全 文 ：海带褐藻多糖硫酸酯的抗氧化活性研究
张全斌 1, 2 ,于鹏展 1, 2 ,周革非 1, 2 ,李智恩 1 ,徐祖洪 1⒇
( 1. 中国科学院海洋研究所 ,山东 青岛　 266071; 2. 中国科学院研究生院 ,北京　 100039)
摘　要: 目的　研究海带褐藻多糖硫酸酯的抗氧化作用。 方法　采用体外实验研究海带褐藻多糖硫酸酯对超氧阴
离子、羟自由基、 DPPH的清除作用以及对 H2O2诱导的红细胞氧化溶血和大鼠肝匀浆脂质过氧化的保护作用。 结
果　海带褐藻多糖硫酸酯对超氧阴离子具有良好的清除作用 , IC50为 20. 3μg /m L ,其对羟自由基的清除作用较弱 ,
对有机自由基 DPPH的作用很弱。 褐藻多糖硫酸酯能够抑制 H2O2诱导的红细胞氧化溶血 ,对 FeSO4-抗坏血酸体
系造成的脂质过氧化具有良好的保护作用。 结论　海带褐藻多糖硫酸酯具有显著的体外抗氧化活性。
关键词: 褐藻多糖硫酸酯 ; 海带 ; 氧自由基 ; 脂质过氧化 ; 抗氧化
中图分类号: R286. 02; R286. 75　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 09 0824 03
Studies on antioxidant activities of fucoidan from Laminaria j aponica
ZHANG Quan-bin
1, 2 , YU Peng-zhan
1, 2 , ZHO U Ge-fei
1, 2 , L I Zhi-en
1 , X U Zu-hong
1
( 1. Institute of Oceano lo gy , CAS, Qingdao 266071, China; 2. Graduate Schoo l, CAS, Beijing 100039, China)
Abstract: Object　 To study th e preliminary antio xidant activi ties o f fucoidan ex t racted f rom Lam inar-
ia japonica Aresch. Methods　 The in vitro scavenging activi ties o f fucoidan on supero xide radical, hydrox-
y l radical and DPPH, and i ts pro tectiv e effects on H2O2 -induced hemo lysis of ra t ery throcytes and lipid per-
ox idation o f liver homogena te in rat were investiga ted in this study. Results　 Fucoidan had strong scav-
enging ef fect on superoxide radical wi th IC50 o f 20. 3μg /mL; it s effect on hydro xy l radical w as weak; i t
had less inf luence on DPPH. Fucoidan inhibi ted H2O2-induced hemo lysis of rat eryth ro cy tes ef fectively and
show ed signi ficant pro tectiv e ef fect on lipid perox ida tion o f liv er homogenate in ra t induced by FeSO4-
asco rbic acid. Conclusion　 Fucoidan from L . japonica show s significant antioxidant activ ity in experi-
ments in vitro.
Key words: fucoidan; Laminaria japonica Aresch. ; ox ygen radical; lipid peroxide; antioxidation
　　褐藻多糖硫酸酯是从褐藻中提取的一类硫酸多
糖 ,主要由岩藻糖和硫酸基组成 ,是高度 3—支链化
的 ( 1— 2)或 ( 1— 3) 连接的 α-L-岩藻糖 -4-硫酸
酯 [1 ]。对褐藻多糖硫酸酯进行的广泛研究表明其具
有多种生物活性 ,包括抗凝血、降血脂、抗肿瘤、抗病
毒以及免疫调节作用 [2, 3 ]。海带是中国最重要的人工
养殖经济藻类。研究发现海带褐藻多糖硫酸酯具有
抗肿瘤、降血脂和治疗慢性肾功能衰竭等作用 [4 ]。自
由基医学的研究表明 ,炎症、肿瘤、组织缺血再灌注
损伤均与活性氧引发的脂质过氧化密切相关 [ 5]。为
了阐明海带褐藻多糖硫酸酯的作用机制 ,并对其进
行进一步的开发和利用 ,本实验对海带褐藻多糖硫
酸酯的体外抗氧化活性进行了研究。
1　材料
　　褐藻多糖硫酸酯系采用徐祖洪等的方法 [6 ]从青
岛人工养殖的海带中制备。其化学分析结果表明:总
糖占 48% ,岩藻糖占 28% ,硫酸根占 29% ; HPLC
分析单糖组成显示岩藻糖是其主要的组份 ,除岩藻
糖外 ,半乳糖的比例也比较高 ( Fuc∶ Gal为 1∶
0. 24)。 HPLC测定多糖的平均相对分子质量为 189
000 ( Waters高效液相色谱仪 , TSK G4000PWxl
柱 )。 在下述的各试验中 ,褐藻多糖硫酸酯溶液均以
相应的缓冲液配制而成。
2　方法
2. 1　褐藻多糖硫酸酯对超氧阴离子自由基 ( O2÷ )
的清除作用 [ 7]: 采用吩嗪硫酸甲酯 -N ADH体系产
生。反应体系为 3. 0 mL Tris-HCl缓冲液 ,其中含有
78μmol /L还原型辅酶 I ( N ADH) , 50μmol /L硝
基四氮唑蓝 ( NBT ) , 10μmo l /L吩嗪硫酸甲酯
( PM S) ,以及不同浓度的多糖溶液。 O2÷和 N BT的
显色反应采用分光光度法在 560 nm波长处测定反
应液的吸光度值。
·824· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 9期 2003年 9月
⒇ 收稿日期: 2002-10-25作者简介:张全斌 ( 1971— ) ,男 ,山东章丘人 ,中国科学院研究生院博士研究生 ,研究方向为海藻化学和海洋药物学。
Tel: ( 0532) 2898703　 E-mail: x zh@ ms. qdio. ac. cn
2. 2　褐藻多糖硫酸酯对羟自由基 (· OH)的清除
作用:按照 Smirnof f等 [8 ]的方法改进。在 3 mL 150
mmol /L磷酸缓冲液中含有 0. 15 mmo l /L FeSO4-
EDTA, 2 mmol /L水杨酸钠 , 6 mmol /L H2O2以及
不同浓度的褐藻多糖硫酸酯。37℃ 反应 1 h,在 510
nm处测定吸光度值。
2. 3　褐藻多糖硫酸酯对有机自由基的清除作用 [9 ]:
1, 1-二苯基苦基苯肼 ( 1, 1-diphenyl-2-picryl-hy-
drazyl , DPPH)是一种稳定的自由基。 DPPH溶于
少量的甲苯后 ,以 50% 乙醇配成 120μmol /L的溶
液。加 0. 1 mL多糖与 1. 9 mL DPPH在室温下静
置 20 min后测定 525 nm处的吸光度值。
2. 4　褐藻多糖硫酸酯对 H2O2诱导的红细胞氧化溶
血试验: 健康 Wista r大鼠眼眶取血 ,制成抗凝血 ,
1 000×g 离心 10 min,移弃血浆和白细胞 ,向沉淀
的红细胞中加入等渗的生理盐水 ,混匀 , 1 000× g
离心 10 min,弃上清液 ,如此反复 2次洗涤红细胞 ,
将红细胞制成 0. 5% 的悬浮液。 取红细胞悬液 1
m L,加不同的多糖样品 ,最后加 100 mmo l /L的
H2O2 ,混匀 , 37℃ 温浴 60 min,用生理盐水稀释 5
倍 , 1 000× g离心 10 min,上清液于 415 nm处测
定吸光度值。
2. 5　褐藻多糖硫酸酯对大鼠肝匀浆脂质过氧化作
用的影响:健康 Wistar大鼠 ,颈椎脱臼致死。迅速分
离肝组织 ,用冰冷的 Tris-HCl缓冲液 ( 20 mmo l /
L )制成 20% 的匀浆 , 9 810×g离心 20 min,沉淀
再洗一次并离心 ,合并上清液。 在 0. 2 mol /L Tris-
HCl缓冲液中 ( p H 7. 4) 加含肝匀浆液 0. 2 mL,
FeSO4 10μmol /L,抗坏血酸 0. 1 mmo l /L及不同浓
度的多糖 ,在 37℃ 温浴 1 h,保温结束后加入 20%
三氯乙酸 ( TCA) 1. 0 m L终止反应。 混匀 ,再加入
0. 67% 硫代巴比妥酸 ( TBA) 1. 5 mL,沸水浴加热
15 min。离心去除蛋白质沉淀后 ,于 532 nm测定吸
光度值。
2. 6　抑制率的计算:褐藻多糖硫酸酯对自由基的清
除作用以下式计算:
抑制率= ( A- A1 ) /(A - A0 )× 100%
式中 A为对照体系的吸光度值 , A1为样品的吸光度值 , A0
为空白组的吸光度值。
2. 7　数据处理: 实验结果以 x± s表示。采用 t检验
对实验结果进行比较。
3　结果
3. 1　褐藻多糖硫酸酯对 O2÷的清除作用: 见表 1。
海带褐藻多糖硫酸酯具有很强的清除 O2÷的作用。
表 1　海带褐藻多糖硫酸酯对超氧阴子的清除作用 (n= 5)
Table 1　 Scavenging eff ect of fucoidan
on superoxide radical (n= 5)
浓度 / (μg· mL- 1 ) A 560 nm 抑制率 /%
　　　对照 　　　 0. 803± 0. 004 -
　　　 3. 3 0. 700± 0. 003* * 12. 8
13. 3 0. 540± 0. 007* * * 32. 6
23. 3 0. 340± 0. 009* * * 57. 6
33. 3 0. 126± 0. 003* * * 84. 3
50. 0 0. 036± 0. 002* * * 95. 5
83. 3 0. 024± 0. 004* * * 97. 0
　　与对照组比较: * * P < 0. 01　* * * P < 0. 001
　　* * P < 0. 01　* * * P < 0. 001 vs cont rol group
并且随着多糖浓度的增加 ,其清除能力增强。 其对
O2
÷的 IC50为 20. 3μg /mL。
3. 2　褐藻多糖硫酸酯对· OH的清除作用: 见表 2。
褐藻多糖硫酸酯对· OH具有一定的清除作用。
表 2　褐藻多糖硫酸酯对羟自由基的清除作用 (n= 5)
Table 2　 Scavenging eff ect of fucoidan
on hydroxyl free radical (n= 5)
浓度 / (μg· mL- 1 ) A 510 nm 抑制率 /%
对照 　　　 0. 482± 0. 003 -
0. 17 0. 477± 0. 003 -
0. 33 0. 468± 0. 001* 2. 9
0. 67 0. 448± 0. 004* * 7. 1
1. 33 0. 378± 0. 004* * * 21. 8
2. 33 0. 321± 0. 005* * * 33. 4
　　与对照组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01　* * * P < 0. 001
　　* P < 0. 05　* * P < 0. 01　* * * P < 0. 001 vs cont rol group
3. 3　褐藻多糖硫酸酯对有机自由基的清除作用: 见
表 3。结果表明 ,褐藻多糖硫酸酯对稳定的自由基
DPPH作用很弱。在低浓度时其对 DPPH没有清除
作用 ,只是在高浓度时表现出微弱的作用。
表 3　褐藻多糖硫酸酯对 DPPH的清除作用 (n= 5)
Table 3　 Scavenging eff ect of fucoidan on DPPH (n= 5)
浓度 / (μg· mL- 1 ) A 525 nm 抑制率 /%
对照 　　　 0. 991± 0. 014 -
0. 2 0. 972± 0. 007 -
0. 5 0. 948± 0. 008* 4. 3
0. 7 0. 933± 0. 002* * 5. 8
1. 3 0. 913± 0. 005* * 7. 8
1. 5 0. 904± 0. 029* 9. 6
　　与对照组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
　　* P < 0. 05　* * P < 0. 01 vs cont rol g roup
3. 4　褐藻多糖硫酸酯对 H2O2诱导的红细胞溶血作
用: 见表 4。结果表明 ,褐藻多糖硫酸酯在较高浓度
时能够抑制 H2O2诱导的红细胞氧化溶血 ,该作用的
IC50为 4. 1 mg /mL。
3. 5　褐藻多糖硫酸酯对大鼠肝匀浆液脂质过氧化的
作用:见表 5。 结果表明 ,褐藻多糖硫酸酯对 FeSO4-
·825·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 9期 2003年 9月
表 4　褐藻多糖硫酸酯对 H2O2诱导的大鼠
红细胞氧化溶血的作用 ( n= 5)
Table 4　 Effect of fucoidan on rat erythrocytes
hemolysis induced by H2O2 (n= 5)
浓度 /(μg· mL- 1 ) A415 nm 抑制率 /%
正常 　　　 0. 042± 0. 006 -
对照 1. 304± 0. 008 -
1. 0 1. 212± 0. 006 7. 2
2. 0 1. 020± 0. 005* * 22. 3
3. 0 0. 834± 0. 006* * 37. 2
4. 0 0. 695± 0. 004* * * 48. 3
5. 0 0. 470± 0. 005* * * 66. 1
　　与对照组比较: * * P < 0. 01　* * * P < 0. 001
　　* * P < 0. 01　* * * P < 0. 001 vs cont rol g roup
表 5　褐藻多糖硫酸酯对肝匀浆脂质过氧化的作用 (n= 5)
Table 5　 Ef fect of fucoidan on lipid peroxidation
of liver homogenate in rat (n= 5)
浓度 /(μg· mL- 1 ) A532 nm 抑制率 /%
正常 　　　 0. 141± 0. 003 -
对照 1. 018± 0. 005 -
0. 2 1. 020± 0. 004 -
0. 6 0. 982± 0. 006 4. 1
1. 0 0. 206± 0. 004* * * 92. 5
1. 6 0. 161± 0. 005* * * 97. 6
2. 0 0. 158± 0. 006* * * 97. 9
　　与对照组比较: * * * P < 0. 001
　　* * * P < 0. 001 vs con t rol g rou p
抗坏血酸体系造成的大鼠肝匀浆液脂质过氧化具有
良好的抑制作用。 在浓度达到 1. 0 mg /mL时其对
FeSO4-抗坏血酸体系造成的大鼠肝匀浆液脂质过
氧化的抑制率可以达到 90% 以上。
4　讨论
　　活性氧自由基 (主要是超氧阴离子和羟自由
基 ) 对机体产生一系列的有害作用 ,如进攻多不饱
和脂肪酸可引起脂质过氧化 ,导致生物膜结构和功
能的改变 ;损伤蛋白质的巯基和氨基使蛋白质变性、
交联 ,使酶的活性丧失 ;损伤 DNA可导致细胞突
变。种种有害后果与许多疾病如肿瘤、炎症、衰老的
发生有密切的关系 ,因此生物体内活性氧的生成与清
除的平衡对生命过程的正常进行是十分重要的 [5 ]。
近年来 ,多糖的抗氧化作用受到广泛的重视。研
究表明许多多糖具有提高抗氧化酶活性、清除自由
基、抑制脂质过氧化的作用 ,从而起到保护生物膜的
作用 [10 ]。 Tasipari等 [11 ]对葡聚糖及其衍生物的抗氧
化性研究表明多糖的抗氧化性与其化学组成有关 ,
磷酸化和硫酸化的葡聚糖的抗氧化性较葡聚糖提
高 ,说明多糖的荷电性与其抗氧化性相关。海藻生长
于独特的海洋环境 ,由于海水的硫酸盐含量较高 ,因
而许多的海藻多糖为硫酸化多糖。 最近几年的研究
表明海藻多糖具有较高的抗氧化能力。 鼠尾藻多糖
能有效的清除活性氧自由基 [1 2]。浒苔多糖能提高
SOD活力及降低 LPO的含量 [13 ]。褐藻多糖硫酸酯
是在褐藻中存在的一类硫酸化多糖 ,本实验所用海
带褐藻多糖硫酸酯样品中硫酸根达到 29%。在本研
究中 ,海带褐藻多糖硫酸酯表现出较高的自由基清
除活性 ,在较高浓度时对 H2O2诱导的红细胞氧化溶
血以及肝匀浆脂质过氧化具有保护作用 ,其清除超氧
阴离子自由基的 IC50为 20. 3μg /mL,这在海藻多糖
中是比较突出的 ,较已经报道的鼠尾藻多糖和褐藻硫
酸多糖的 IC50要低数倍和数十倍。对褐藻多糖硫酸酯
的抗氧化性 ,特别是其清除超氧阴离子自由基和抗脂
质过氧化的活性值得进一步的研究和开发。
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·826· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 9期 2003年 9月