全 文 ：铁皮石斛与绞股蓝原生质体融合的初步研究
魏小勇1, 张　铭2Ξ
(11 广州中医药大学基础医学院, 广东 广州　510405; 21 浙江大学生命科学学院, 浙江 杭州　310012)
摘　要: 目的　探索铁皮石斛与绞股蓝原生质体杂交融合, 为中药材的改良提供新途径。方法　两种原生质体通过
PEG 法进行成对融合, 融合子培养在添加BA 2 m göL 及NAA 1 m göL 改良的M S 液体培养基中。结果　分离得到
了高产量、活力强、纯度高的铁皮石斛及绞股蓝叶肉原生质体。结论　融合获得了有活力的杂种细胞, 培养 3 d 后,
杂种细胞开始分裂, 共进行了 3 次分裂。
关键词: 铁皮石斛; 绞股蓝; 原生质体; 融合; 细胞分裂
中图分类号: R 282113　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 07 0811 04
Protopla st fusion in D end robium cand idum and Gynos temm a p en tap hy llum
W E I X iao2yong1, ZHAN G M ing2
(11 Schoo l of Basic M edical Sciences, Guangzhou U niversity of T radit ional Ch inese M edicine, Guangzhou
510405, Ch ina; 21Co llege of L ife Scence, Zhejiang U niversity, H angzhou 310012, Ch ina)
Abstract: Object　To exp lo re the p ro top last fu sion of D end robium cand id um W all ex1 L indl1 and Gy 2
nostem m a p en tap hy llum 1 (T hunb) M ak ino1 M ethods　T he tw o k inds of p ro top lasts w ere fu sed by PEG
m ethod, and then cu ltu red in the modif ied liqu id m edium con ta in ing 2 m göL BA and 1 m göL NAA 1 Re-
sults　H igh yield, viab ility, and pu re m esophyll p ro top lasts w ere iso la ted from D 1 cand id um and G1 p en-
tap hy llum 1 Conclusion　T he first cell d ivision occu rres w ith in th ree days after fu sion1 A nd som e of the
cells are d ivided th ree t im es1
Key words: D end robium cand id um W all1 ex L indl1; Gy nostem m a p en tap hy llum (T hunb1) M ak ino;
p ro top lasts; p ro top last fu sion; cell d ivision
　　铁皮石斛 D end robium cand id um W all1 ex
L indl1 为兰科石斛属名贵中药材, 具有滋阴清热、生
津益胃、润肺止咳、明目强身等功效。现代药理研究
表明, 铁皮石斛含有石斛碱、石斛次碱、62羟基石斛
碱等 10 多种生物碱和多种多糖物质, 具有抗肿瘤、
抗衰老、增强机体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集
等作用, 因而铁皮石斛在中药复方和临床上被广泛
应用[1～ 6 ]。
绞股蓝 Gy nostem m a p en tap hy llum (T hunb1)
M ak ino 为葫芦科药用植物, 国内外学者从绞股蓝中
分离出 80 多种绞股蓝皂苷 (gypeno sides, GP) , 经
药理和临床研究表明绞股蓝具有抗疲劳、抗衰老、抗
溃疡、调血脂、提高免疫能力等功效, 还具有抑制原
癌基因的表达而抗肿瘤、抑制肝微粒体脂质氧化而
保肝、抑制血小板聚集和血栓素A 2、抑制胆石生成
等作用。同时具有副作用小、作用缓和等特点, 是近
年来, 国内外广泛开发利用的重要中药材[7, 8 ]。
本研究利用原生质体融合技术构建铁皮石斛与
绞股蓝远源杂交融合子, 进而培育具有双亲特性的
杂种细胞, 期望通过培养杂种细胞大规模生产两类
中药材的有效成分。
1　材料与方法
111　材料: 铁皮石斛原植株采自中国科学院广州植
物研究所 (叶秀嶙研究员提供并鉴定) , 将其种子培
养在 1ö2M S 培养基中诱导获得原球茎, 并诱导分化
成苗, 获得试管苗[5～ 6 ]。绞股蓝亦由中国科学院广州
植物研究所提供, 取幼嫩茎尖置于M S+ NAA 015
m göL + BA 110 m göL 培养基诱导获得愈伤组织,
在M S+ NAA 012 m göL + BA 011 m göL 培养基中
诱导获得试管苗[7, 8 ]。
112　方法
11211　铁皮石斛与绞股蓝原生质体分离与纯化: 分
·118·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 7 期 2004 年 7 月
Ξ 收稿日期: 2003210209
基金项目: 广东省中医药管理局资助项目 (402003, 303005) ; 广东省科委重点科技攻关课题 (99B07802)
作者简介: 魏小勇 (1969—)男, 湖南永州人, 讲师, 硕士, 主要从事中药生物工程研究。E2m ail: jidewow xy@ 163. com。
别取铁皮石斛与绞股蓝试管苗叶片, 自然萎蔫 4～ 8
h, 用尖头镊子撕去下表皮, 覆盖在高渗酶液中〔铁
皮石斛的酶处理液组成: 115% 纤维素酶O nozuka
R 210+ 1% 果胶酶 Pect inase (serva)R 210+ 015 mo lö
L 甘露醇+ 3 mmo löL M ES (吗啡啉乙磺酸) + 012
mmo löL CaC l2·2H 2O , pH 516, 用 0122 Λm 混合纤
维素微孔滤膜滤过除菌; 绞股蓝的酶处理液组成为:
210% 纤维素酶 R 210, 115% 果胶酶 R 210, 其余成分
同铁皮石斛〕, 温度为 (25±1) ℃, 在 5 röm in 的摇床
上, 黑暗中酶解4～ 6 h。
原生质体的分离纯化采用滤过2离心法: 用孔径
为 45 Λm 的钢丝网滤过酶处理液。将滤液悬浮于 4
mL 30% 的蔗糖溶液中, 在 500 röm in 下离心 5
m in, 用吸管吸取位于两溶液界面的原生质体。用洗
液 ( 015 mo löL 甘露醇 + 3 mmo löL M ES + 012
mmo löL CaC l2·2H 2O , pH 516)以 400 röm in, 离心 3
m in, 共 3 遍。
以血球记数板统计所收集的原生质体的密度,
并折算原生质产量 (每克鲜重供体组织解离出的原
生质体数量)。以 FDA (荧光素二醋酸酯) 检测原生
质体活力 (原生质活力= 染色原生质体数量ö观察原
生质体数量)。以荧光增白剂M 2R 检测原生质体脱
壁情况。原生质体产量及活力的测定均设 3 次重复,
每次重复统计 5 个视野, 统计细胞数不少于 500 个。
将分离得到的原生质体用 M S 培养基制成
112×105～ 215×105 个ömL 悬液, 于 315 cm 培养
皿中液体浅层培养。
11212　铁皮石斛与绞股蓝原生质体成对杂交融合:
分别将铁皮石斛与绞股蓝原生质体悬液加在消毒载
玻片上, 在培养皿中加入大滴 PEG 融合液 (30%
PEG6000 + 011 mo löL Ca (NO 3 ) 2 · 4H 2O + 015
mo löL 甘露醇) , 用微吸管分别从铁皮石斛与绞股蓝
原生质体悬液中吸一个原生质体, 释入融合液中使
之成对融合[9, 10 ]。在 (25±1) ℃下轻轻摇动培养皿,
镜下观察杂交融合过程。如此反复进行, 获得多对原
生质体融合体。用微吸管将逐对融合的原生质体加
以富集, 一起转移到前述洗液中洗涤 2 次, 再用改良
的M S 培养基 (添加BA 2 m göL 及NAA 1 m göL )洗
涤 1 次, 并移入该培养基中, (25±1) ℃黑暗中液体
浅层培养。以 FDA 显示融合体的活力。以单独培养
的双亲原生质体作对照。
2　结果与分析
211　铁皮石斛与绞股蓝原生质体分离及培养: 分离
得到了高产量、质量高、活力强、纯净的铁皮石斛与
绞股蓝试管苗叶肉原生质体。铁皮石斛原生质体产
量为鲜重 417×107 个ög , 相差显微镜下原生质体
呈圆形, 细胞均匀一致, 胞质中可见大量叶绿体, 且
大多位于质膜边缘, 颜色较深 (图 121)。FDA 染色,
荧光显微镜下活性原生质体发出明亮的黄绿色的荧
光, 表明其活性很好 (图 122) , 计算活力为 8913%。
用荧光增白剂检测原生质体脱壁完好。将分离制得
的叶肉原生质体制成 112×105～ 112×105 个ömL
的悬液, 分别进行液体浅层培养及固体培养, 结果,
固体培养的原生质体 2 d 开始变色, 细胞膜皱缩并
逐渐破碎死亡。液体培养条件下, 48 h 仍有 80% 的
活力, 72 h 开始再生细胞壁, 80 h 开始第 1 次分裂。
随后褐化死亡失去活力。
而绞股蓝的叶肉原生质体相对较易分离, 在静
止条件下, 即能获得活力较高的原生质体, 其产量为
鲜重 1102×108 个ög, 活力为 9312%。其形态与铁皮
石斛原生质体相比较, 差异较大: 体积小、颜色浅、胞
质中叶绿体分散、小而少 (图 123, 4)。培养 10 d 未见
分裂并死亡。
212　铁皮石斛与绞股蓝原生质体融合: 轻轻摇动融
合液, 在 PEG 诱导下, 可见原生质体接触、黏连, 然
后, 2 个原生质体发生猛地相向压缩, 继而原生质体
膜消失, 直至融为一体 (图 221) , 整个融合过程大约
6 m in, FDA 染色显示融合子具较强的活力。转入培
养基中培养 72 h 左右可见杂种细胞第 1 次分裂并
再生细胞壁 (图 222) , 细胞质变浓, 整个细胞显得更
饱满; 84 h 见第 2 次分裂形成 4 个细胞, 此时第 1 次
细胞分裂进入高潮, 但此时细胞团开始变形, 一侧微
凸 (图 223) ; 90 h 见第 3 次分裂形成 8 个细胞, 此时
2 次分裂细胞团一侧形成较长的突起 (图 224) , 可能
是细胞开始分化。而对照组跟前述培养情况一致。
3　讨论
原生质体融合技术能使遗传基因高频率重组,
克服杂交不亲和性, 从而将植物中药有效成分的基
因在不同种属间相互转移, 从而集双亲优良性状于
一体, 达到改良中药材的目的。
本研究采用原生质体成对融合方法[10 ] , 克服了
群体融合方法的盲目性, 从而排除亲本原生质体自
体融合和多个原生质体融合, 以及未融合原生质体
的混杂。这样无须筛选系统, 从而准确追踪观察融合
过程及其发育分裂过程。
到目前为止, 关于铁皮石斛与绞股蓝原生质体
培养及体细胞融合国内未见成功报道。铁皮石斛为
单子叶植物, 原生质体培养成功非常困难, 而原生质
·218· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 7 期 2004 年 7 月
12铁皮石斛叶肉原生质体 22铁皮石斛叶肉原生质体 (FDA 染色)
　32绞股蓝叶肉原生质体 42绞股蓝叶肉原生质体(FDA 染色)
12m esophyll p ro top last iso lated from D. cand id um 　22m eso2
phyll p ro top last iso lated from D. cand id um ( stained w ith
FDA )　32m esonphyll p ro top last iso lated from G.
p en tap hy llum 　42m sophyll p ro top last iso lated
from G. p en tap hy llum ( stained w ith FDA )
图 1　铁皮石斛和绞股蓝叶肉原生质体
F ig. 1　M esophyll protoplasts isola ted from D 1
cand idum and G1 p en tap hyllum
体融合则难度更大[11 ]。笔者将亲源关系较远的两种
药用植物原生质体融合成功获得杂种细胞并分裂,
这在遗传上是一个突破。这可能与体细胞杂交中双
亲的染色体通过消减而降低双亲遗传物质的不平衡
有关, 可能当双亲遗传物质在杂种细胞中达到平衡
恢复分裂分化能力, 说明这两种药用植物可能存在
再生互补效应[12 ]。此项研究可望为中药的改良提供
一条新途径。
另一方面此项研究将生药学与细胞工程结合起
来。近年, 国内外许多科学家寻求生物工程来解决药
用植物资源短缺问题, 应用细胞工程实现商业化大
规模生产天然药用成分。因此建立铁皮石斛与绞股
蓝体细胞杂交细胞系, 为采用生物反应器大规模培
养该杂种细胞提供了依据, 这样就有可能直接从杂
种细胞提取药用成分, 满足药材市场的需求, 从而提
高生产效率, 为两种药材的工业化和商业化生产药
用成分提供了技术基础。
另外杂种细胞分子鉴定及药用成分的分析比较
正在进行中。
12原生质体正在融合　22杂合子第 1 次分裂 (融合后 72 h) 　32
杂合子第 2 次分裂 (融合后 84 h) 　42杂合子第 3 次分裂 (融合
后 90 h)
12p ro top lasts of D. cand id um and G. p en tap hy llum are fusing. 　
22first d ivision ( 72 h after fusion ) 　 32second division ( 84 h
after fusing)　42th ird division (90 h after fusion)
图 2　铁皮石斛和绞股蓝原生质体融合及其分裂
F ig. 2　Fusion of protoplasts of D 1 cand idum and G1
p en tap hyllum and div is ion of hybr id ization cell
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肉苁蓉药材与盐生肉苁蓉培养细胞的主要成分对比研究
赵　琳1, 郭志刚1, 刘瑞芝1, 孙素琴2Ξ
(11 清华大学 化工系生物化工研究所, 北京　100084; 21 清华大学 化学系, 北京　100084)
摘　要: 目的　研究肉苁蓉药材与盐生肉苁蓉培养细胞的苯乙醇苷类成分差异。方法　利用傅里叶变换红外光谱
(FT IR )和H PL C 技术进行成分对比分析。结果　FT IR 的分析结果表明, 盐生肉苁蓉培养细胞的红外指纹谱图与
肉苁蓉药材具有一定相似性; H PL C 的分析结果表明, 盐生肉苁蓉细胞中所含的主要成分和肉苁蓉药材相似, 只是
含量有差异。结论　从整体上看, 盐生肉苁蓉培养细胞中所含成分种类较多, 且大部分含量较高, 其中洋丁香酚苷
(类叶升麻苷)和松果菊苷的含量大幅度高于肉苁蓉药材。
关键词: 肉苁蓉; 苯乙醇苷; 高效液相色谱; 傅里叶变换红外光谱
中图分类号: R 28216　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 07 0814 04
Com par ison of ma in con stituen ts of H erba C is tanche and cultured cells of C is tanche sa lsa
ZHAO L in1, GUO Zh i2gang1, L IU R u i2zh i1, SUN Su2qin2
(11 Inst itu te of B io logy and Chem ical Engineering, D epartm ent of Chem ical Engineering;
21D epartm ent of Chem istry, T singhua U niversity, Beijing 100084, Ch ina)
Abstract: Object　To study the difference of phenylethano id glyco side betw een the cu ltu red cells of
C istanche sa lsa (C1 A 1M ey1) Ben th1 et Hook1 f1 and H erba C istanche1M ethods　M ak ing comparison by
m ean s of FT IR and H PL C techn ique1 Results　U sing the FT IR techn ique, the infrared spectrum of cu2
tu red cell of C 1 sa lsa w as sim ilar to that of nat ive H erba C istanche at a certa in ex ten t1 T he H PL C analysis
indica ted that the m ain chem ical con st ituen ts in cu ltu red cells of C 1 sa lsa w ere sim ilar to that of nat ive
H erba C istanche w h ile con siderab le d ifference of con st ituen ts w as found betw een them 1 Conclusion　O n
the w ho le, there are m uch mo re con st ituen ts in the cu ltu red cells of C 1 sa lsa comparing w ith the nat ive
H erba C istanche1 T he con ten t of ech inaco side and acteo side in the cu ltu red cells is m uch h igher than that in
the nat ive H erba C istanche1
Key words: H erba C istanche ; phenylethano id glyco side; H PL C; FT IR
　　肉苁蓉C istanche d eserticola M a 是列当科肉苁
蓉属 (C istanche Hoffm 1 et L ink)的多年寄生草本植
物, 为我国传统的名贵中药, 始载于《神农本草经》,
列为上品[1 ]。具有补肾阳, 益精血, 润肠通便等功能;
用于治疗男子阳痿, 女子不孕, 腰膝酸软, 筋骨无力,
肠燥便秘[2 ]。近代药理学研究表明, 还能提高机体免
疫功能, 促进DNA 合成, 增强体力, 提高智能, 具明
显的抗衰老作用[3 ]。肉苁蓉主产于我国的内蒙古、新
疆、甘肃和宁夏一带[1 ] , 有“沙漠人参”之美誉, 其主
要活性成分为苯乙醇苷类化合物[4 ]。目前, 我国肉苁
蓉药材基本来自野生资源, 其品质易受气候环境的
影响, 近年来由于不合理的大量采掘, 加之寄生植物
·418· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 7 期 2004 年 7 月
Ξ 收稿日期: 2003210219
作者简介: 赵　琳 (1980—) , 女, 山东省烟台人, 清华大学化工系硕士研究生, 研究方向为植物细胞培养工程。　T el: (010) 62785603
E2m ail: zhao lin98@m ails1tsinghua1edu1cn