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甘草苷对四氯化碳肝脏毒性的保护作用
丁选胜 ,戴德哉
(中国药科大学 药理研究室 ,江苏 南京　 210009)
　　离体肝灌流技术最初由英国生理学家 Trow ell
于 1942年创立 , 1951年 Miller等人改进了灌流方
法 ,首次以此技术进行了血浆蛋白质合成的研究。近
年来 ,离体肝灌流技术得到普遍使用 ,被广泛用于药
理毒理学研究 ,适用于研究药物或化学物质引起的
肝毒性 [1 ]。本实验采用离体肝灌流技术 ,通过灌流一
定量的 CCl4造成肝脏毒性 ,同时给予一定量的甘草
苷 ,观察甘草苷对肝脏毒性的保护作用 ,据此分析甘
草解毒的物质基础及机制。
1　材料
1. 1　药品与试剂:甘草苷由本实验室分离纯化制
得 ,经 UV , IR, 1H-NMR, 13 C-NMR等结构测定与
文献报道甘草苷一致 , HPLC检测为单一成分 ,纯度
达到 98% 以上。 RPM I Medium 1640, GIBCO BRL
( Life Techno logies, Inc. Grand Island N. Y.
14072 U. S. A)。 AL T /GPT测试盒 ,南京建成生物
工程研究所 ,批号 20000908。 AST /GO T测试盒 ,南
京建成生物工程研究所 ,批号 20000909。
1. 2　仪器: SHZ— B水浴恒温振荡器 ,上海跃进医疗
器械厂。 BT03— 200恒流泵 ,河北保定兰格恒流泵有
限公司。 754型分光光度计 ,上海第三分析仪器厂。
1. 3　动物: SD大鼠 ,体重 200～ 250 g ,雌雄各半 ,
由南京医科大学实验动物中心提供。
2　方法
2. 1　离体大鼠肝灌流模型制备 [1 ]: 取健康大鼠 ,体
重 200～ 250 g,雌雄兼用 ,用 3% 戊巴比妥钠 0. 3
mL /100 g ip麻醉 ,将麻醉大鼠仰置手术板上 ,沿腹
部正中作工字型切口 ,翻开腹部两侧皮肤 ,将肠管推
向左侧 ,充分暴露肝门区域。用玻璃分离针分离出门
静脉 ,同时分离出肾静脉。 在离肝门及门下约 5～ 6
mm处分别用 2根线穿过门静脉底部 ,各扣一个松
节 ,用 1根线穿过肾静脉并从肾静脉注入 6% 肝素
钠 0. 1 mL /mg ,稍后关闭灌流泵 ,将离肝门远端下
约 6 mm处的线结扎 ,系紧门静脉 ,并同时结扎肾静
脉的线。 迅速在近端用手术剪剪一斜形切口 (防止
剪断 ) ,立即插入口径约 0. 5 mm塑胶管 ,深度约
3～ 4 mm ,经检查插管确已入门静脉 (塑胶管内有
血液进入 ) ,调节深浅合适后即行节扎 ,开动蠕动泵
剪断腹部下静脉 ,肉眼观察肝脏内血液基本冲洗将
尽时随后分离肝脏 ,以正常位置置肝脏于水浴恒温
37℃ 灌流杯 (防止门静脉扭曲 )。
2. 2　离体肝灌流:先以经过纯度> 99. 5% 氧气饱
和、水浴恒温 37℃ 的 Krebs-Henseleit等渗缓冲
液 ,非循环性的灌流冲洗肝脏中的血液。 流速约 2
mL /( g· min) ,灌至肝脏颜色呈土黄色 ,稳定 5 min
后 ,将塑胶管插入经过纯度> 99. 5% 氧气饱和、水
浴恒温 37℃ 的 RPM I-1640缓冲灌流液中 ,看到从
肝脏中流出液呈红色 ( 1640灌流液呈红色 ) 时 ,将
肝脏从盛 Krebs-Henselei t的杯中移至盛 1640灌
流液的杯中 ,循环性前向性的灌流 (顺流 ) ,流速约
2 mL /( g· min)。不同剂量的药物用严密消毒的注
射器缓慢注入盛 1640灌流液的杯中 ,分别在给药
·1122· 中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 12期 2003年 12月
收稿日期: 2003-04-15基金项目:江苏省教育厅自然科学基金资助课题 ( K JB360003)作者简介:丁选胜 ( 1962— ) ,男 ,安徽省广德人 ,博士 ,现在中国药科大学药学博士后流动站从事博士后研究工作。
Tel: ( 025) 3271270　 E-mail: dxs0162@ sina. com
前 ( 0 min)、给药后 15, 30, 60, 90 min取灌流液各
0. 5 mL放入消毒洁净的子弹头型试管中 ,并立即放
入冰箱冷藏待测 (用于测定 AST, ALT) ,同时立即
补入 1640灌流液 0. 5 m L。
2. 3　测定方法 [ 2]
2. 3. 1　 AST测定: 采用赖氏法 ,样品 0. 1 mL加
AST基质液 0. 5 mL,置 37℃ 水浴 60 min后 ,加
2, 4-二硝基苯肼液 0. 5 mL,置 37℃ 水浴 20 min,
加 0. 4 mol /L NaOH 5 mL混匀 , 10 min后 ,用 754
分光光度计于 520 nm以蒸馏水调吸光度零点 ,测
定各管的吸光度 ( A )值。
2. 3. 2　 AL T测定: 采用赖氏法 ,样品 0. 1 mL加
ALT基质液 0. 5 m L,置 37℃ 水浴 30 min后 ,加
2, 4-二硝基苯肼液 0. 5 mL,置 37℃ 水浴 20 min,
加 0. 4 mol /L NaOH 5 mL混匀 , 10 min后 ,用 754
分光光度计于 505 nm以蒸馏水调吸光度零点 ,测
定各管的 A值。
3　结果
3. 1　 CCl4对离体大鼠肝灌流中 AST, ALT的影
响:取健康大鼠 12只 ,体重 200～ 250 g ,雌雄各半 ,
分 2组: 1640灌流液 200 mL组 , CCl4 1. 0 mL (约
1. 06 g CCl4 ) /200 m L灌流液组 ,每组 6只。按上述
方法测定 AST及 ALT含量 ,结果见表 1。 1640灌
流液对肝脏基本无损伤 ,灌流液中加入 CCl4对肝脏
有极明显的损伤作用 ,该模型对有毒物质的反应是
敏感的。
3. 2　甘草苷对离体大鼠肝灌流中 AST, ALT的影
响:取健康大鼠 12只 ,体重 200～ 250 g ,雌雄各半 ,
分 2组: 1. 0 mL CCl4+ 30 mg甘草苷 /200 mL灌流
液组 , 1. 0 mL CCl4+ 60 mg甘草苷 /200 mL灌流液
组 ,每组 6只。 按上述方法测定 AST, ALT含量 ,
结果见表 1。由表 1可见 ,甘草苷对 CCl4造成的肝脏
损伤有明显保护作用 ,且呈一定的量效关系。
4　讨论
表 1　 CCl4及甘草苷对离体大鼠肝灌流中 AST,ALT的影响 ( x± s , n= 6)
Table 1　 Effects of CCl4 and liquiritin on contents of AST, ALT in isolated perfused liver of rats ( x± s , n= 6)
组　别
AST
0 min 15 min　 30 min　 60 min　 90 min
ALT
0 min 15 min　　 30 min　　 60 min　　 90 min　　
1640对照 4. 63±1. 08 6. 50± 1. 31 8. 63±1. 23 12. 70± 2. 64 16. 63±2. 51 5. 38± 1. 38 8. 55±1. 99 10. 42±2. 31 13. 72± 2. 73 15. 42±3. 08
CCl4 4. 82±1. 01 24. 42± 4. 38* * 48. 52±5. 19* * 74. 73± 3. 61* * 93. 65±2. 95* * 5. 87± 1. 15 32. 12±5. 18* * 47. 93±5. 83* * 64. 92± 5. 31* * 85. 23±9. 64* *
CCl4+ 甘草苷 ( 30 mg) 4. 45±0. 81 14. 98± 2. 14* # 31. 55±3. 08* * # 39. 75± 3. 99* * # 50. 77±3. 51* * # 5. 60± 1. 27 19. 53±2. 87* * # 28. 03±3. 66* * # 34. 55± 3. 07* * # 44. 58±2. 68* * #
CCl4+ 甘草苷 ( 60 mg) 4. 55±0. 64 11. 97± 2. 04* * # 20. 92±1. 82* * # 31. 05± 2. 81* * # 38. 37±3. 63* * # 5. 53± 1. 41 12. 78±2. 41* # 19. 62±2. 28* * # 26. 15± 2. 35* * # 33. 55±2. 66* * #
　　与 1640对照组比较: * P < 0. 01　* * P < 0. 001;　与 CCl4组比较: # P < 0. 001
　　* P < 0. 01　* * P < 0. 001 vs 1640 cont rol g roup;　# P < 0. 001 vs CCl4 group
　　甘草俗称“国老” ,能解百毒。但其解毒作用机制
尚不很清楚 ,可能有甘草甜素的吸附作用 ,甘草次酸
的肾上腺皮质激素样作用及类似葡萄糖醛酸的结合
解毒作用 ,以及药酶诱导、细胞膜稳定作用等。
本实验通过测定肝灌流液中释出的 AST 及
ALT,评价甘草苷对 CCl4造成的肝脏毒性的保护作
用。实验结果表明 , CCl4能极显著升高灌流液中 AST,
ALT含量 ,造成肝脏毒性。 CCl4为化学致毒物质 ,当加
入一定量的甘草苷时 ,升高的 AST, ALT显著降低 ,
说明甘草苷对肝脏毒性有明显保护作用。甘草苷为
甘草中有效成分 ,属黄酮类化合物。本研究结果从另
一角度揭示甘草解毒的物质基础及其解毒机制。
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London: CRC Press , 1991.
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电　话 (传真 ): ( 0833) 8811413　 13568248000　 13890355787
·1123·中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 12期 2003年 12月