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Application of gene chip technology to medicinal plant researches

基因芯片技术在药用植物研究中的应用



全 文 :中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第3s卷第lO期2005年10月· 441·
·中药现代化论坛·
基因芯片技术在药用植物研究中的应用
朱华。吴耀生。
(广西医科大学生物化学与分子生物学教研室,广西南宁530021)
摘要:基因芯片技术是近年来迅速发展起来的一项生物技术。由于其具有大规模、高通量,平行检测等优势,已在
多个领域得到广泛应用。根据新近的研究资料讨论该技术在药用植物中最新的应用情况,包括分离差异表达的基
因及发现新基因、功能基因组学的研究、中药的鉴定、转基因药用植物的检测、药用植物作用分子机制及病害的相
关研究等内容,并简要介绍其存在的问题及未来应用的展望。
关键词:基因芯片技术F药用植物;应用
中圈分类号:R282.12 文献标识码:A 文章编号:0253—2670(Z005)lo1441—04
Applicationofgenechiptechnologytomedicinalpl ntresearches
ZHUHua.WUYaosheng
(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,GuangxiMedicalUniversity,Nanning330021,China)
Abstract:Recently,genechiptechnologyhasbecomearapidlyevelopedbiotechnology.Itc ntains
SOmanyadvantagesincludinglar e—scale·highflux,andparallelismthatit hasbeenwidelyappliedin
manyfields.Inthispaper,theupdatedadvances013.applicationsofgenechiptechnologytomedicinalpl nt
researchesarediscussedandthecontentsarerangedfromisolationofdifferentiallyexpressedgenes,dis
coveryofnewgenes,researchonfun tionalgenomics,identificationofCh nesemateriamediea,detection
ofgeneticallytransformedmedi nalplants,andthemolecularmechanismsofmedicinalpl ntpharmacolo—
gYandtheirdiseasesaswell.Someproblemsandprospectsrelatedothetechnologyarealsobrieflypre—
sented.
Keywords:genechiptechnology;medicinalplant;application
基因芯片或微阵列技术于20世纪80年代提
出,90年代初期迅速发展。此项技术已在基因表达
水平分析、新摹因发现、目的基因分离、核酸序列测
定、基因突变检测、基因多态性分析等方丽得到广泛
应用,成为高效率、大规模获取相关基因信息及后基
因组时代基因功能分析最重要的技术之一。有人曾
以”微阵列技术铺平了通向21世纪的医学之路”高
度评价了该项技术在生命科学中举足轻重的作用。
目前+拟南芥和水稻的基因组测序工作已经完成,玉
米和大豆的基因图绘制也在进行之中,这些研究成
果为基因芯片技术在植物研究中的应用奠定了基
础。其在药用植物研究中的广阔应用前景也备受关
注。近年来该项技术已在药用植物研究中得到较为
广泛的应用。本文着重综述近两二年来该技术在药
用植物研究中的最新应用进展。
1分离差异表达基因及发现新基因
生物体的特性由内在基因表达决定。同一机体
的各种细胞含有相同的遗传信息,即相同的结构基
因,它们在各种细胞中并非同时表达,而是具有时空
的差异性。基因的差异表达调控着植物发育、分化、
衰老、抗逆等生命过程。因此将不同来源的植物材
料,即不同的组织器官、发育时间、生活的环境条件、
生理状态的样品与含有代表该植物基因的寡核苷酸
或eDNA片段的基因芯片杂交,即可得知不同条件
下各基因是否表达及各自表达的程度。不同的环境
对植物基因表达的影响在实验室即可获得,而无须
进行耗费时间及财力的田间试验。目前,利用基因芯
片技术分离差异表达的基因无疑是植物研究领域的
眭藕日期:g005一O卜2l
基金项目;广西科学蓦金资助(桂科白03420033)
作者简介:朱华(1979一),女,广西桂林人,在读硬士,研究课题为三七皂苷台成相关基因的研究
Email:zhubaoba01213@126tom
*通讯作者 吴耀生Tel:(0771)5358817 Email:wuyaoshcn903@sina.COm
万方数据
‘1442‘ 中草药ChineseTraditionalandHerba|l*ugs第36卷第lo期2005年10月
重要方向和热点之一。根据集成在芯片上DNA片
段的不同可将基因芯片分为寡核苷酸微阵列芯片和
cDNA微阵列芯片两种。前者一般要依赖于对基因
序列有所了解,而eDNA微阵列在缺乏任何序列信
息的情况下也可进行差异表达的分析,并由此可能
发现未知的新基因。
Rabbani等用含有1700条独立的水稻cDNA
片段的cDNA微阵列来分析寒冷、干旱、高盐及脱
落数诱导的水稻基因表达的差异情况。一共发现了
73个基因受胁迫诱导;36、62、57、43个基因分别受
寒冷,干旱,高盐和脱落酸诱导。其中有58个基因是
从未报道过的“]。Kimura等用水稻DNA微阵列研
究DNA修复基因的表达情况,发现大多数切除修
复的基因在顶端分生组织的表达要比成熟的叶子中
的表达强得多口]。无疑,该项技术也适用于药用植物
的相关研究。美国密歇根卅l立大学的Yang等用含
有2278个基因的cDNA微阵列来分析洋槐
(RobiniapseudoacaciaL.,bl cklocust)树干的基
因表达变化的情况。结果表明基因的表达随树干取
材部位的不同而有差异。例如,编码糖转运蛋白的基
因在边材中高表达,而参与类黄酮生物合成的基凶
在边材~心材的过渡带呈上调趋势。此次试验还建
市了341种未知基因的表达图谱ol。
2功能基因组学研究方面的应用
模式植物拟南芥巾已:旨超过25000个基因被成
功测序和作图,然而功能明确的基因却少于l5%,
同样,在水稻的超过55000个的预测基因申约有半
数的基因功能尚不明确一“。每年都有大量的药用植
物基因被克隆测序并在GenBank巾注册。植物基因
组学今后研究的重点将从结构基因组学转移到功能
基因组学。功能基因组学研究的内容是利用结构基
因组所提供的信息,发展和应用新的试验手段,系统
地分析基因的功能口]。基因芯片技术是当今研究功
能基因组学的工具箱中重簧的一员。它具有小型化、
自动化及大规模平行检测的优势,可以从多个样品
中获得整个基因的定量生物学信息o]。利用该技术
研究基因的功能大体有几种策略:(1)通过研究基因
的时空表达模式确定其在细胞学和发育学上的功
能;(2)通过比较研究自发或诱发突变体与其野生型
植株在特定环境条件下基图表达的差异来获取基因
功能的可能信息。后者即传统的突变方式加上高通
量的检测方法,在植物功能基因组的研究中将会越
来越重要”]。上文提到的分离差异表达基因也在一
定程度上提供了相应的基因功能。
Feng等从消减的棉花cDNA文库中得到5种
基因家族(PRPs、AGPs、expansins、tubulins和
I。TPs)共32个独立的cDNA制成微阵列,以开花后
不同天数的棉花纤维RNA为探针分别与芯片杂交。
结果说明这5种基因家族在棉花纤维的延长阶段具
有重要作用,H1。目前,基因芯片技术在药用植物功能
基因组学方面的研究报道虽较少,但可以大胆预测运
用这项技术可寻找药用植物有效成分合成的相关基
因、筛选出促进药用植物生长发育及抗逆的基因,为
进一步利用基因工程的方法提高有效成分的合成、培
育高产量的抗逆植物奠定基础,更有效地保护我国药
用植物资源特别是某些珍稀药用植物资源。
3中药的鉴定
中药材通常经过处理而成为干药材,一般凭性
状辨别不同的类别,有时连专家也感到困难。尤其是
要鉴90外观类似但药性及价值均差别很大的草本药
材,更为棘手。若能将基因芯片技术用于中药的鉴别
相信可以解决一些难题。
利用这一技术的前提是应用分子生物学技术找
出待鉴定中药的特定寡核苷酸序列,并将其集成在
芯片上。然后提取样本DNA进行扩增,荧光标记后
与芯片杂交。若样本中存在与之互补的序列即可检
测出来。李绍平等人将川贝母5SrRNA的一段特异
序列做为探针制成芯片,用该芯片能准确地鉴定出
真正的高效低毒、价格昂贵的川贝母。基因芯片还可
用于药用植物种属的验证。这种检测的方法与卜述
方法不同,是将针对药用植物不同种属某基因多态
性片段的寡核苷酸探针全部集成于芯片上,并设计
特异引物,将来自于不同种属的PCR产物与芯片杂
交,即得到结果。香港大学的研究者们将l6种石斛
(HerbaDendrobii)的11ISl5.8一 TS2合并序列集
成于玻片上,用荧光标记的ITS2序列为探针与之
杂交,不同种的石斛即可在芯片的不同位置获得杂
变信号‘⋯。
需要指出的是,基因芯片是从遗传学的角度来
鉴别中药。但中药药效成分大多是次级代谢产物,因
而基因芯片鉴定的是中药的真伪而不是中药的优
劣。并不能取代中药化学成分指纹图谱等的鉴定。
4检测转基因药用植物
1988年,第1例转基因植物(烟草)试验成
功o。]。全世界现已有超过73个品种的转基因作物
获准可进行商业化种植,转基周药用植物也应运而
生。人们可以通过基因技术从遗传上改变现存药材
的有效成分,甚至给某些植物附加一些新的遗传成
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第10期2005年10月· 443·
分.成为“转基因药用植物”。如可供生产狂犬病口服
疫苗的转基因西红柿、含有7一亚麻酸的转基因油籽
植物、药用的转基因烟草等。它们被称为“新世纪的
品种”,但其安全性也令人担忧。因此,对转基因植物
进行检测和标识已势在必行。一般在转基因植物中
装入了基因表达所需要的启动子、终止子序列,为方
便筛选还箍合了报告基因和抗性基因等标志序列。
针对这些特点,即使对转入的目的基因并不了解,通
过检测这些标志基因序列便可对转基因植物进行鉴
定。目前,国际上常用的转基因产品检测方法有酶联
免疫吸附法、PCR一电泳检测、荧光定量PCR检测等
技术。这些方法一次只能对单个基因进行检测,在对
含有多种转基因成分的样品进行检测时,极易漏诊。
基因芯片技术正好弥补此缺陷,非常适合同时检测
转基因植物中大量的外源基因。
黄迎春等人选用常用的两种报告基因、两种抗
性基因、两种启动子序列和两种终止子序列为探针
制成基因芯片。对4种转基因植物水稻、木瓜、大豆、
玉米进行了稳测。Bordoni等用微阵列技术结合
LDR(1igationde ectionreaction)对转基因玉米进
行了检测“⋯。Germini甚至用肽核酸(PNA)芯片对
转基因大豆进行了检测[1“。我国首张转基因商品检
测芯片已在上海亮相,该芯片可以鉴别40种基因,
同时还能判断被检测的转基因植物是否属于国家批
准物质,整个检测过程只需4h。随着转基因药用植
物品种不断出现,该技术也将能应用于检测转基因
药用植物。
利用基因芯片技术检测转基因植物的潜力是显
而易见的,但要成功地利用该技术评价转基因植物
的安全性还需要建立相应的数据库。该数据库中应
包含植物在不同的发育阶段,不同的环境条件下基
因表达变化的信息o⋯。
5研究药用植物作用的分子机制
中草药化学成分复杂,有效成分不清且定性、定
量困难,个体差异大。长期以来,中草药药效作用机
制的研究往往局限于传统的中医药理论,难以应用
现代生物医学知识做为理论基础,缺乏可以量化的
现代生物医学指标。如蛋白质水平和基因表达水平
方面的量化指标等。因此中药的现代化研究难度较
大且难于得到国际上的普遍认可。而借助基因芯片
技术,有可能研究药物对基因表达水平的影响,从而
为揭开中药的作用机制提供了有效工兵。
利用基因芯片技术研究药用植物作用的分子机
制的思路一般是:在细胞或动物水平上建立给药、对
照组,分别提取各组mRNA,反转录为eDNA,掺入
标记分子与芯片杂交得到基因表达差异谱。根据基
因表达的变化,从eDNA推导出蛋白质。由于很多
蛋白质功能已经了解,从而有可能推导出药物的作
用机制。Li等研究了知母根中提取的皂苷成分对心
血管疾病的作用机制。通过采用含有87条人类心血
管疾病相关基因制成的芯片,得到用皂苷处理的人
脐静脉内皮细胞及未处理细胞的基因差异表达谱。
结果表明,在皂苷处理的细胞中血管紧张素原基因、
n2A一肾上腺索受俸基因、内皮紊转运酶1基因分别
下调了2.8、1.9、3.1倍。说明皂苷通过调节内皮细
胞的功能对心血管疾病起良性作用[_“。Yin等在用
cDNA微阵列研究半枝莲Scutellariabarb taD.
Don的抗癌机制中发现l6个基因(包括DNA损
伤、细胞周期调控、蛋白质磷酸化的相关基因)上调
了5倍以上,提示这些过程可能参与了半枝莲诱导
的癌细胞死亡口⋯。
此外,利用基因芯片还可通过比较正常组织(细
胞)及病变组织(细胞)中大量相关基因表达的变化,
从而可将所发现的一组疾病相关基因做为药物筛选
的靶标,进~步用于筛选中草药的有效成分,甚至可
发现新的药用成分。在研究中草药的毒副作用时,若
某种正在筛选的药用成分作用靶细胞得到的基因表
达图谱与已知的具有毒副作用的药物得到的基因表
达图谱相似,就要考虑是否停止药物的开发。
Nuwaysir等已研制出包括涉及细胞凋亡、DNA复
制和修复、细胞周期调控、转录因子等约2090个基
因的毒理芯片(ToxChipv1.o)。该芯片既可用于毒
物的检测和遗传多态性的检测,又可用于受检毒物
的毒副作用机制的检测““。
6应用于药用植物病害的研究
s.1药用植物病害的诊断:随着基因组测序方法的
改进,大量的药用植物病原基因组被解码,许多
EST已经公布。收集这些EST,或是从病原物的
cDNA克隆中获得病原物的eDNA片段制作成植
物检测芯片,可用于植物病害的快速诊断,进而可在
发病前进行有效的防治。
2003年6月Lee等首次报道了用eDNA微阵
列芯片来检测植物病毒。该植物病毒芯片所包含的
cDNA片段来自4种葫芦科植物易感染病毒的cD—
NA克隆。试验结果表明该芯片成功地检测了特异
的目的病毒”“,其灵敏度可与El,ISA相媲美o”。基
因芯片技术不仅仅只是用于植物病毒的检测,而且
可用于所有病原体的检测,是一种高度平行化的现
万方数据
·1444· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第10期2005年10月
代诊断技术。将大量药用植物易感病原物的特异且
保守序列集成在芯片上,通过检测即可知道某种药
用植物是否受到感染或是受哪些病原物的感染。
6.2研究药用植物与病原体相互作用机制:植物与
病原的相互作用是一个长期进化的过程,病原对植
物的系统性侵染需要病原能够改造宿主细胞以利于
侵染。这些改造包括诱导宿主的复制因子和抑制宿
主的防御反应,而这些过程都有可能与改变宿主的
基因表达有关。过去研究病原侵染易感宿主后引起
的基因表达变化的情况都局限于仅有少数基因,要
获得更多的认识则需要用到基因芯片技术o⋯。
Narusaka等人用包括7000个拟南芥基因的eDNA
微阵列研究受甘蓝链格孢菌Alternariabrassicicola
侵染后基因表达谱的变化情况。结果显示:pad3—1
突变型不仅改变了抗毒素camalexin的积累,且许
多参与防御反应的基因得到适时地表达,因而对A.
brassicicola具有抗性”“。可见,应用基因芯片技术
研究植物与病原的相互作用机制不仅有利于明确植
物的抗病机制,而且对于发现致病基因、抗病基因,
为病害的诊断和治疗均提供了信息。尽管这方面的
应用在药用植物中还未广泛开展,但若要全方位保
护药用植物资源,走可持续利用的遭路,这一方面的
研究当然也是不可或缺的。
7问题与展望
基因芯片技术发展到今天不过短短十多年,却
已经取得了令人瞩且的成绩。虽然还存在这样或那
样的一些关键问题有待解决,如基因芯片特异性的
提高;样品制备及标记操作的简化,增加信号检测的
灵敏度及稳定性;高度集成化样品制备、基因扩增、
核酸标记及检测仪器的研发;降低成本以利于普及
等。但不可否认的是该技术在生物学和医学基础研
究、农业、疾病诊断、新药开发、食品、环保等已呈现
出巨大的应用前景。随着研究的不断深入和技术的
更加完善,上述问题终将会逐步解决。Ku等已研究
出在杂交液中加入右旋糖苷硫酸盐可减少反应所需
的时间及提高灵敏度1213;Konishi提出3参数的对
数正态分布模型可以简化芯片的数据分析,且具有
普遍适用性口“。基因芯片技术将从根本上改变目前
生物学和生物技术的观念和效率,同时给社会带来
无限商机。它是继大规模集成电路之后的又一次具
有深远意义的科学技术革命。
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基因芯片技术在药用植物研究中的应用
作者: 朱华, 吴耀生, ZHU Hua, WU Yao-sheng
作者单位: 广西医科大学,生物化学与分子生物学教研室,广西,南宁,530021
刊名: 中草药
英文刊名: CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年,卷(期): 2005,36(10)
被引用次数: 5次

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引证文献(5条)
1.唐玲 基因组学在中药研究中的应用进展[期刊论文]-教育教学论坛

2013(44)
2.杨义强.王春艳 基因芯片技术在药学研究中的应用[期刊论文]-齐鲁药事 2009(5)
3.王明艳.蔡宝昌 生物芯片技术及其在中医药研究中的应用[期刊论文]-生物学通报 2007(7)
4.魏松红.刘志恒.纪明山.谷祖敏.王英姿.张杨.祁之秋 基因芯片技术在植物病害中的应用[期刊论文]-河南农业科
学 2008(3)
5.赵兴玲 中药有效成分分离分析及活性筛选的毛细管区带电泳研究[学位论文]硕士 2006


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