能得到高
收率、高纯度的茶氨酸对照品, 且该方法具有生产周
期短,产品质量高,方法简便,生产费用低廉等特点。
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超临界CO2流体萃取迷迭香中抗氧化活性成分的工艺研究
黄纪念1, 2 ,屠鹏飞1* ,蔡同一2

( 1. 北京大学药学院,北京　100083; 2. 中国农业大学食品学院, 北京　100094)
摘　要:目的　考察影响超临界CO 2流体萃取迷迭香中抗氧化物质的因素。方法　采用正交试验设计,以两级萃取
物中主要抗氧化活性成分鼠尾草酸含量作为考察指标, 对影响超临界 CO2 流体萃取鼠尾草酸工艺的因素进行研
究。结果　得到了萃取鼠尾草酸的最佳工艺条件。一级分离的最佳试验工艺条件为: 萃取压力 40 MPa、萃取温度 55
℃、分离压力 5 MPa、分离温度 70 ℃;二级分离的最佳试验工艺条件为:萃取压力 20 MPa、萃取温度 75 ℃、分离压
力 15 MPa、分离温度 80 ℃。结论　超临界 CO2 流体萃取技术可用于迷迭香中抗氧化成分鼠尾草酸的提取。
关键词: 迷迭香;超临界 CO 2流体萃取; 鼠尾草酸;高效液相色谱
中图分类号: R284. 2; R286. 02　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2004) 02 0150 04
·150· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 2 期 2004年 2月

收稿日期: 2003-04-11作者简介:黄纪念( 1971—) ,男,河南省汝南县人,在读博士生,研究方向为天然抗氧化剂。E-mail : h jinian@ sohu . com
* 通讯作者　Tel: ( 010) 62091702　Fax: ( 010) 62092750
Study on active components of antioxidant from Rosmarinus off icinalis
by supercritical CO2 fluid extraction
HUANG Ji-nian
1, 2, TU Peng-fei
1 , CAI Tong-y i
2
( 1. Schoo l o f Pharmaceut ical Sciences, P eking Univ ersity, Beijing 100083, China;
2. Food Co llege , China Agr icultur al U niver sity , Beijing 100094, China)
Abstract: Object　To study the conditions for the ex t ract ion of act iv e components o f antiox idant in
Rosmarinus of f i cinal is L. by supercr it ical CO 2 fluid ex tract ion ( SFE-CO 2) . Methods　Condit ions fo r the
ext ract ion w er e studied by or thogonal test design by the content o f carno sic acid in the tw o gr ade ex tr act as
index . Results　The opt im ized conditions fo r the y ield of carnosic acid w ere established. The best SFE
condit ions w er e: for separat ion Ⅰ, ext ract ion pressure 40 M Pa, ext ract ion temperature 55 ℃, separ ation
pr essure 5 M Pa, separat ion temperature 70 ℃; fo r separ ation Ⅱ, ex tr act ion pressure 20 M Pa, ext raction
temperature 75 ℃, separat ion pr essure 15 M Pa, separat ion temperature 80 ℃. Conclusion 　T his method
is suitable to the ex tr act ion of antiox idant component car nosic acid from R. of f icinal is by SFE-CO 2 .
Key words : Rosmarinus of f icinalis L. ; supercrit ical CO2 f luid ex t ract ion; carno sic acid; HPLC
　　迷迭香 Rosmar inus of f icinalis L. 系唇形科迷
迭香属植物。本品原系香料植物,其成分主要有二萜
类、黄酮类、三萜类化合物和精油, 现已广泛应用于
食品、药品、化妆品及日用品等方面 [ 1]。其二萜酚类
成分具有明显的抗氧化、抗肿瘤、抗艾滋病毒及抗微
生物等活性, 其中尤以鼠尾草酸的活性较强 [ 2～4]。
　　迷迭香中抗氧化物质的提取方法很多,如己烷、
乙醇、甲醇、丙酮提取等,水蒸气蒸馏、分子蒸馏法也
被采用。但这些方法有的会有有机溶剂残留,对人体
有害,有的不能理想地控制提取的香气、味道及抗氧
化能力,对产品质量不利。超临界流体萃取技术( su-
percritical f luid ex tr act ion, SFE)由于其成本低、无
有机溶剂残留、无污染、节约能源、操作简便、环保等
优点, 已在天然抗氧化剂的提取分离方面得到广泛
应用。SFE应用于迷迭香抗氧化剂的提取及抗氧化
有效成分的定量研究, 近几年国外已有少数文献报
道[ 5～ 7] ,但国内还未见研究报道。本实验以鼠尾草酸
为指标,研究了影响超临界 CO 2流体萃取迷迭香中
抗氧化活性成分的因素,为迷迭香的进一步开发利
用提供参考。
1　仪器材料
1 L SFE 超临界流体萃取设备(广州市轻工研
究所制造) ; 高效液相色谱仪: Agilent 1100系列,
G1315B DAD 检测器, G1313A ALS 自动进样装
置。鼠尾草酸对照品(自制, 纯度为 96. 4% , HPLC
法, 230 nm )。乙腈(色谱纯) ,三氟乙酸(分析纯) ,水
为双蒸水。迷迭香 Rosmarinus of f i cinalis L.的嫩茎
叶由云南玉溪迷迭香种植基地提供,经北京大学药
学院屠鹏飞教授鉴定。
2　方法
2. 1　超临界 CO 2 流体萃取工艺: 本实验采用二级
分离工艺。将粉碎至一定粒径的迷迭香粉末(各条件
下均为 200 g )装入萃取釜,对 SFE 系统加热, 当温
度达到预定温度时, 打开 CO 2 气瓶送气, 当压力达
到预定压力时, 开始循环萃取,先用 10 MPa、40℃、
2 h 把精油萃出后,再次调节温度、压力、流量, 并加
入一定量夹带剂, 恒温恒压萃取一定时间, 从一、二
级分离釜出料, 通过真空旋转蒸发去掉夹带剂,分别
获得一、二级萃取物。
2. 2　鼠尾草酸含量的 RP-HPLC法测定
2. 2. 1　色谱条件: 色谱柱: CAPCELL PAK C18 ,
ACR ( 150 mm×4. 6 mm, 5
m, 连接预柱) ; 流动
相: 乙腈-0. 1%三氟乙酸( 52∶48) ; 检测波长: 230
nm ;柱温: 30 ℃; 流速: 1 mL/ min。
2. 2. 2　对照品溶液的制备:精密称取鼠尾草酸 1. 0
mg, 置于 10 mL 棕色量瓶中, 加乙腈至刻度, 超声波
混匀,得 0. 1 mg / mL 对照品溶液。
2. 2. 3　供试品溶液的制备:精密称取迷迭香超临界
萃取物10. 0 mg ,置于10 mL 棕色量瓶中,加乙腈至
刻度, 超声波混匀, 用微孔有机滤膜 ( 0. 45
m)滤
过,以滤过液作为待测供试品溶液。
2. 2. 4　标准曲线的制作:分别取 0. 1 mg / mL 鼠尾
草酸对照品溶液 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80
L, 测定相
应峰面积, 重复 3次, 以平均峰面积为纵坐标, 进样
量为横坐标, 制得标准曲线 Y= 1 808. 7X - 24. 312
( r= 0. 999 996)。结果表明, 鼠尾草酸进样量在
0. 2～8
g 时与峰面积呈良好的线性关系。
2. 2. 5　样品中鼠尾草酸含量的测定:分别吸取对照
品溶液和供试品溶液各 10
L, 注入液相色谱仪, 测
定峰面积,按外标法计算鼠尾草酸的含量, 重复 3
·151·中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 2 期 2004年 2月
次,求平均值。
3　结果与讨论
　　根据预实验结果和设备情况, 二级分离压力均
定为5 MPa,温度定为 50℃, 95%乙醇作为夹带剂,
用量为装料量的 40% ,萃取时间为 3 h, CO 2流量为
12 L/ h。选取萃取压力( A)、萃取温度( B)、一级分离
压力( C)、一级分离温度( D) 4个主要因素,设计了 4
因素3水平的正交试验,对迷迭香中的鼠尾草酸进
行超临界 CO 2流体萃取。因素水平见表 1,实验方案
及结果见表 2,方差分析见表 3。
表 1　正交试验设计中的因素水平
Table 1　Factors and levels of orthogonal test
水平 因　　素
A /M Pa B/℃ C / MPa D/℃
1 20 55 5 60
2 30 65 10 70
3 40 75 15 80
表 2　正交试验方案与结果分析
Table 2　Analytical results of orthogonal test
试验号 A B C D 一级分离得率/ % CA 含量/ %
二级分离
得率/ % CA 含量/ %
1 20 55 5 60 6. 67 31. 97 0. 09 0
2 20 65 10 70 3. 13 22. 27 1. 84 19. 36
3 20 75 15 80 0. 11 13. 95 3. 33 56. 11
4 30 55 10 80 3. 38 30. 49 1. 89 20. 52
5 30 65 15 60 0. 35 8. 40 5. 73 28. 98
6 30 75 5 70 8. 87 27. 94 0. 52 21. 46
7 40 55 15 70 1. 66 24. 03 2. 45 26. 09
8 40 65 5 80 2. 47 25. 75 0. 05 0
9 40 75 10 60 0. 28 27. 92 0. 77 22. 36

含量

一级分离
k1 22. 73 28. 83 28. 55 22. 76
k2 22. 28 18. 81 26. 89 24. 75
k3 25. 90 23. 27 15. 46 23. 40
R 3. 62 10. 02 13. 09 1. 99

含量

二级分离
k1 25. 16 15. 54 7. 15 17. 11
k2 23. 65 16. 11 20. 75 23. 30
k3 16. 15 33. 31 37. 06 25. 54
R 9. 01 17. 77 29. 91 8. 43
表 3　方差分析表
Table 3　Variance analysis
方差来源 方差平方和 自由度 F 值 P 值
一级解析
A 　 23. 38 2 3. 80
B 　151. 30 2 24. 57 P < 0. 05
C 　304. 91 2 49. 52 P < 0. 05
D(误差) 　　6. 16 2
二级解析
A 　139. 68 2 1. 29
B 　611. 95 2 5. 64
C 1 345. 31 2 12. 40
D(误差) 　108. 50 2
　　F0. 05( 2, 2) = 19. 00　F0. 01( 2, 2) = 99. 00
　　分析正交试验结果可知:对于一级萃取物, 影响
鼠尾草酸含量的 4因素中, 分离压力最大, 萃取温度
次之, 二者都达到了显著水平( P< 0. 05) ,萃取压力
和分离温度最弱,因此, 4 因素影响的大小顺序为:
分离压力> 萃取温度> 萃取压力> 分离温度,此时
最佳试验条件为 A 3B1C1D2 ,即萃取压力 40 MPa,萃
取温度 55 ℃,分离压力 5 MPa,分离温度 70 ℃。
　　对于二级萃取物, 4因素影响鼠尾草酸含量的
程度依次是: 分离压力> 萃取温度> 萃取压力> 分
离温度, 此时最佳工艺条件为 A 1B3C3D3 ,即萃取压
力 20 MPa, 萃取温度 75℃,分离压力 15 MPa, 分离
温度 80℃。此条件下得到的二级萃取物中鼠尾草酸
的含量在整个实验中是最高的, 达 56. 11%。这说
明,如果要得到鼠尾草酸含量高的萃取物,可以通过
适宜的条件,分级萃取获得。可以想象,如果再增加
分离级数如三级分离或四级分离,萃取物中鼠尾草
酸的含量会更高。
当然,萃取物中鼠尾草酸的含量高并不代表萃
取出来的鼠尾草酸多,因为鼠尾草酸的提取总量与
萃取物的得率也有关。理论上,萃取物中的鼠尾草酸
含量高, 萃取物得率又高, 则萃取出的鼠尾草酸就
多。实际情况并非如此。从本实验结果可以看出, 萃
取物中鼠尾草酸的含量高, 萃取物的得率并不一定
高,反之亦然。因此,如果以得到较多的鼠尾草酸为
目的,而不是想得到含鼠尾草酸较高的萃取物,则需
综合考虑萃取物的得率和萃取物中的鼠尾草酸的含
量两项指标。具体到本实验,鼠尾草酸的最高提取量
(即萃取物中鼠尾草酸的含量×得率×200 g ) 为
4. 96 g ,出现在 6号试验( A 2B3C1D 2)中,即萃取压力
30 MPa,萃取温度 75℃,分离压力 15 MPa, 分离温
度 70 ℃, 并不是萃取物中鼠尾草酸含量最高
( 56. 11% )的试验条件( A 1B3C3D3 ) , 因为此时萃取
物的得率较低( 3. 33%) , 鼠尾草酸的萃取量仅为
3. 74 g。
4　验证试验
·152· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 2 期 2004年 2月
　　选取上述最佳条件进行验证试验。在A 3B1C1D2
试验条件下, 一级萃取物中鼠尾草酸的含量为
35. 24% ( n= 3) ;在 A 1B3C3D 3条件下,二级萃取物
中鼠尾草酸的含量为 55. 90% ( n= 3)。由此证明上
述最佳试验条件是可信的。
5　结论
5. 1　无论是对一级分离还是二级分离, 4因素影响
萃取物中鼠尾草酸含量的大小顺序都是: 分离压
力> 萃取温度> 萃取压力> 分离温度。
5. 2　从正交试验结果可知,以萃取物中鼠尾草酸含
量为指标, 对于一级分离, 超临界 CO 2流体萃取迷
迭香中抗氧化活性成分的最佳试验工艺条件:萃取
压力 40 MPa、萃取温度 55 ℃、分离压力 5 MPa、分
离温度 70 ℃;对于二级分离,超临界 CO 2流体萃取
迷迭香中抗氧化活性成分的最佳试验工艺条件:萃
取压力 20 MPa、萃取温度 75℃、分离压力 15 MPa、
分离温度 80 ℃。
5. 3　通过两级分离,可使萃取物中的鼠尾草酸的含
量达到 56. 11%。如此高的含量为迷迭香中抗氧化
活性成分的进一步开发利用提供了依据。
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地黄在加工炮制过程中 HPLC谱图的变化
温学森1 ,杨世林2,马小军2,郑俊华3

( 1. 山东大学药学院, 山东 济南　250012; 2. 中国医学科学院 中国协和医科大学药用植物研究所,北京　100094;
3. 北京大学药学院,北京　100083)
摘　要: 目的　考察地黄在加工炮制过程中糖类成分的变化。方法　在加工炮制的 4 个不同阶段( 65 ℃烘焙 0, 1 和
6 d, 以及烘干样品切片后常压蒸制 4 h)取样,热水提取。色谱条件为: Sugar-pak-1型阳离子凝胶柱(柱温 80 ℃) ,水
为流动相(流速为 0. 7 mL / min) ,示差折光检测器检测。结果　鲜地黄中有 3 种主要成分,分别为水苏糖( 11%～
15% )、蔗糖( 0. 30%～0. 92% )和梓醇( 0. 27%～0. 88% )。经过加工炮制,不同阶段的 HPLC 色谱图发生了显著变
化。烘焙 1 d 后出现一个显著的单糖峰(保留时间为 10. 2 m in,推定为半乳糖) ,生地黄中该峰更加显著,同时出现了
棉子糖的色谱峰。熟地黄中,果糖和葡萄糖的色谱峰十分显著。结论　根据 HPLC 色谱图的变化, 认为在烘焙阶段,
鲜地黄中水苏糖发生了脱半乳糖反应, 而在炮制熟地黄时, 由于蒸制又发生了脱果糖反应。地黄加工炮制的主要目
的之一可能在于使水苏糖降解, 减轻胀气副作用。
关键词: 地黄;加工炮制; 高效液相色谱;水苏糖; 梓醇
中图分类号: R284. 1; R286. 02　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2004) 02 0153 04
HPLC chromatogram changes with processing for roots of Radix Rehmanniae
WEN Xue-sen
1 , YANG Shi-lin
2 , M A Xiao-jun
2 , ZHENG Jun-hua
3
( 1. Schoo l of Pharmaceutical Sciences, Shandong Univer sity , Jinan 250012, China; 2. Instit ut e of Medicinal Plant
Development, Chinese Academy o f Medical Sciences and Peking Union of Medical Colleg e, Beijing 100094,
China; 3. School of Pha rmaceutical Sciences, Peking Univer sity , Beijing 100083, China)
Abstract: Object　To invest igate the saccharide changes of Rad ix Rehmanniae when being pro cessed.
Methods　T he fresh roo ts w ere to rrefied at 65 ℃ and sampled at 0, 1, and 6 d. The samples and 4 h-
·153·中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 2 期 2004年 2月

收稿日期: 2003-05-22基金项目:国家自然科学基金重点资助课题( 39930220)