全 文 ：·药理实验与临床观察·
人参总皂苷诱导 K562细胞凋亡的实验研究
陈婷梅 1 ,王亚平 2 ,陈地龙 2 ,李　静 2
( 1. 重庆医科大学 检验系临床免疫学教研室 ,重庆　 400016; 2. 重庆医科大学 组织胚胎学教研室 ,重庆　 400016)
摘　要: 目的　研究人参总皂苷诱导白血病细胞凋亡及其机制 ,为进一步开发人参总皂苷提供实验依据。方法　采
用细胞体外培养、图象分析技术、流式细胞术 、形态学观察与免疫细胞化学等方法 ,研究人参总皂苷诱导 K562细胞
凋亡。 结果　人参总皂苷对 K562细胞有增殖抑制作用 ,并可诱导 K562细胞凋亡明显增加 ,同时 K562细胞癌基
因产物 C-M YC, BCL-2表达明显降低。 结论　人参总皂苷能诱导 K562细胞凋亡 ,其机制可能与调控癌基因产物
的表达有关。
关键词: 人参总皂苷 ; K562;凋亡
中图分类号: R733. 7; R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 03 0235 03
Experimental study on effect of apoptosis of K562 cells treated with TSPG
CHEN Ting-mei
1
, W ANG Ya-ping
2
, CHEN Di-long
2
, L I Jing
2
( 1. Depar tment of Clinical Immuno logy, Chongqing Univ ersity o f Medica l Sciences, Chongqing 400016, China;
2. Depa rtment o f Histolog y and Embryolog y , Chongqing Univ er sity o f Medical Sciences, Chongqing 400016, China)
Abstract: Object　 To cla rify the mechanism fo r total saponins of Panax ginseng C. A. Mey. ( TSPG)
inducing K562 cells to apoptosis, and to provide the theo retical basis and the experimental evidence of
T SPG s clinical applica tion. Methods　 By using in vitro cel l culture, morphometry, f low cytometry , mo r-
pho logical inv estiga tion and immunocytochemist ry , the ef fects of TSPG on apopto sis in K562 cells w ere
studied. Results　 The results indicated that TSPG could inhibi t the pro liferation o f K562 cel ls significant-
ly , and induce K562 cells to apopto sis. It w as also showed in the experiments that a fter induced by TSPG,
the ra tio of posi tiv e K562 cells expressing C-MYC and BCL-2 is decreased. Conclusion　 The mechanism
fo r TSPG to induce K562 cells to apopto sis may be rela ted to the expression of oncogene in K562 cells.
Key words: to tal saponins of Panax ginseng C. A. M ey ( TSPG) ; K562 cells; apopto sis
　　人参是祖国传统医学的“补气”要药 ,以其攻补
兼施 ,毒副作用小 ,注重整体的优越性已得到广泛认
可。人参皂苷是其中的主要药物成分。研究表明人
参总皂苷 ( tota l saponins of Panax ginseng C. A.
Mey. , TSPG)对造血干、祖细胞的增殖分化有显
著的促进作用 [ 1]。此外 , TSPG还对 K562, HL-60细
胞具有增殖抑制和诱导分化作用 [ 2]。本实验采用现
代生物学技术探讨 TSPG对白血病细胞诱导凋亡
的影响及基因调控 ,旨在寻找和开发能抑制白血病
细胞增殖并诱导其分化和凋亡的毒副作用小或无的
中药诱导剂。
1　材料与方法
1. 1　材料:人参总皂苷:重庆中药研究所刁长发教
授惠赠 ,纯度 95% 以上 ,用 RPM I-1640液配成所
需浓度。 K562细胞:由本校临床生化教研室惠赠 ,
用含 10% 小牛血清的 RPM I-1640液常规传代培
养。 RPM I-1640培养基:美国 Gibco公司产品 ;小牛
血清 (批号 990402)购自杭州四季青公司。 小鼠抗
人 C-MYC, BCL-2单克隆抗体、 SP染色组化试剂
盒购自北京中山生物技术有限公司。 TUN EL检测
试剂盒: Roche公司产品。
1. 2　实验方法
1. 2. 1　 TSPG对 K562细胞的增殖抑制作用:取对
数生长期的 K562细胞 ,使细胞终浓度为 1× 105 /
mL。 实验组: 培养体系中加入不同浓度的 TSPG
( 50, 100, 200μg /m L) ;对照组: 加等量的 RPM I-
·235·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 3期 2003年 3月
收稿日期: 2002-10-28基金项目:国家自然科学基金项目 ( 39670880) ;重庆市中医药科学基金项目作者简介:陈婷梅 ( 1969— ) ,女 ,重庆市人 , 1992年获检验医学学士学位 , 1995年获临床检验诊断学硕士学位。现在重庆医科大学检验系临床免疫学教研室任讲师。 主要研究方向:造血调控及其机制的研究 ,肿瘤细胞逆转、分化和凋亡及其机制的研究。
Tel: ( 023) 68733240 ( O) , ( 023) 68733235 ( H)　 E-mail: ch en ting mei@ soh u. com
1640液。 分别在培养的 2, 4, 6 d取样 ,进行台盼蓝
染色 ,计数活细胞数。
1. 2. 2　细胞周期测定: 取对数生长期的 K562细
胞 ,使细胞终浓度为 1× 105 /mL。实验组: 在培养体
系中加入终浓度为 100, 200μg /mL TSPG;对照组
加入等量的 RPM I-1640液 ,培养 3 d,经流式细胞
仪检测 ,分析得出细胞周期各时相的比例。
1. 2. 3　细胞光镜形态学观察: 取各实验组 ( 100, 200
μg /mL作用 6 d)和对照组的细胞离心甩片 ,瑞氏染
色 ,光镜下观察细胞形态学改变。每例用图象分析仪
随机测量 300个细胞 ,计算凋亡细胞的百分率。
1. 2. 4　电镜超微结构观察:取实验组和对照组的细
胞经 3% 戊二醛固定 ,经脱水、环氧树脂包埋超薄
切片 ,染色后用 H-600透射电镜观察。
1. 2. 5　 TUN EL检测试剂盒观察凋亡细胞:方法按
试剂盒说明书进行。
1. 2. 6　 T SPG对 K562细胞表达的癌基因产物 C-
MYC, BCL-2的影响:取对照组和实验组细胞 , PBS
洗涤后离心甩片 ,以小鼠抗人 C-MYC, BCL-2单克
隆抗体进行免疫细胞化学 SP法染色 ,同时设立不
加一抗的阴性对照组 ,图象分析仪计数每例 300个
细胞 ,计算表达阳性率。
2　结果
2. 1　 TSPG对 K562细胞的增殖抑制作用:结果显
示 TSPG对 K562细胞的增殖抑制作用与药物的浓
度和作用时间有关 (图 1)。
1-对照　 2-TSPG 100μg /m L　 3-T SPG 200μg /m L
1-cont rol　 2-TSPG 100μg /m L　 3-TSPG 200μg /m L
图 1　人参总皂苷对 K562细胞增殖抑制作用
Fig. 1　 Inhibition of TSPG on proliferat ion of K562 cells
2. 2　 TSPG对 K562细胞周期的影响:对照组细胞
S期占 58. 02% , G2+ M期细胞为 3. 46% ,而 G0 /
G1细胞占 37. 49% ,说明 K562细胞处于增殖旺盛
状态。 K562细胞经 TSPG 100μg /mL作用 3 d,细
胞周期各时相比例与对照组无显著性差异 ,处于
sub-G1期的凋亡细胞百分比为 6. 35%。而 K562细
胞经 TSPG 200μg /mL作用 3 d, S期占 43. 44% ,
G2+ M期细胞为 3. 91% , G0 /G1细胞为 52. 65% ,
与对照组细胞相比有显著性差异 ,处于 sub-G1期
的凋亡细胞百分比为 12. 66% ,表明 TSPG 200μg /
mL作用 K562细胞 3 d能阻止 K562细胞从 G0 /
G1期向 G2 /M+ S期移行 ,并能诱导部分 K562细
胞呈现 sub-G1期的凋亡峰 ,从而发生凋亡。见表 1。
表 1　 TSPG对 K562细胞周期的影响
Table 1　Ef fect of TSPG on cell cycle of K562 cells
组别 剂　量
/ (μg· mL- 1)
细胞周期 /%
G0 /G1 S G2+ M
对照 - 37. 49± 4. 63 58. 02± 5. 97　 3. 46± 2. 25
TSPG 100 44. 13± 2. 45 51. 92± 4. 01 3. 87± 2. 26
200 52. 60± 6. 15* 43. 44± 7. 22* 3. 91± 1. 69
　　与对照组比较: * P < 0. 01
　　* P < 0. 01 vs con t rol g rou p
2. 3　光镜形态学观察: 经 100, 200μg /mL TSPG
作用的 K562细胞 ,部分细胞呈现典型的凋亡细胞
形态学改变 ,细胞体积缩小 ,胞浆凝缩 ,部分细胞核
固缩呈均一致密物 ,部分细胞核核膜消失 ,细胞核断
裂呈小块或碎片状 ,但细胞膜完整并可见凋亡小体。
此外 ,还有部分细胞胞体减小 ,核 /浆比例减小 ,形态
趋向成熟方向分化 ,见表 2。
表 2　 TSPG对 K562细胞凋亡的影响
Table 2　Ef fect of TSPG on apoptosis of K562 cells
组别 剂　量
/ (μg· mL- 1 )
凋亡细胞阳性率 /%
形态学检测法 TUN EL检测法
对照 - 　　 2. 0± 0. 3 　　 3. 9± 1. 2
TSPG 100 12. 7± 2. 8* 39. 4± 3. 9*
200 36. 7± 2. 4* 61. 2± 3. 4*
　　与对照组比较: * P < 0. 01
　　* P < 0. 01 vs con t rol g rou p
2. 4　电镜超微结构观察: 凋亡细胞胞浆浓缩 ,电子
密度增加 ,部分细胞核染色质固缩凝集成块 ,部分细
胞核裂解为碎块。
2. 5　 TUN EL检测试剂盒观察凋亡细胞: 经 100,
200μg /m L TSPG作用 1 d的 K562细胞 , TUN EL
检测凋亡细胞阳性率与对照组相比有显著性差异 ,
见表 2。
2. 6　 TSPG 对 K562 细 胞表 达癌基 因产 物
C-MYC, BCL-2的影响: 200μg /mL TSPG作用 6
d, K562细胞的 C-MYC, BCL-2表达均降低 ,与对
照组相比有统计学意义 ;而 100μg /mL T SPG作用
·236· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 3期 2003年 3月
后 K562细胞的 BCL-2表达降低 , C-MYC降低不
明显 ,见表 3。
表 3　 TSPG对 K562细胞 C-MYC, BCL-2表达的影响
Table 3　 Effect of TSPG on expression
of C-MYC, BCL-2 in K562 cells
组别 剂　量
/(μg· mL- 1)
阳性率 /%
C-M YC BCL-2
对照 - 　　 89. 93± 9. 66 　　 91. 33± 8. 27
T SPG 100 87. 26± 3. 22 85. 36± 4. 02*
200 76. 80± 4. 65* 79. 95± 4. 36*
　　与对照组比较: * P < 0. 05
　　* P < 0. 05 vs cont rol group
3　讨论
　　细胞凋亡是受基因调控的主动的细胞死亡过
程 ,有其特征性的形态和生化特征。凋亡细胞的主要
特征是细胞增殖抑制 ,流式细胞仪检测出现凋亡细
胞特征峰 ( sub-G1峰 ) ,细胞胞浆浓缩致密 ,核染色
质凝集 ,核裂解形成凋亡小体和核 DNA断裂成
180～ 200 bp的小片段。本实验从形态学、流式细胞
仪和 TUN EL检测来确认细胞凋亡的发生。从增殖
抑制曲线来看 , 100, 200μg /mL TSPG均能使 K562
细胞数量明显下降 ;用流式细胞仪检测也表明: 100,
200μg /mL TSPG均能使 K562细胞发生凋亡 ,凋
亡细胞百分率分别为 6. 35% , 12. 66% ,而且 200
μg /mL TSPG还能阻止 K562细胞从 G0 /G1期向
G2 /M+ S期移行 ;从光镜、电镜形态学上观察了
T SPG诱导 K562细胞凋亡的情况 ,均发现有典型
的凋亡细胞 ,并可见到凋亡小体。此外 ,本实验采用
检测细胞核 DNA断裂的 TUN EL法对单个细胞凋
亡做原位检测 ,结果表明: 100, 200μg /mL TSPG均
能使 K562细胞凋亡阳性率增加 ,且细胞核 DNA
断裂早于形态学改变 ,也提示细胞凋亡是一有序、有
调控的走向死亡过程。
从实验结果中还发现: 100, 200μg /mL TSPG
不仅能诱导 K562细胞凋亡 ,还可诱导 K562细胞
向红系、粒系较成熟细胞方向分化 [2 ] ,提示 TSPG
对细胞增殖、分化和凋亡均有影响 ,但其具体作用方
式不清楚。文献报道白血病细胞凋亡与其所处分化
状态有关 ,处于分化状态的白血病细胞更易被诱导
凋亡 [ 3 ] ,如全反式维甲酸在诱导细胞分化的同时也
能诱导凋亡的发生 [4 ] ,或诱导细胞凋亡和细胞分化
分别发生 [5 ]。本实验证实了前者 ,即在诱导细胞分化
的同时也能诱导细胞凋亡的发生 ,此现象的产生提
示 T SPG诱导白血病细胞分化与凋亡的机制可能
存在内在的联系 ,其机制有待进一步研究和阐明。
原癌基因 bcl-2有很强的抑制细胞凋亡的能
力 ; BCL-2蛋白广泛存在于细胞的线粒体膜、细胞
膜内表面、内质网、核膜等处 , BCL-2蛋白的高表达
能阻断多种细胞毒药物及 X线诱发的白血病细胞
凋亡 [6 ]。在多种人类肿瘤细胞中都发现有 c-myc基
因的高表达 ,它能促进细胞增殖 ,抑制细胞分化 ,人
类 c-myc基因编码 DNA结合蛋白 , C-MYC蛋白
作为重要的转录调节因子 ,既可激活介导细胞增殖
的基因 ,也可激活介导细胞凋亡的基因。本实验利用
免疫细胞化学技术检测了 TSPG作用前后 K562细
胞 BCL-2, C-MYC的表达情况 ,结果表明 100, 200
μg /mL TSPG作用 K562细胞 BCL-2表达降低 ,提
示 TSPG诱导 K562细胞凋亡的机制可能与对
BCL-2的调控有关。此外 , 200μg /mL TSPG还能
使 K562细胞 C-MYC降低 ,而 100μg /mL TSPG
作用后 K562细胞 C-MYC降低不明显 ,这与细胞
周期的检测结果相符 ,这可能是 TSPG抑制 K562
细胞增殖的机制之一。
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保　护　植　被　　造　福　子　孙
·237·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 3期 2003年 3月