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胡萝卜与狭叶柴胡不对称体细胞杂种的分子鉴定
黄贤荣1,石俊英1,向凤宁2,夏光敏2X
( 11 山东中医药大学,山东 济南 250014; 21 山东大学生命科学院,山东 济南 250100)
摘 要:目的 对经同工酶初步确认的 4 个胡萝卜与狭叶柴胡体细胞杂种进一步从分子水平上证实他们的杂种性
质。方法 随机扩增多态性 DNA( RAPD)分析和 5S rDNA 间隔序列差异。结果 4个克隆均含有双亲特征谱带及
新带。结论 从分子水平上证实了他们的杂种性质。为进一步分析杂种中柴胡药效成分的含量及筛选出高药效
成分含量的细胞系奠定基础。
关键词:狭叶柴胡; 胡萝卜;体细胞杂种; 5S rDNA 间隔序列差异分析; RAPD
中图分类号: R2821 7101 3 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2003) 05 0455 03
Molecular analysis of asymmetric somatic cell hybrids between carrot
and Bupleurum scorzonerifolium
HUANG Xian-rong1, SHI Jun-ying1, XIANG Feng-ning2, XIA Guang-min2
( 11 Shandong University of TCM , Jinan 250014, China; 21 School of L ife Science,
Shandong University, Jinan 250100, China)
Abstract: Object Four regenerated somat ic cell hybrids betw een carrot and Bup leur um scor zoner if olium
Willd1 proved by chromosome analysis were analyzed at the molecular level1 Methods RAPD analysis and 5S
rDNA spacer sequence w ere adopted1 Results In the electrophoresis pattern of the PCR products the four so-
mat ic cell hybrids had the characteristic bands of tw o parents and new bands1 Conclusion T heir hybrid nature
w as clarif ied at molecular level1 This provides a firm foundation to further analyze the main active components,
saikosaponin of somat ic cell hybrids, and screen out eff icacious hybrid cell lines1
Key words: Bup leurum scor z onerif ol ium Willd1; carrot ; somat ic cell hybrids; 5S rDNA spacer sequence
analysis; random amplified polymorphic DNAs ( RAPD)
植物体细胞杂交可以使不同来源的原生质体融
合后, 获得新型的体细胞杂种。特别是供体和受体
不对称融合方法的应用,增加了成功的机会。狭叶
柴胡与胡萝卜进行体细胞杂交, 其研究为获得高含
量药效成分的胡萝卜细胞系及再生植株奠定基础,
为中草药现代化探索一条新的途径。胡萝卜与狭叶
柴胡体细胞杂交获得的再生愈伤组织在外观表型上
难以确认为体细胞杂种。利用 DNA分子特征作为
遗传标记( DNA 分子遗传标记)进行物种鉴别较形
态学、同工酶等更为准确、可靠[ 1]。据报道[ 2] , 5S
rDNA(即 5S rDNA基因)在至今研究的所有真核生
物中是以串联重复单位组成的,与卫星 DNA 类似,
属简单多基因家族, 120 bp的编码区之间是随不同
生物而长度不同的非转录间隔区。基因本身表现出
很高程度的序列保守性, 非转录间隔区由于并未处
于与基因本身同样严酷的选择压力下因而变异较
大。高等植物的间隔序列长度在 90~ 400 bp之间,
同一属的不同种植物之间以及同一种植物之间间隔
序列的碱基序列和长度不同。以保守的 5S rDNA
编码区的一致序列为基础设计 PCR引物,用来选择
性扩增变异较大的非转录间隔区, 以区别融合双方
的核基因组, 据此可进行体细胞杂种的鉴定。随机
扩增多态性 DNA( RAPD)技术是一种运用 PCR原
理,以一条随机设计的寡核苷酸单链为引物,对模板
DNA进行 PCR扩增的遗传标记技术。本实验采用
5S rDNA间隔序列差异分析[ 2, 3]和 RAPD技术对胡
萝卜与柴胡体细胞杂种的 DNA 进行 PCR扩增,从
DNA分子水平上为胡萝卜与柴胡体细胞杂种的鉴
#455#中草药 Chinese T raditional and Herbal Drugs 第 34 卷第 5 期 2003年 5月
X 收稿日期: 2002-10- 22作者简介:黄贤荣( 1970- ) ,女,江苏丰县人,硕士,讲师,主要从事中药学鉴别研究。Tel: ( 0531) 2166858( 9)
别提供依据。
1 材料和方法
111 实验材料:亲本胡萝卜 Daucus carota L1 var.
sat ive DC1 愈伤组织 ( L )及狭叶柴胡 Bup leurum
scor zoner if olium Willd1愈伤组织( C) ; 胡萝卜原生
质体与狭叶柴胡原生质体经紫外线照射 1 min融合
再生的愈伤组织 3, 5, 10, 22号克隆,经同工酶分析
确定为杂种。
112 样品 DNA的提取及浓度测定
11211 样品 DNA 的提取: 按 CTAB 法提取[ 4] , 称
取新鲜愈伤组织,于液氮中迅速研磨成粉末, 加入预
热至 60 e 的 CTAB提取液( 114 mol/ L NaCl, 012%
巯基乙醇, 2%CTAB, 20 mmol/ L EDTA, 100 mmol/
L Tris, pH 810)适量, 60 e 保温 30 m in,加入苯酚-
氯仿-异戊醇( 25B24B1)提取 2次, 离心, 收集水相,
加入适量预冷的异丙醇, 混匀, 将纤维状 DNA 挑至
另一 Eppendorf 管中, 用缓冲液 ( 76% 乙醇, 10
mmol/ L 乙醇钠)洗 1 次, 离心。弃上清, Eppendorf
浓缩仪吹干DNA,加入适量的TE( 10 mmol/ L Tris,
pH714, 1 mmol/ L EDTA)缓冲液溶解 DNA。加入
RNase液, 在 37 e 保温 30 min 以除去 RNA。加入
苯酚-氯仿-异戊醇, 混匀, 离心, 收集水相, 加入 3
mol/ L NaAc ( pH 512)和冷无水乙醇, - 20 e 放置
015 h,离心收集 DNA。Eppendorf浓缩仪吹干, TE
溶解 DNA, - 20 e 保存。
11212 DNA浓度测定:琼脂糖平板法测定 DNA 的
浓度。在一个小皿中倒入 017%琼脂糖凝胶成平板
(含 015 Lg/ mL EB) ,在平皿背面划线形成方格, 做
好标记。标准 DNA和样品 DNA 各取 015 LL,按标
记顺序小心滴加到琼脂糖凝胶上, 5~ 10 m in 后, 待
DNA被凝胶吸收,将平皿倒置于紫外灯下观察样品
DNA的荧光亮度,与标准 DNA的亮度比较, 得出样
品 DNA 的浓度。
113 PCR扩增
11311 5S rDNA 间隔序列 PCR反应条件与电泳分
析[ 5] : 选用一对5S rDNA特异引物 , 即p5S1 ( 5c- GGA
TGGGTGACCTCCCGGGAAGTCC- 3 c ) - 2 5 mer ,
p5S2 ( 5 c - CGCTTAACTGCGGAGTTCTGATGG
G-3c)-25mer。PCR反应总体积25LL。PCR反应条件:
94 e 1 min, 65 e 115 min, 72 e 2 min, 35个循环。
在PTC-100型基因扩增仪中进行扩增反应。反应结束
后,取 10 LL 上样,在 3%琼脂糖凝胶上电泳, 50 V恒压
电泳 2 h后紫外灯下观察,照相并记录。
11312 RAPD PCR反应条件与电泳分析[ 6, 7] : PCR
反应总体积 25 LL。PCR 反应条件: 94 e 10 s, 36
e 015 m in, 72 e 1 min, 43个循环。在PT C-100型
基因扩增仪中进行扩增反应。反应结束后, 取 10
LL 上样,在 115%的琼脂糖凝胶上电泳 2 h后紫外
灯下观察,照相并记录。
2 结果
211 5S rDNA 间隔序列差异分析: 选用一对
5S rDNA间隔序列引物( 25 mer)对部分由同工酶鉴
定为杂种的细胞系及双亲 DNA进行 PCR扩增。如
图 1所示,所分析的 4 个再生细胞系中均具有双亲
特征带及新带。表明这 4个克隆均为杂种,与同工
酶分析的结果相吻合。
图 1 5S rDNA序列间隔分析图谱
Fig1 1 5S rDNA spacer sequence pattern
212 RAPD 分析: 随机选用 13 种引物 ( 10-mer
Opcron primer) ,对 4个杂种克隆及双亲 DNA进行
PCR分析, 结果表明, 4 个引物 ( OPH-01-GGT CG-
GAGAA, OPH-04-GGAAGTCGCC, OPH-07-CTG-
CATCGTG, OPG-06-GTGCCTAACC)扩增出 DNA
多态性特异片段, 如图 2, 3所示。4 个克隆均具有
部分双亲特征带及新带,表明这 4个克隆均为杂种,
并且双亲的遗传物质发生了重组,其中 3, 5, 22号克
隆的 RAPD图谱近似亲本柴胡, 10号克隆的 RAPD
图谱近似亲本胡萝卜。结果同 211, 进一步从分子
水平证实了它们的杂种性质。
图 2 PCR扩增谱带
Fig12 PCR extension pattern
研究结果表明 5S rDNA 间隔序列和 RAPD技
术可有效地用于胡萝卜与狭叶柴胡体细胞杂种鉴
定。
3 讨论
本实验表明, 5S rDNA 间隔序列分析操作简
单,重复性好, 在生长发育的各个时期均能检测, 所
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图 3 PCR 扩增谱带
Fig1 3 PCR extension pattern
需 DNA量少, 是一种分子水平上鉴定体细胞杂种
的好方法,但此法检测的基因位点数目较少, RAPD
技术无需专门设计 RAPD扩增反应的引物, 也无需
预知被研究的生物基因组核苷酸顺序, 引物是随机
合成或随机选定的, 并易于程序化,方便、快捷,且检
测的基因位点数目多, 但重复性较差。两种分子检
测技术相结合, 对体细胞杂种中的异源基因能作出
更精确、更全面的定位和分析。
通过原生质体融合获得的体细胞杂种中, 包含
有不等量的双亲的遗传物质, 造成这种情况的原因
一种可能是两亲本游离原生质体的供体细胞生长
(分裂)活跃程度的差异而导致不对称杂种; 另一种
可能是两亲本细胞核的 DNA复制速度不同而造成
分配到每个杂种细胞核中的染色体数不相同。
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Medical College Publishing House, 20001
不同产地掌叶大黄 HPLC指纹图谱的比较
陈 斌1,蔡宝昌1* , 潘 扬2,王天山2,郭胜伟2,钱继红2X
( 11 南京中医药大学 江苏省中药质量控制工程技术中心,江苏 南京 210029; 21 江苏中康新药指纹图谱开发有限
责任公司,江苏 南京 210029)
摘 要:目的 应用 RP-HPLC ( DAD)对不同产地掌叶大黄药材进行指纹图谱比较。方法 用 Inertsil ODS-3 分析
柱, 1%HAc-H2O与 1%HAc-CH3CN 梯度洗脱, 流速 1 mL/ min,柱温 30 e ,检测波长 280 nm,参比波长 380 nm。结
果 建立了H PLC 指纹图谱共有模式, 并对其他产地药材进行了相似度比较。结论 对大黄药材中各成分均得到
很好分离,可作为大黄药材的具有专属性的指纹图谱。
关键词:大黄; 指纹图谱;高效液相色谱; 梯度洗脱法
中图分类号: R2821 7101 3 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670( 2003) 05 0457 04
Comparison of HPLC fingerprint chromatography of Rheum palmatum
of different producing areas
CHEN Bin1, CAI Bao-chang 1, PAN Yang2, WANG Tian-shan2, GUO Sheng-w ei2, QIAN J-i hong 2
( 11 Jiangsu Enginnering and Technical Center for Quality Control of Chinese Materia Medica, Nanjing University
of TCM , Nanjing 210029, China, 21 Jiangsu Zhongkang New Drug & F ingerprint
Chromatogr aphy Development Co1 , L td1 , N anjing 210029, China)
Abstract: Object To apply RP-HPLC ( DAD) to compare the fingerprints of Rheum palmatum Linn1
#457#中草药 Chinese T raditional and Herbal Drugs 第 34 卷第 5 期 2003年 5月
X 收稿日期: 2002-09- 08作者简介:陈 斌( 1977- ) ,男,南京中医药大学 2000级在读硕士研究生,主要从事新药开发与指纹图谱研究。
* 通讯作者 Tel: ( 025) 6798281