全 文 ：用相当 ,强于其他配伍组合 ,与方中的酸性药相互溶
出的影响、酸性与碱性药相互影响及各药的药效累
加效应有关。
4　讨论
　　复方中药物配伍后引起抑菌作用变化 ,无论其
增强、加合还是拮抗 ,与配伍后煎液中的有效成分变
化有关 ,有效成分增多 ,抑菌作用相应增强 ,反之则
减弱。 GQD拆方研究中葛根、黄连、黄芩、炙甘草比
例为 15∶ 9∶ 9∶ 6,其中葛根、黄芩、炙甘草呈酸性 ,
而黄连有效成分呈碱性。四药配伍时相互之间的影
响 ,以酸性药对碱性药的溶出率影响最大 ,而酸性药
物之间亦会相互影响 [4 ]。
GQD具有抑菌作用 ,其体外对金黄色葡萄球
菌、痢疾杆菌、肺炎双球菌均有一定的抑制作用 [5, 6 ] ,
体内实验表明对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、肺炎双
球菌亦有明显的抑制作用 [5 ]。
本实验从药效学角度侧重比较了 GQD不同配
伍煎液对肺炎链球菌抑菌作用差异 ,从而为结合方
剂配伍 -化学成分变化进而全面探讨方剂配伍规律
打下基础。
References:
[1 ]　 Luo J B, Yu L Z, Tan X M. M ethods of s tud ying regularity
of recipe composi tion [J ]. Pharmacol Cl in Ch in Mater Med
(中药药理与临床 ) , 1999, 15( 3): 48-49.
[2 ]　 Zhou B J. B acteriostasi s and Evaluation Methods of Some
Common Chinese Herbs (常用中药的抗菌作用及其测定方法 )
[M ] . Chongqing: Chongqing Science and Tech nology Pub-
lis hing House, 1987.
[3 ]　 Xu S Y, Bian R L, Ch en X. Methodology in Pharmacologica l
Exp erimen ts (药理实验方法学 ) [M ]. 2nd ed. Bei jing:
People s Medical Publish ing House, 1984.
[4 ]　 Lin S L, Zh ao L H, Wu Z N, et al . Stud y on mu tual effect
of rh ubarb, Cop tics ch inensis , am ur corkt ree bark and Scutel-
laria baicalensis Geo rgi wh en in a decoction— Ef fect of com-
pound ch ange on the diss olve rate of eff icient com posi ti on
[ J] . Ch in Trad it Herb Drug s (中草药 ) , 1989, 20( 6): 10.
[5 ]　 Tong L, Xu J J, Huang T Y. et a l. Study on bacterios tasis
and d efibration of Geg en Qinlian Decoction [ J] . Ch ina J Chin
Mater Med (中国中药杂志 ) , 1987 ( 6): 49.
[6 ]　 Tan X M , Ch en Y R, Luo J B, et al . Stud y of Geg en Qinlian
Pill on bacterios tasi s and repi rato ry vi rus [ J ]. Pharmacol
Clin Ch in Mater Med (中药药理与临床 ) , 2000, 16( 3): 10-
13.
红豆杉细胞提取物抑制肿瘤细胞增殖及
诱导凋亡的实验研究
鲁翠涛 1 ,赵应征 2* ,梅兴国 2
( 1. 华中科技大学生命科学与技术学院 ,湖北 武汉　 430074; 2. 军事医学科学院毒物药物研究所 ,北京　 100850)
摘　要: 目的　研究红豆杉细胞提取物对肝癌细胞 SM MC-7721的生长抑制作用及其机制。 方法　运用台盼蓝拒
染法测定肿瘤细胞生长曲线 ,流式细胞仪和 Giemsa染色分析肿瘤细胞周期和细胞凋亡。结果　红豆杉细胞二氯甲
烷提取物对肝癌细胞 SMM C-7721的生长有明显的抑制作用 ,流式细胞仪分析发现 G2 /M期肿瘤细胞数量增多 ,
经 Giemsa染色发现肿瘤细胞有凋亡发生。 结论　红豆杉细胞提取物可以通过诱导细胞发生凋亡而抑制肝癌细胞
SMM C-7721的生长。
关键词: 红豆杉细胞 ; SMM C-7721; 细胞增殖 ; 细胞凋亡
中图分类号: R286. 91　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 11 1013 03
Extract from cultured cells of Taxus chinensis on proliferation inhibition
and apoptosis induction of tumor cells
LU Cui-tao
1 , ZHAO Ying-zheng
2 , M EI Xing-guo
2
( 1. Schoo l o f Life Science and Techno log y, Hua zhong Univ er sity of Science and Technolog y , Wuhan 430074, China;
2. Institute of Toxicolog y and Pharmacolog y , Academy o f M ilitary Medical Sciences, Beijing 100850, China )
Abstract: Object　 To study the inhibito ry ef fect and mechanism o f ex tract f rom cultured cel l of Taxus
chinensis ( Pi lg. ) Rehd. on hepato carcinoma cell line SMMC-7721. Methods　 Trypan blue stain assay w as
·1013·中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 11期 2003年 11月
收稿日期: 2003-02-16基金项目: “九五”国家攻关项目 ( 96-C02-03-01)作者简介: 鲁翠涛 ( 1974— ) ,女 ,湖北天门人 ,华中科技大学生命科学与技术学院 2000级博士研究生 ,研究方向为红豆杉细胞药理筛选及大规模细胞培养研究。 E-mail: le tzyz@ si na. com
* 通讯作者　 Tel: ( 010) 66932654
used to determine tumo r cell grow th curv e, flow cy tometry and Giemsa staining were used to analy ze cell
cycle and cel l apoptosis. Results　 Inhibi to ry ef fect happened on tumo r cell line SMMC-7721, G2 /M stag e
o f tumor cells increased wi th the addi tion o f T . chinensis cell ex t ract by carrene and apopto sis happened.
Conclusion　 The ex t racts f rom cultured cell of T . chinensis have inhibi to ry effect on SMMC-7721 cells and
can fur ther induce cell apoptosis.
Key words: cell o f Taxus chinensis ( Pilg. ) Rehd. ; SMMC-7721; cell pro li feration; cell apoptosis
　　红豆杉细胞培养作为可再生资源 ,被认为是解
决紫杉醇药源紧张的重要途径之一 [1 ]。 目前大量的
研究工作主要集中在如何提高红豆杉细胞中紫杉醇
等次生代谢产物的含量以及保持其产量稳定性等方
面 ,而国内有关红豆杉细胞抗肿瘤的体内体外研究
工作相对较少。本实验以红豆杉细胞为材料 ,对红豆
杉细胞提取物体外抑制肿瘤细胞增殖及诱导细胞凋
亡进行了初步探讨。
1　药品与仪器
　　台盼蓝、碘化丙啶 ( PI)、 RNaseA购自美国
Sigma公司 ; Giemsa染料 (上海试剂三厂 )。流式细
胞仪 (美国 Becton dickinson公司 )。
2　方法
2. 1　红豆杉愈伤组织细胞的诱导及培养: 实验用细
胞株来源于中国红豆杉 Taxus chinensis ( Pilg. )
Rehd. ,经本实验室反复驯化的细胞系 F4。 红豆杉
幼嫩茎尖经改良 MS培养基诱导获得愈伤组织 [2 ] ,
继代培养基采用本室改良的 MS液体培养基 ,其中
NAA 0. 5 mg /L, 6-BA 0. 5 mg /L, 2, 4-D 0. 08 mg /
L。接种新鲜愈伤组织 ,于摇床 120 r /min进行悬浮
暗培养 , 30 d后收获细胞。 将细胞用蒸馏水冲洗 3
次 ,抽滤 ,真空冻干。
2. 2　红豆杉愈伤组织细胞中抗癌物质的提取: 精密
称取 100 mg冻干粉末 ,用甲醇提取 (分 3次提取 ,
每次 2 mL甲醇 ,超声 40 min,静置过夜 ) ,合并提取
液 ,浓缩至干。然后加入二氯甲烷 -水 ( 1∶ 1) 4 mL,
充分混匀后静置 ,吸出二氯甲烷层 (下层 )。 重复前
步骤 2次 ,合并所有二氯甲烷浸提液 ,浓缩 ,得二氯
甲烷浸膏。浸膏用二甲基亚砜 ( DM SO)溶解 ,然后
用 DM EM培养液 (含 10% 小牛血清 ,青霉素 100
U /mL,链霉素 100 mg /mL)稀释至所需浓度。DM-
SO在溶液中的最大浓度不超过 0. 5%。
2. 3　肿瘤细胞生长曲线测定: 肝癌细胞系 SMMC-
7721由军事医学科学院提供 ,细胞用含 10% 小牛
血清 (外加青霉素 100 U /mL,链霉素 100 mg /mL)
DMEM培养液传代培养 [ 3]。生长曲线测定参照司徒
镇强方法 [4 ]。 取指数生长期细胞 ,以 DM EM配成
4× 104 /mL细胞悬液 ,接种于 24孔平底细胞培养
板 ( Costa r, Charlo t te, NC) ,每孔 1 mL,置 37℃
培养箱中培养 12 h后 ,换含不同浓度红豆杉细胞二
氯甲烷粗提物的培养液 ,使终浓度分别为 0. 01,
0. 1, 1, 10 mg /m L〔红豆杉细胞提取物浓度是指在
单位溶液中 ( mL) 的红豆杉细胞干质量 ( mg )〕 ,实
验对照为无药培养液 (含药物最大浓度时相应溶剂
量 )。每种浓度设 3个平行孔 ,分别于用药后 12, 24,
48, 72 h用台盼蓝拒染法进行活细胞计数。
2. 4　流式细胞仪分析: 每个培养瓶含 SMMC-7721
细胞约 1× 106个 ,加入一定浓度的红豆杉细胞二氯
甲烷提取物 0. 5, 1 mg /mL,实验对照组为相应药物
浓度的溶剂。 细胞继续在培养箱中培养 ,分别于 6,
24 h后用流式细胞仪分析细胞周期分布 [5 ]。
2. 5　肿瘤细胞形态观察
2. 5. 1　倒置显微镜直接观察细胞形态变化
2. 5. 2　 Giemsa染色观察细胞形态变化: 取指数生
长期的细胞 ,以 DM EM 配成 4× 104 /mL细胞悬
液 ,接种于直径 3 cm培养皿 ,每皿 1. 5 mL,置 37
℃ 培养箱中培养 ,次日加入不同浓度红豆杉细胞二
氯甲烷粗提物 ,使终浓度分别为 0. 01, 0. 1, 1 mg /
mL, 3 d后进行如下处理: 以醋酸甲醇固定 30 min,
经 Giemsa染液与 Sorensen磷酸缓冲液以 1∶ 9混
合成的工作液染色 15 min (室温 ) ,冲净多余染液 ,
晾干后用显微镜观察 [6 ]。
3　结果
3. 1　红豆杉细胞提取物对肿瘤细胞作用的时间剂
量效应关系:笔者曾以不同溶剂提取红豆杉细胞 ,发
现二氯甲烷粗提物对肝癌细胞 SMMC-7721的毒性
作用远高于其他溶剂提取物 ,因此本实验以二氯甲
烷提取物为实验药物。实验显示 ,在所加药物浓度为
0. 01 mg /mL,培养 48 h后肝癌细胞的生长开始呈
现抑制现象 ;随着所用药物浓度的加大 ,对肿瘤细胞
的抑制作用增强 ,与对照相比 ,均呈现差异显著性。
在 1, 10 mg /m L药物对肿瘤细胞的生长抑制情况
很相似 ,两者之间差异无显著性 ,见图 1。
3. 2　流式细胞仪分析肿瘤细胞周期:见表 1。红豆
·1014· 中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 11期 2003年 11月
1-0 mg /m L　 2-0. 01 mg /m L　 3-0. 1 mg /m L
4-1 mg /m L　 5-10 mg /m L
图 1　红豆杉细胞提取物对肝癌细胞 SMMC-7721
作用的时间-剂量曲线
Fig. 1　 Time-dosage curve of extract from T . chinensis
cell on SMMC-7721
杉细胞二氯甲烷粗提物处理 SMMC-7721细胞 6
h, G0 /G1期细胞分布有所降低 , G2 /M期细胞分布有
所增加 ,细胞凋亡率 3. 49% ;处理 24 h, G0 /G1期细
胞分布由 69. 67% 降至 46. 91% , G2 /M期细胞分
布由 9. 14% 增至 26. 98% ,细胞凋亡率为 9. 45% 。
表 1　红豆杉细胞提取物对 SMMC-7721
细胞周期分布的影响
Table 1　 Ef fect of extract from T . chinensis
cell on cell cycle of SMMC-7721
组　别 终浓度
/( mg· mL- 1)
6 h肿瘤细胞周期 /%
G0 /G1 G2 /M S
24 h肿瘤细胞周期 /%
G0 /G1 G2 /M S
对照 - 70. 48 8. 98 20. 54 69. 67 9. 14 21. 19
红豆杉细胞 0. 5 66. 85 10. 79 22. 36 57. 14 17. 08 25. 78
1　 58. 64 16. 91 24. 45 46. 91 26. 98 26. 11
3. 3　肿瘤细胞形态学变化: 在生长抑制的同时 ,肝
癌细胞表现出明显的形态变化。倒置显微镜下观察 ,
正常生长的肝癌细胞始终为多角形、棱形 ,药物作用
后细胞则逐渐变圆、变小 ,细胞出现皱缩、变圆 ,折光
率增强 ,少量细胞悬浮 ;随时间延长漂浮细胞逐渐增
多 ,贴壁生长细胞变得稀疏。经 Giemsa染色后 ,肝
癌细胞 SMMC-7721的细胞核染蓝紫色 ,胞浆染粉
红色。在光镜下观察 ,胞质中颗粒增多并可见细胞膜
出泡 ,核质比增大 ,核变形、皱缩 ,核染色质浓聚或呈
月牙形边聚 ,出现凋亡小体。但凋亡形态细胞存在时
间短 ,且大部分死细胞很快崩解、坏死。
4　讨论
　　有研究指出 ,紫杉醇具有很强的抗人肝癌活
性 [7 ]。本实验以肝癌细胞系 SMMC-7721作为受试
癌细胞 ,通过红豆杉细胞二氯甲烷提取物对
SMMC-7721生长的影响作用研究 ,显示其对体外
肝癌细胞的生长具有剂量和时间依赖效应 ,说明红
豆杉细胞具有明显的体外抗肿瘤作用。 通过流式细
胞仪分析发现 , SMMC-7721的 G2 /M期细胞分布
随红豆杉细胞提取物处理浓度及时间的增加而增
多 ,细胞凋亡率也随着增加。这种作用方式与紫杉醇
的抗癌机制相类似 ,说明红豆杉细胞内对肝癌细胞
生长起主要抑制作用的物质仍然是紫杉醇及其类似
物。红豆杉作为一种珍稀药用植物资源 ,其愈伤组织
细胞中含有多种具生物活性的次生代谢物 ,这其中
包括已知的抗肿瘤 (如卵巢癌、乳腺癌等 ) 药物紫
杉醇及紫杉烷类 ,以及某些未知次生产物。这些物质
对肿瘤细胞的生长是协同抑制作用 ,还是独立起作
用 ,仍需进一步研究。
References:
[1 ]　 Zhuang X L, Zhang X Q, Yu S H, et al . S tudies on produc-
ing paclit ax el by Taxus cell [ J] . Ch in Trad it Herb Drugs (中
草药 ) , 2000, 31( 10): 794-798.
[2 ]　 Zhang C H, Mei X G, Liu L, et al . Enh anced paclit ax el pro-
duction induced by th e combination of elicitors in cell s uspen-
sion cul tu res of Taxus chinensis [ J ]. B iotechnol Let t , 2000,
22: 1561-1564.
[3 ]　 Tang Z Y, Wu M C, Xia S S, et al . Prima ry Liver Can cer
(原发性肝癌 ) [M ]. Bei jing: Xu eyuan Press , 1989.
[4 ]　 Si tu Z Q. Cell Cul tu re (细胞培养 ) [M ] . Xi an: Wo rld
Books Pres s Co. , 1996.
[5 ]　 Dong B, Chen X H, Zhang H, et al . An imp roved meth od of
cell p reparation for cel l cycle as say [ J ]. Bul l Acad Mil Med
Sci (军事医学科学院院刊 ) , 2002, 26( 2): 124-126.
[6 ]　 Han R. Research and Developmen t of Ant icancer Drug s and
Exp erimen tal Techn iques (抗癌药物研究及实验技术 ) [M ].
Bei jing: Beijing Medical University and Peking Union Medi-
cal College Uni ted Pres s, 1997.
[7 ]　 Yuan J H, Wang X W , Luo D, et a l. An ti-hepatoma activity
of taxol: an in vitro study [ J] . Acta Pharmacol Sin , 2000,
21( 5): 450-454.
段 木 灵 芝 孢 子 油
采用二氧化碳超临界萃取技术 (可代为加工成软胶囊 )
电话: 021-54653215　 13020256999　朱微鸿
上海天衡生物科技有限公司
·1015·中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 11期 2003年 11月