全 文 ：法可行。
312　全方各峰的归属分别经各药材、阴性及对照品
对照确认, 其中 12 为小檗碱, g9 为葛根素, q8 为黄
芩苷, 甘草虽然产生 3 个峰, 但由于在方中甘草的量
较少, 受到的干扰相对较大, 出峰时间的相对稳定性
较差, 只有一个峰的相对迁移时间的R SD < 5% , 但
如果把 R SD 放宽至 10% , 则 3 个峰相对迁移时间
皆可用于定性。
313　方法学考察表明该法可用于葛根芩连方指纹
图谱的建立, 其中黄连、黄芩分别有 5 个峰可以定
量; 葛根有 6 个峰可以定量, 其他 11 个成分可用相
对迁移时间定性。
314　葛根芩连汤中成分复杂, 含有多种生物碱、黄
酮类、皂苷类成分, 采用高效液相色谱法, 即使采用
梯度洗脱也很难在一个色谱柱上使各类成分得到较
好的分离, 高效毛细管电泳的原理是利用成分在电
压的驱动下, 在电解质溶液中淌度的不同而得到分
离, 分离的效率高, 各类物质都可以得到较好的分
离, 分析时间短, 样品的处理比较简单, 体现其在中
药分析特别是中药复方的分析中的优势。
　　本法可为葛根芩连方及其他含葛根、黄芩、黄连
的方剂物质基础及配伍规律研究提供分析方法; 可
为黄连药材、葛根药材、黄芩药材及葛根芩连制剂质
量标准及其他含葛根、黄芩、黄连复方制订指纹图谱
的建立提供参考。
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蚕砂中叶绿素类金属配合物清除活性氧作用研究
冯　清1, 刘　莉1, 罗　丰1, 孙荻娜1, 李早英2Ξ
(11 华中科技大学同济医学院 医学化学系, 湖北 武汉　430030; 21 武汉大学生命科学院, 湖北 武汉　430072)
摘　要: 目的　研究蚕砂中提取、精制叶绿素类金属配合物 [ Fe2+ (É )、Cu2+ (Ê )、M n2+ (Ë )、Co 2+ (Ì ) ]作为抗活
性氧 (O ÷2 、H 2O 2、OH·) 模拟酶。方法　核黄素—蛋氨酸光照测其清除O ÷2 作用, H 2O 2 氧化维生素 C 法测其催化
H 2O 2 的分解, Fen ton2苯甲酸钠荧光法测其对OH·清除作用, 小鼠肝匀浆法测其抗脂质过氧化作用。结果　1×
10- 5～ 1×10- 6 mo löL 具有良好的清除O ÷2 作用, 活性顺序为: Cu2+ > M n2+ > Co 2+ > Fe2+ ; 约 1×10- 7 mo löL 具有
分解 H 2O 2 作用, 活性顺序为: Cu2+ > M n2+ > Fe2+ > Co 2+ ; 约 1×10- 8 mo löL 具有清除OH·的功能, 活性顺序为:
Cu2+ > Co 2+ > Fe2+ > M n2+ ; 约 1×10- 8 mo löL 可使脂质过氧化产物明显减少, 活性顺序为: Cu2+ > Co 2+ > M n2+ >
Fe2+ 。结论　蚕砂中叶绿素类金属配合物可作为抗多种活性氧 (O ÷2 、H 2O 2、OH·)模拟酶。
关键词: 蚕砂; 叶绿素类金属配合物; 抗活性氧; 脂质过氧化
中图分类号: R 286102; R 286107　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 07 0751 04
·157·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 7 期 2004 年 7 月
Ξ 收稿日期: 2003210204
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (29972035) ; 湖北省科技攻关项目 (2002P0325)
Scaveng ing effect on active oxygen of m eta l chlorophylls from silkworm excrem en t
FEN G Q ing1, L IU L i1, LUO Feng1, SUN D i2na1, L I Zao2ying2
(1. D epartm ent of M edicine and Chem istry, Co llege of Tongji, H uazhong U niversity of Science and T echno logy,
W uhan 430030, Ch ina; 2. Co llege of L ife Science, W uhan U niversity, W uhan 430072, Ch ina)
Abstract: Object　Fou r m eta l ch lo rophylls p roduced by ch lo rophyll ex tracted from silkw o rm excre2
m en t w ere u sed as varied funct ion m im icry of an t i2act ive oxygen. M ethods　T he first funct ion, scavenging
O ÷2 , has been p roved by u sing riboflavine2m eth ion ine pho to reduct ion m ethods. T he second funct ion, scav2
eging H 2O 2, has been demon stra ted by u sing the ox idat ing V c. T he th ird funct ion, scavenging OH·, has
been demon stra ted by u sing Fen ton react ion. T he comp lexes w ere m easu red by the liver homogenate tech2
n ique of m ice. Results　Fou r model compounds cou ld scavenge O ÷2 in the concen tra t ion of 10- 5—10- 6 mo lö
L and the act ivity o rder w as as fo llow s: Cu2+ > M n2+ > Co 2+ > Fe2+ . A ll cou ld decompo se H 2O 2 in the con2
cen tra t ion of 1×10- 7 mo löL and the act ivity o rder w as: Cu2+ > M n2+ > Fe2+ > Co 2+ . A ll cou ld scavenge
OH· in the concen tra t ion of 1×10- 8 mo löL and the act ivity o rder w as: Cu2+ > Co 2+ > Fe2+ > M n2+ . A ll
show ed that they had obviou s act ion of decreasing the lip id perox idat ion in the concen tra t ion of 1×10- 8
mo löL. T he act ivity o rder of an t i2lip id perox idat ion of comp lexes w as as fo llow s: Cu2+ > Co 2+ > M n2+ >
Fe2+ . Conclusion 　A ll above2m en tioned comp lexes w ere con sidered to be qualif ied m im ic enzym es of an t i2
act ive oxygen.
Key words: silkw o rm excrem en t; m eta l ch lo rophylls; an t iact ive oxygen; lip id perox idat ion
　　活性氧 (react ive oxygen species, RO S) 是指氧
的某些代谢产物和一些反应的含氧产物, 包括氧自
由基如超氧阴离子 (O ÷2 )、羟自由基 (HO ·) 等, 和一
些非自由基的含氧物如过氧化氢 (H 2O 2)。现已证实
很多疾病如自身免疫性疾病、缺血、再灌注损伤等炎
症性疾病的发生均与活性氧的损伤作用有关[1, 2 ]。但
机体却有一套严密的防御系统与之对抗, 如: 超氧化
歧化酶 (superox ide dism u tase, SOD )能清除O ÷2 , 过
氧化氢酶 (ca ta lase, CA T ) 能清除 H 2O 2; 但从动物
中提取各种酶操作繁杂, 成本很高, 且易失活等缺点
限制了其应用。笔者根据天然酶活性中心结构特点,
首次提出用天然叶绿素蚕砂提取物合成叶绿素类金
属配合物作为抗O ÷2 、H 2O 2、OH·模拟酶。本实验对
蚕砂提取物和叶绿素金属配合物清除O ÷2 、H 2O 2、
OH·和抗脂质过氧化活性进行了测试。
1　仪器与试剂
756M C 紫外2可见光谱仪、荧光光度计、分析天
平、恒温光照箱。
核黄素、蛋氨酸、亚硝基四氮蓝唑 (NBT ) 为BR
级; 过氧化氢、维生素C、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚
铁、还原铁粉、苯甲酸、氢氧化钾、磷酸二氢钾、氯化
钠、乙酸、正丁醇为A R 级; 硫代巴比妥酸 (TBA )、
十二烷基磺酸钠 (SD S) 为 Sigm a 公司产品 (加热溶
解配制成所需浓度) ; 磷酸缓冲液 (pH 7181, 0105
mo löL : 1316 g 磷酸二氢钾和 418 g 氢氧化钾配制 2
L ; pH 7140, 012 mo löL : 2712 g 磷酸二氢钾和 618
g 氢氧化钾配制 1 L )、醋酸缓冲液 (pH 3150, 20% :
200 g 醋酸和 711 g 氢氧化钾配制 1 L )。叶绿素类金
属配合物 [ Fe2+ (É )、Cu2+ (Ê )、M n2+ (Ë )、Co 2+
(Ì ) ]按文献[3 ] ]方法合成并经过光谱分析和元素分
析合格。
2　方法与结果
211　模拟酶清除O ÷2 的活性: 参考文献[4 ]改进方法
测定配合物清除O ÷2 的活性。
叶绿素M n2+ 清除O ÷2 的各浓度下的动力学曲
线见图 1。叶绿素M n2+ 对O ÷2 清除作用随其量的增
加而增大, 且其浓度从 1151×10- 6 mo löL～ 8103×
10- 6 mo löL 时, 清除率由 33124% 上升至 55196%。
模拟酶É、Ê、Ë、Ì 清除O ÷2 50% 的浓度分别为:
5130×10- 5, 3140×10- 6, 6153×10- 6, 1168×10- 5
mo löL , 即在 1×10- 5～ 1×10- 6 mo löL 均具有良好
的清除O ÷2 的活性。活性顺序为: Cu2+ > M n2+ >
Co 2+ > Fe2+ 。其中 Cu 配合物活性最大, 提示与
CuZn2SOD 结构相似有关, 模拟酶催化作用可能机
制见图 2。
212　模拟酶清除H 2O 2 的活性: 参考文献[5 ]改进方
法, 在 10 mL 比色管中, 依次加入 210 mL pH 714
012 mo löL 磷酸缓冲液, 011 mL 3190×10- 5 mo löL
模拟酶, 015 mL 114×10- 4 mo löL 维生素C 水溶液,
用蒸馏水稀释至刻度, 在 265 nm 处测定第 6 m in 时
的吸光度A 。在相同条件下, 加 013% H 2O 2 水溶液 5ΛL , 测定体系在第 6 m in 时的吸光度A ′。空白以蒸馏
水代模拟酶, 同上操作, 吸光度为A ″。∃A = A ″- A ′,∃A 空= A - A ″, 清除率为 ∃A ö∃A 空×100%。
·257· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 7 期 2004 年 7 月
A 20　B21151×10- 6 mo löL 　C22151×10- 6 mo löL
D 25102×10- 6 mo löL 　E28103×10- 6 mo löL
图 1　各浓度叶绿素M n2+ 清除O÷2 的动力学曲线
F ig. 1　D ynam ics curve of scaveng ing O÷2 of M n 2+ -
chlorophyll under d ifferen t concen tration s
2H + + 2O -2
k3
O 2+ H 2O 2
H 2O 2
k6
1ö2O 2+ H 2O
图 2　催化机制
F ig. 2　M echan ism of cata lysis
3190×10- 7 mo löL 模拟酶É、Ê、Ë、Ì 清除
H 2O 2 的清除率分别为: 28124%、48160%、42103%、
13195%。即模拟酶在 1×10 - 7 mo löL 均有分解
H 2O 2 的功能, 并且在相同时间内, 其分解率与样品
功能活性呈正相关。活性顺序为: Cu2+ > M n2+ >
Fe2+ > Co 2+ , 这种顺序反映的规律有待进一步探讨,
其可能机制见图 2。
213　模拟酶清除OH·的活性: 参考文献[6 ]改进方
法, 在 10 mL 比色管中, 加入 510 mL 012 mo löL 磷
酸缓冲液、015 mL 318 mmo löL 乙二胺四乙酸二钠
溶液、015 mL 318 mmo löL 硫酸亚铁溶液、210 mL
0102 mo löL 苯甲酸溶液和 015 mL 016 mo löL
H 2O 2, 最后加入 011 mL 210×10- 6 mo löL 模拟酶,
加至 10 mL , 摇匀, 计时, 室温反应 20 m in, 用荧光光
度计在 Κex= 330 nm , Κem = 400 nm 处测定体系的荧
光强度, 并计算清除率。空白实验以水代H 2O 2 和模
拟酶, 所得苯甲酸的相对荧光强度记为 F 0, 对照组
以水代模拟酶相对荧光强度记为 Fm ax。其他加酶的
相对荧光强度记为 F i。OH·的清除率= (Fm ax -
F i) ö(Fm ax- F 0)。
2105×10- 8 mo löL 模拟酶É、Ê、Ë、Ì 清除
OH·的清除率分别为 35159% , 74173% , 10171% ,
40193%。即模拟酶在 1×10- 8 mo löL 均具有清除
OH·的功能, 其清除率与模拟酶的功能活性呈正相
关。其活性顺序为Cu2+ > Co 2+ > Fe2+ > M n2+ 。
214　模拟酶抗脂质过氧化作用: 参考文献[4 ]改进方
法, 昆明种小鼠 18～ 25 g, 绝食 24 h, 颈椎脱臼法处
死, 用生理盐水灌洗脱血后取出肝脏, 用 200 göL 醋
酸缓冲液配制成 100 göL 肝匀浆, 备用。取匀浆 012
mL 于具塞试管中, 加 011 mL 110×10- 8 mo löL 模
拟酶, 恒温 (37 ℃)水浴槽中温育 015 h, 然后依次加
入 012 mL 81 göL SD S、115 mL 200 göL 醋酸缓冲
液、115 mL 8 göL TBA 水溶液, 沸水浴中煮沸 015
h, 取出流水冷却, 加 4 mL 正丁醇, 振荡, 以 3 000 rö
m in 离心 15 m in, 取正丁醇层, 于 532 nm 处测定A 。
空白对照以生理盐水代替模拟酶。结果见表 1。模拟
酶在约 1×10- 8 mo löL 均可使脂质过氧化产物明显
减少, 有良好的抗脂质过氧化功能。其活性顺序为:
Cu2+ > Co 2+ > M n2+ > Fe2+ 。其可能机制有待进一步
研究。
表 1　模拟酶抗脂质过氧化作用测定结果
Table 1　Properties of an til ip id perox idation
of m im ic enzyme
模拟酶 动物ö只 M DA ö(nmo l·L - 1) 抑制率ö%
对照 24 40. 5±0. 51É 6 34. 1±0. 44 18. 77Ê 6 20. 4±0. 26 49. 63Ë 6 28. 7±0. 49 29. 13Ì 6 23. 9±0. 89 40. 99
3　讨论
　　我们突破一种配合物只能模拟单一酶的概念,
成功运用蚕砂提取、精制天然叶绿素类金属配合物
作为抗多种活性氧 (O ÷2 、H 2O 2、OH·) 模拟酶, 特别
是创造性的设计了清除OH·的模型; 基于蚕砂中叶
绿素类金属配合物来源广泛、廉价、无毒、稳定性高、
比天然酶相对分子质量小并且易透过细胞和线粒体
等优点, 有望经过进一步的药理实验而运用到临床。
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RP-HPLC 法测定酸枣仁汤中棘苷和阿魏酸的含量
李玉娟, 毕开顺Ξ
(沈阳药科大学药学院, 辽宁 沈阳　110016)
摘　要: 目的　建立测定酸枣仁汤中棘苷和阿魏酸含量的 R P2H PL C 分析方法。方法　色谱柱: H ypersil C18 (200
mm ×416 mm , 5 Λm ) , 棘苷流动相为乙腈21% 冰醋酸水溶液 (17∶83) , 检测波长 334 nm ; 阿魏酸流动相为乙腈21%
冰醋酸水溶液 (16∶84) , 检测波长 320 nm , 内标物为对羟基苯甲醛。结果　棘苷和阿魏酸分别在 01960～ 13144 Λgö
mL (r= 01999 8) 和 2104～ 2712 ΛgömL ( r= 01999 7) 与峰面积线性关系良好。平均回收率分别为 9814% 和
9818% , R SD 分别为 215% 和 218%。结论　本法操作简便、快速、准确, 可用于酸枣仁汤中棘苷和阿魏酸的含量测定。
关键词: 酸枣仁汤; 棘苷; 阿魏酸; 高效液相色谱
中图分类号: R 286106　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 07 0754 03
D eterm ina tion of sp inosin and ferul ic ac id in Suanzaoren D ecoction by RP-HPLC
L I Yu2juan, B I Kai2shun
(Schoo l of Pharm acy, Shenyang Pharm aceu tical U niversity, Shenyang 110016, Ch ina)
Abstract: Object　To develop an R P2H PL C m ethod fo r determ inat ion of sp ino sin and feru lic acid in
Suanzao ren D ecoct ion (SZRD ). M ethods　H ypersil C18 co lum n w as u sed. T he mob ile phase con sisted of
aceton it rile2w ater w ith 1% glacia l acet ic acid (17∶83) fo r sp ino sin and (16∶84) fo r feru lic acid. D etec2
t ion w avelength s w ere set a t 334 and 320 nm , respect ively. T he in ternal standard w as p 2hydroxyben2
zaldehyde fo r feru lic acid. Results　T he linear ranges fo r sp ino sin and feru lic acid w ere 01960—13144 Λgö
mL ( r = 01999 8) and 2104—2712 ΛgömL ( r = 01999 7) , respect ively. T he recoveries fo r them w ere
9814% and 9818% , respect ively. T he R SD w ere 215% and 218% , respect ively. Conclusion 　T h is
m ethod is simp le, rap ids and accu ra te, and can be u sed fo r the determ inat ion of sp ino sin and feru lic acid in
SZRD.
Key words: Suanzao ren D ecoct ion (SZRD ) ; sp ino sin; feru lic acid; H PL C
　　酸枣仁汤出自《金匮要略》, 由炒酸枣仁 18 g、茯
苓 10 g、川芎 5 g、知母 10 g、甘草 3 g 组成。方中酸
枣仁养肝血、安心神, 为君药; 川芎调血养肝、茯苓宁
心安神, 为臣药; 知母滋阴降火、清热除烦, 为佐药;
甘草和中缓肝, 为使药。本方临床主治肝血不足, 虚
火内扰心神所致的心烦失眠等症[1 ]。已有研究表明
酸枣仁的君药酸枣仁中棘苷和臣药川芎中阿魏酸为
该复方重要镇静、催眠的有效成分[2 ]。本实验采用
R P2H PL C 法对酸枣仁汤中棘苷和阿魏酸含量进行
测定, 以期为客观、全面评价酸枣仁汤质量和完善该
复方中药的质量标准提供实验依据。
1　仪器与药品
L C—10A 高效液相色谱仪 (日本岛津公司) ;
SPD—10A 紫 外 检 测 器 ( 日 本 岛 津 公 司 ) ;
Ckch rom —ch rom atography 数据采集系统; ZFQ —
85A 型旋转蒸发仪 (上海医械专机厂)。
乙腈、甲醇 (色谱纯) , 水为重蒸水, 其他试剂均
为分析纯; 棘苷对照品由本教研室提供 (纯度>
98% ) ; 阿魏酸对照品购自中国药品生物制品检定
所。炒枣仁、茯苓、川芎、知母与甘草购自沈阳天益堂
药店, 经沈阳药科大学生药鉴定研究室许春泉高级
工程师鉴定, 粉碎, 过 60 目筛, 备用。
·457· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 7 期 2004 年 7 月
Ξ 收稿日期: 2003210215
作者简介: 李玉娟 (1975—) , 女, 山东泰安市人, 药学博士, 主要从事复方中药药效物质基础和质量控制方法研究。