全 文 ：中草药 第 卷第 期 年 月 ·
飞」匕月‘尸广
亦有作用 。 笔者从苦瓜果肉中提取的苦瓜素为水
溶性蛋 白质 , 体外 实验 显示 出 良好 的抗 效
果 。 本实验结果显示 , 苦瓜素可明显降低 感
染小鼠的死亡率 , 提高其生存率 , 减轻心肌组织的病
变程度 , 并且通过抑制 复制 , 在病毒复
制的分子水平具有 明显的抗病毒作用 , 使急性期心
肌组织病毒滴度 明显降低 。 苦瓜素组血清肌钙蛋
白一 明显低于模型组 , 表明苦瓜素治疗组小 鼠心肌
损伤程度明显减轻 。 结果提示苦瓜素可能成为一种
有 效 的 抗 感 染 的 药物 , 对 小 鼠
心肌炎具有肯定的抗病毒及保护心肌的作用 ,
但其抗病毒 的具体机制 是直接抑制 病毒 复
制 , 还是通过增强机体的免疫功能而起抗病毒作用 ,
有待进一步研究 。
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糖肾平对糖尿病小鼠基因表达的调控作用
任 教 , , 王 兴 , , 徐 思2, 郝晓锋 ‘
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. 康弘药业集团 · 成都法玛基因科技有限公司 , 四川 成都 610036 ; 2. 四川大学华西药学院 , 四川 成都 610041)
中药药理研究是目前中药现代化研究的瓶颈之
一 。 由于中药是群体化合物 , 相对西药复杂化 , 具有
多效性 、 多途径 、多靶点的特点 , 对其中不同成分功
能效果 的解读是一个极其浩大的工程 , 利用 目前的
研究手段无法解决这一问题 。 基因芯片具有高通量 ,
同时检测成千上万个基因表达的水平 , 将其运用于中
药药理的研究 日益得到关注 , 本实验即利用该技术探
讨中药糖肾平对糖尿病小鼠肝脏和肾脏两个重要代
谢器官基因表达水平的调控情况及相关信息研究。
1 材料
1. 1 动物 :清洁级 C 57 BL /6J 小 鼠 , 四周龄 , 雄 性
(北京大学医学实验动 中心提供) , 30 只 , 单笼喂养 ,
室温 18 ℃一 25 ℃ , 相对湿度 50 肠一 80 % , 自由摄
食饮水 , 普通饲料 , 造模用高脂高糖饲料 (美国 C H -
IR O N ) 提供 。
1
.
2 药品与试剂 :糖肾平胶囊 (主要由大黄 、水蛙 、
女贞子等组成 , 成都康弘制药有限公司生产 , 批号
031 106) 。 水饱和苯酚 (美国 Sig m a )。 8 一经基喳琳 、
1
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一二硫苏糖醇 (上海生工试剂厂) 。 e D N A S y n t h e -
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) 转录试剂盒 (美国 A m bion 公
司 ) 。 B i o t i n 一 1 4 一 C T P ( 美 国 life teehn olog y 公 司 )。
M o 3 基 因芯片 (美国 M erg en 公司) 。
1
.
3 仪器 :血糖仪与血糖试纸 (美 国惠好公 司 ) ,
M I C R O 一4 型杂交仪 (英 国 H Y B A ID 公司) , 4 1 8 T
型芯片扫描仪 (美 国 A F F Y M E T R IX 公 司) 。
2 方法
2. 1 1 型糖尿病动物模型的建立 :将 C 57 B L /6J 小
鼠随机分为 3 组 , 每组 10 只 , 正常对照组给予正常
饲料 , 模型组给予高脂高糖饲料 , 药物组给予高脂高
糖饲料及糖肾平 。 动物实验开始初采尾静脉血测定
血糖 , 各组用相应饲料喂养 12 周 , 禁食 12 h 后采尾
静脉血测定血糖 , 根据以往实验的结果 , 药物组加糖
肾平浸膏粉 0.8 9/kg (人 日服剂量的 20 倍 ) , 1 9 给
药 , 每 日 1 次 , 给药 15 d , 末次用药后 , 3 组动物按相
榨馨易算:瞥茹撬3一。, 女 , 副研究员 , 分子免。业 , 目前主要从事功能基因 以及药理生物信息学 的研究
·
1 1 5 8
· 中草药 C hinese T raditionaland H erbal Dr ugs 第 35 卷第 10 期 2004年 10月
同方法取血测血糖 。
2
.
2 靶组织采集 :将各组动物的肝脏和肾脏分离后
迅速投人到液氮中 , 后转移至 一80 ℃ 保存备用 。
2
.
3 探针制备 :各组靶组织等量混匀后用常规方法
获得总 R N A , 通过逆转录得到 。D N A , 进而体外转
录获得 C Y 3 标记的 R N A 探针 。
2
.
4 芯片杂交 :每种组织取等量探针与小 鼠基因芯
片杂交 , 3 2 ℃ 过夜后分别用 l x S S C 、 o . Z X S S C 、
0. I X S S C 清洗 3 次 , 每次 20 m in , 快速吹干后扫描 。
2
.
5 数据分析 :用 IM A G E N 软件处理数据 , 背景
值设为 10 0 , 表达值低于 10 0 为无效值 , 表达值减去
背景值为有效表达值或表达丰度 ;将 同一种基 因在
正常组的表达丰度与模型组的表达丰度的比值以及
正常组的表达丰度与治疗组的表达丰度的比值进行
丰度分析 。
3 结果
3. 1 造模与治疗前后血糖的变化:正常小鼠血糖平
均值在 7 m m ol /L 以下 , 血糖在 11. 1 m ol /L 以上表
示造模成功 , 各组血糖值结果见表 1 。
3. 2 肝脏 、 脏肾组织总 R N A 与探针 :肝脏与肾脏
组织得到 28 5 和 5 5 两个 明显条带的总 R N A (图
1一 A ) , 表明肝脏和 肾脏组织 R N A 未降解 , 质量 良
好 , 用于标记 的探针成弥漫状 , 主要集 中于 0.5 ~ 2
k b 之间 (图 l一B ) 。
3
.
3 杂交数据 :探针 与 M 03 芯片杂交后 , 得 到正
常 、模型和糖肾平治疗后的基因表达谱 。正常组与模
型组基因表达丰度差异在 2 倍以上者肝组织有 3 9
个 , 肾组织有 18 7 个 ;其中经药物治疗后能有效调
控或逆转即表达丰度与正常比值接近 1士0 .2 的为
药理作用的相关靶基因 , 在肝组织 中得到 36 个基
因 , 肾组织中得到 32 个基因 , 见表 2 和表 3。
表 1 箱肾平对箱尿病小限血精的影晌 ‘士s , 。 ~ 1 0)
T a bl e 1 E f f e e t o f T a此shenPing on bl ood glueos e
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组别 剂量/(g · k g 一 1 )
血糖水平/( m mo l · L 一 l )
造模前 造模后 给药后
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3 . 6 士1. 3
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圈 1 肝和 肾组织总 R N A (A ) 和探针 (B ) 电泳圈
Fig.1 E leetroPho 代515 Pa ttern of total R N A of liver aod 址d ne y (A ) an d P robe (B )
表 2 箱肾平对肝组织相关靶甚因的调控作用
T ab le 2 R eg ul at且on o f T a n g s h e n P iug o n r e la t iv e ta r沙t ge助 in liver tis sue
基因编号 基因名称 表达丰度 丰度分析
T)一198506正常组 (N ) 模型组 (M ) 治疗组 (T )
20 896.04 7 091.75 17 562.60
22 485.16 11 136.86 18 919.52
4 108.01 8 347.56 3 485.29
148.94 57.78 128.97
279.88 570.07 251.61
1 477.97 627.95 1 338.42
305.91 698.57 277.59545.45 1 200.94 496.27
812.99 385.61 747.88
3 337.11 1 449.01 3 092.50
1 296.77 2 594.94 1 203.75
277.34 124.67 262.03
364.90 179.01 344.81
646.52 165。 4 3 6 1 5 . 3 8
士 (N : M ) 士(N :
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中草药 C hinese T raditional and H erbal D rugs 第 35 卷第 10 期 2004 年 10 月 · 1 1 5 9 ·
续表 2
基因编号 基因名称 表达丰度 丰度分析
正常组 (N ) 士(N : M ) 士 (N : T )
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713.37
337.96
219.52
156.79
216.17
222.86
306.49
417.35
3 936.23
538.99
16 098.55
719.05
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.
9 7
表 3 糖肾平对肾组织相关靶基 因的调控作 用
T ab le 3 R egu la tio n o f T an gshen P in g on 代lative targ et g ene in k id n ey tissue
基因编号 基因名称 表达丰度 丰度分析正常组 (N ) 士(N : M ) 士(N : T )
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4 263 47
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1 1 0 7 0
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5 1 2 . 4 3
1 2 8 . 7 3
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1 6 5 8 . 0 9
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7 6 . 5 0
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8 1 . 2 3
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1 1 6 5 . 6 2
2 5 2 . 3 4
3 4 3 9 7
1 8 3 3 . 6 8
6 1 . 4 3
1 0 2 5 . 3 2
3 4 4 . 0 4
2 9 5 . 3 0
1 0 8 7 3 . 6 4
8 2 3 . 5 3
1 3 8 . 9 2
4 1 8 6 5
1 5 6 2 6
6 1 7 . 2 4
1 9 2 .
2 0 2 7 .
3 0 6 1
1 3 2 .
1 1 6 .
2 6 7
· 中草药 Chinese T raditional and H erbal D rugs 第 35 卷第 20期 2004 年 10 月
4 讨论
糖尿病的病因至今不明 , I 型糖尿病的发病与
遗传 、 饮食 、环境等综合因素有关 , 与内分泌 、免疫等
功能失调有重要关 系 。 C 5 7 B L /6 J 小 鼠是一种有向
心性肥胖和 l 型糖尿病基 因倾向的近交系动物 , 通
过长期 给予高脂 高糖饲料可诱导出 l 型糖尿病模
型 , 与人体的发病机制相似川 。 肝脏和肾脏是重要的
糖代谢器官 , 同时也具有内分泌免疫调节功能 , 如正
常肾组织表达某些细胞 因子 , 如白细胞介素一 6 ( I L -
6 )
、 转 化 生 长 因子书 (T G F 一 p ) 、 肿 瘤 坏 死 因子 一a
( T N F
一
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, 他们即分泌细胞因子 , 又是细胞因子的靶
器官 , 进人血液可引起全身性效应 , 几乎所有器官和
组织均可作为其生物作用的靶点 , 各细胞 因子相互
制约 、 相互调节 , 形成一个网络 , 共同参与生命活动 。
本实验所用芯片包括 9 30 个基 因位点 , 与正
常组 比较 , 模型组肝脏基因丰度值升高或下调 2 倍
以 上 的基 因有 33 9个 , 肾脏 组织基 因有 18 7个 , 可
见众多的基因参与 了 l 型糖尿病的发病 , 是一个多
途径 、综合因素导致的疾病 。 经过糖肾平治疗后有变
化 的基 因部分恢复到正常小鼠的水平 , 从表 2 和表
3 中发现有很多基因与代谢有关 , 其 中基本恢复到
正常表达水平的基因多与免疫反应的因子或细胞有
关 , 如肝组织 的 B 细胞受体相关蛋白 、 转运片段等 ,
肾组织的 G 蛋 白折叠受体 、 免疫球蛋 白重链等 , 说
明 l型糖尿病的发病与免疫系统的失调有很大的关
系 。 糖肾平可能通过对免疫系统的多途径调控从而
较好地控制血糖 , 另外 , 本实验对用药后基因谱的分
析还发现 , 经糖肾平有效逆转 的基因多为膜上受体 ,
尤其与能量代谢的受体有关 , 如钙离子结合蛋白 、 转
铁蛋白 、 激酶等 。 糖肾平作为中药复方制剂 , 成分十
分复杂 , 本实验从基 因水平观察到其作用的发挥是
多途径 , 多靶点 。同时与前期工作比较还观察到不同
的器官基 因表达谱的变化有 明显不同图 , 可 能与器
官的特异性及药物对不 同器官作用靶 向不同有关 ,
由于基因芯片数据量浩大 , 怎样对其进行归类整和 ,
分析基因变化之间的关联关系 , 找出关键作用点 , 仍
是 目前面临的巨大挑战 。也许经过大量的实验 , 积累
相当的数据后 , 借助计算机这一强大的现代工具 , 寻
找规律性的变化 , 可以帮助科研工作者发现疾病的
致病 基因 , 同时也 为筛选 新药创 造一条崭新 的途
径 [3 楼〕。
R e f e r e n e e s
:
[ 1 〕 S urw it R S , K u h n C M , C o e h r a n e e C . D i e t 一i n d u e e d t y p e l
d ia b e t e s i n C 5 7 B L / 6 J m i
e 。 〔J二. D ia加re、 , 1 9 8 8 , 3 7 : 1 1 6 3 .
[
2 〕 L 1 P H , w a n g X , Y a n Z Y , e t a l . T h e e f fe e t s o f T a n g s h e n -
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n g C
a p s u l
e s o n t h
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, S
ei (华 西药学杂志 ) , 2 0 0 3 , 1 8 ( 4 ) :
2 5 3
一 2 5 5
.
[
3 〕 S ehulte J H , Sc h r a rn m A , P r e s s e l T . e t a z . M i e r o a r r y 一 a n a l y -
5 1 5 : a n e w a p p r o a e h t o s t u d y t h e m o l e e u l a r m e e h a n is m s o f
t h e r
mo
一e h e
mo
t h e r a p y [ J 」、 K l i o P a d i a t r , 2 0 0 3 , 2 1 5 ( G ) :
2 9 8
一 3 0 2
.
[
4 〕 W ang Z , D u Q , w a n g F . M i e r o a r r a y a n a l y s i s o f g e n e e x -
p
r e s s
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六J、.产L、产‘.户人J护戈、禹声丫六、卜‘亡口
.
《中国药房 》杂志 200 5 年征订启事
《中国药房 》杂志是中华人民共和 国卫生部 主管 , 中华 医院管理学会和 中国药房杂志社主办 的国家级 、 国内外
公开发行的药学综合性刊物 。 主要设有改革与探索 、药业专论 、市场经纬 、实验研究 、药房管理 、医院制剂 、 药物经济
学 、 用药分析 、 临床药学 、 药理与临床 、药品检验 、 不 良反应监测 、 综述 讲座 、 药师之友 、 中药视窗 、 业界风彩 、药品
荟萃 、 O T C 在线 、 O T C 讲座等栏 目。
《中 国药房》杂志系 “ 全国中文核心期刊 ” 、 “ 中国科技论文统计源期 刊 ” 、“ 中国学术期刊综合评价数据库统计源
期刊 ” 、 “中 国期刊全文数据库收录期刊 ” 、 “《国际药学术摘 》(IP A )收录期刊 ” 、 “中国期刊方阵双效期刊 ” 。
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