全 文 ：中草药 第 卷第 期 年 月
葛根素对糖尿病大鼠肾脏蛋 白激酶 活性的作用
茅彩萍 , 顾振纶 , 曹 莉
苏州大学医学院 药理教研室 、 苏州中药研究所 , 江苏 苏州
摘 要 目的 研究葛根素 对糖尿病大鼠肾脏蛋 白激酶 活性 、 肾功能及肾脏结构的影响 。 方法
链脉佐菌素 诱导糖尿病大鼠模型 , 随机分为糖尿病组 、 、 、 治疗组 、 维生素
组 , 同时另设正常对照组 , 给药 周后 , 测定肾功能及 肾脏指数 , 法测定肾脏 活性 , 放免法测定尿蛋
白排泄率 , 并对肾组织进行光镜及电镜观察 。 结果 糖尿病大鼠尿 白蛋白排泄率 、 肾脏指数 肾脏质量 体重 、 肾小
球细胞膜 活性明显升高 , 给予 治疗 周后 , 治疗组糖尿病大鼠尿白蛋白排泄率较糖尿病组显著降低 , 肾
脏肥大也有明显改善 , 肾小球细胞膜 活性显著下降 , 光镜及电镜下肾脏病理改变较糖尿病组有较大改善
。 结
论 可 以纠正糖尿病大鼠早期肾脏高滤过 、 高灌注 , 并对糖尿病大 鼠肾脏病变有一定的保护作用 , 其部分机制
可能是通过下调肾脏 活性而实现的 。
关键词 葛根素 蛋 白激酶 糖尿病肾病
中图分类号 文献标识码 文章编号 一 一 一
一 , 一 ,
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一 ,
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一
葛根素 , 是从野葛 八
或甘葛藤 ,
的根中提取的主要有效成分之一 , 现代药理学研究
表 明 具有活血化癖 、 改善微循环 、 抑制醛糖还
原酶活性等作用 , 临床用于治疗心脑血管疾病 , 并在
糖尿病肾病 , 的治疗 中
也已取得 了一定的疗效卜“〕, 但其作用机制还不十分
清楚 。 本实验观察 对糖尿病大鼠肾脏结构和功
能及肾组织 中 活性 的变化 , 并探讨 防治
的作用机制 。
材料
药物及试剂 葛根素 , 棕黄色粉末 , 纯度
, 由湖南金农生物资源股份有限公司提供 维生
素 德 国 公司 , 临用时以植物油配
成 的溶 液 链 脉佐 菌 素 ,
公 司 , 临用 前用 拘椽酸缓 冲液 配成
的 溶液 血糖测定试剂盒 卫生部上海生
物制品研究所 尿微量 白蛋白测定试剂盒 上海名典
收稿 日期 一 一
甚金项 目 江苏省中医药管理局科研基金资助项 目 一 。
作者简介 茅彩萍 一 , 女 , 江苏张家港人 , 博士 , 副教授 , 主要从事中药药理学研究与新药开发 , 近年发表科研论文 余篇 。
一
· · 中草药 第 卷第 期 年 月
生物工程有 限公 司 活性测定试剂盒 日本 医
学生物实验公司
。
仪 器 一 型 冷 冻 离 心 机 , 公 司
型分光光度计 , 上海第三分析仪器厂 一
型放射免疫 一计数器 , 中国科学 院原子核研究所
日环仪器厂 石蜡切片机 全 自动生化分
析仪 显微镜 、 一 型电子
显微镜 日立公司
。
动物 清洁级雄性 大 鼠 , 由苏州大学 医学
院实 验 动 物 中心 提 供 , 实验 动物 使 用 许 可 证 号
苏 一 。 , 实验 动物 生产许 可证 号
苏 一 。
方法
糖尿病大鼠模型的建立与分组 采用健康雄性
大鼠 , 体重 一 , 禁食 后按文献〔
, ‘ 〕
方法并略作改进 , 一次性 , 空 白对
照组仅 等量的构椽酸缓冲液 , 后眼底静脉丛
取血 , 葡萄糖氧化酶法测定 血糖 , 若血糖值
, 尿糖为十 一 十 者 , 确定为糖尿
病 大 鼠
。
将糖尿病大 鼠按 血糖值范围随机分为
组 即 大 、 中 、 小 剂 量 组 、 、
, 组 , 模型组 组 , 另
取 只大鼠作为正常对照组 。 在注射 后 ,
各组大鼠每 日 相应药物 次 , 连续给药 周 。
指标测定 大 鼠于处死前一天采用代谢笼收集
尿 液 , 离 心 , 一 ℃ 冰 箱保存 待 查 尿 蛋 白
、 尿 肌 醉 。 各组 大 鼠禁食 后 以
乌拉坦 麻醉 , 腹主动脉取血 , 分离血清测定
血糖 、 血肌醉 。 , 并计算内生肌醉清除率 ,
由于 受到体表面积 的影 响 , 用 体重加
以 校正 。 取双 肾 , 去掉包膜称质量 , 右 肾部分置 于
。 中性福尔马林液浸泡 固定 , 待用光镜检查 , 另
将小块 肾皮质剪成 大小 , 用
·
戊 二醛 固定 , 待用 电镜检 查 。 右 肾取皮 质
大 小 置 于 液 氮 中 , 冻 透 后
一 ℃ 保存待测 活性 。
提取及测定 所有步骤均 在 ℃ 下进
行 , 肾组 织 切 碎 置 于 倍 体 积 的缓 冲液 中
、 、
、 , 组织匀浆
器匀浆 , ℃ 、 离心 , 上清液则 为细
胞 浆
。 其 沉 淀 继 续 加 含
一 的 缓冲液 , 抽提 , 每 振荡
次 , ℃ 、 只 离心 , 上清液则为细胞膜
。
酶联免疫法测定 活性 。
统计方法 所有数据 均用 软件进行统
计 。 两 组 间 比 较 用 方 差 分 析 一
中的最小显著差法 。
结果
大 鼠体重 、 摄食量及饮水量 的变化 分别于给
药前及给药后 周 , 称体重 、 肾质量 , 并计算肾脏
指数 肾质量 体重 , 观察体征变化 。 结果显示 连
续给药 周后 , 正常对照组大 鼠外观状态 良好 , 活
动 自如 , 体重增加
。
组大鼠 周时已出现典型
的糖尿病 “ 三多一少 ”症状 摄食量 、饮水量和尿量增
加 , 而体重减轻 , 毛松无光泽 , 蜷卧拱背 , 而且肾脏肥
大指数明显升高 。 和 组均有类似表现 , 但
程度较 组轻 。 周后各治疗组体重较正常对照
组明显降低 , “ 三多一少 ”症状较治疗前有所改善 , 肾
脏指数明显降低 。 说明 可使 症状得到一定
的控制 , 见表 。
表 对 致箱尿病大限体孟及
肾脏指数的影响 士
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动物 剂 量 体重 肾脏指数 叱 · 一 ‘
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大 鼠空腹血糖的变化 各组动物于给药前及给
药后 周 , 禁食 巧 后 , 分别 以眼底静脉丛和腹主
动脉取血 , 用葡萄糖氧化酶法测定血糖 。 结果
治疗 后 血 糖较 治 疗 前 及 组 显 著 降低 尸
, 但仍高于正常组 。 说明 大 、 中剂量组具
有明显的降低血糖作用 , 但尚不能使其从异常水平
恢复到正常水平 , 见表 。
大 鼠尿微量 白蛋 白 和 的变化
给药后 周时 , 在大鼠处死前 用大鼠代谢笼收
集各大 鼠 尿液 , 测定其尿量 , 并 留取 尿
液 , 用放免法按试剂盒步骤测定 的浓度 。 先
测其吸光度 , 再根据标准曲线求得直线 回归方程 , 得
其 尿 微 量 白蛋 白浓 度 , 再 乘 以 总 尿 量 , 得
中草药 第 卷第 期 年 月 · ·
总排 出量 。 实验结果显示 组大 鼠 周
时 的排 出量和 明显增加 , 与正常组 比较
差异显著 尸 , 而不 同剂量 均能显著减
少 的排出量和降低 , 与 组 比较 , 差异
显著 尸 , 见表 。
表 对 致精尿病大鼠空腹血箱的影响 ‘ 士
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对 致箱尿病大 鼠肾脏
活性的影响 士
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二 ▲ ▲‘
大 鼠肾小球 活性 比较 周时 大
鼠肾小球 活性增高 , 而细胞浆 活性相对
降低 , 即 由细胞浆向细胞膜转移 , 与 激
活密切相关
。
而 治疗后细胞膜 活性 明显
低于 组 尸 , 胞浆 明显升高 , 但各
组大鼠 总活性差异无显著性 , 见表 。
肾脏形态学观察结果
肾脏光镜检查结果 大鼠肾脏经 染色和
糖原染色后 , 观察标准按邹万忠描述 肾小
球硬化症方法进行判断阁 。 染色结果 模型
组大鼠多数 肾小球体积明显缩小 , 弥漫性系膜增生
类似 亚 期纤维化 , 肾小球基底膜 由正
常卷样状挤压成髓纹并增厚 , 球体毛细血管闭塞 , 而
球囊相对扩大 。 肾小管有明显空泡透明变性 变
性 , 并 有 炎 性 细胞 浸 润 、 蛋 白管 型 、 药 物 结 晶等 。
治疗后 肾小 球 系膜弥漫 或结 节状增生 明显 减
与正常组比较 ‘ ’ 与 组比较 ▲ “ 尸
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少 , 半数 以上大鼠球体毛细血管瘤样扩张恢复原卷
棒状 , 球囊腔恢复原大小 , 肾小球体积半数扩大到原
状 , 肾小管 透明变大部分消失 , 肾间质小动脉 、
细动脉 由痉挛而扩张 , 内皮细胞 由肿胀 的立方状恢
复到扁平状 , 增厚有半数减轻 。 染色结
果 模型组大 鼠肾小球内系膜基质增生呈弥漫
或 结 节状 阳性糖原 沉积 , 为深红 色 肾小 管
透 明变 , 显示在 肾小球旁器周 围的近 曲小管处
呈深红色斑块或颗粒状糖原沉积 。 治疗组大 鼠
肾小球 内毛细血管呈卷棒状扩 张 , 红染 , 系膜
基质沉积较少 , 色淡 肾小管内有少量糖原沉积 。
肾脏透射电镜观察结果 模型组大 鼠基
底膜厚度较正常组 明显增厚 , 部分系膜 区细胞及基
质均有增加 , 足细胞明显肿胀 , 大多数足细胞足突融
合 。 治疗组大鼠肾小球血管拌明显扩张 , 管腔内
有成簇的红细胞聚集 基底膜厚薄均匀 , 足细胞排列
整齐 , 足突融合少见 , 基质均匀 , 部分系膜 区有少量
基底膜样物质沉积 , 系膜细胞形态正常 。
讨论
糖尿病肾病 , 是糖
尿病 , 最常见且严重的微血
管并发症 , 也是糖尿病患者的主要死亡原因之一 。 其
早期主要病理表现是肾脏肥大 、 毛细血管基底膜增
厚 。 近年来 , 细胞内信号传导系统作为连接细胞外刺
激与细胞功能调节的纽带越来越受到国内外学者的
关注 , 该系统是细胞外刺激调节细胞生理功能及细
胞增殖 、分化和细胞 内有关物质合成的必经途径 , 而
是细胞 内诸多信号传导 系统相互影 响
的 中心 环 节 , 是高糖或 葡萄糖转运 蛋 白一
表达增高时系膜信号传导通路中的重要
介质 , 几乎所有 的系膜细胞功能改变均与 激
活有关 。 高糖下 的激活来源于糖酵解过程 中
中草药 第 卷第 期 年 月
间产物二酞基甘油 , 的增加 ,
静息状态下 , 几乎以无活性形式存在于细胞浆
中 , 当有外界刺激时 , 移位到细胞膜而被激活川 , 在
病理变化 中起重要作用 。 本实验结果显示
可延缓 进程 , 对 的防治具有积极作用 , 产
生该作用机制可能与其降低血糖 、 改善肾功能 , 使肾
小球系膜增生减少和扩张肾小球 内毛细血管 , 减轻
内皮细胞的损伤 , 使 增厚减轻等有关
。
临床研究证实 患者常伴有持续微量 白蛋
白尿 , , 不仅提示
早期肾脏受损 , 而且也是增殖性视 网膜病变与
大血管病变 的一个新 的独立 的危险标记 , 异
常可 以表明广泛的血管功能失调 , 所以 可作
为 良好的预报指标 , 是诊断 的可靠标志 ,
并能预示 的发展 , 另外也是 患者心血管病
的独立危险因素阁 。 本实验研究结果表明 模型
组大 鼠 周 、 周时 的排 出量明显增加 , 而
不 同剂量 均 能显著降低 的排 出量 , 提
示 至少能部分阻断高血糖引起 的累积效应 , 一
方面改善肾小球滤过膜 的通透性 , 另一方面也可通
过改善胰岛素抵抗 , ” 减少
, 对糖尿病血管并发症具有一定 的保护作用 。
近年来研究发现 信号系统通过调节细胞
的通透性 , 细胞外基质 、 细胞生长 , 血管收缩等一系
列生化和生理改变在 的早期发生发展 中起重
要作用 。 糖尿病时 活性升高 , 高糖状态下 , 葡
萄糖通过代谢形成二醋酞甘油 后 , 逐步酞
化即从头合成途径生成高浓度 , 再激活
从胞浆 中无活性状态转变为细胞膜 中活性状
态 。 本实验结果显示 了这种膜转移现象 。 介导
早期病变 的机制包括 以 下几个方面
通过诱导
、
合成增加 , 引起肾小球人球小
动脉阻力下降 , 增加 肾小球滤过压 “〕, 造成高灌注 、
高滤过 、 肾脏肥大 。 既可直接促进 成
分蛋 白基因表达 , 又可通过促进 一日基因表达而
增加 合成巨“ 〕。 改变磷酸化肌动蛋 白
的结构和功能 , 降低 细胞与细胞 、 细胞与基质 间连
接 , 增大内皮细胞间隙 , 从而增加其通透性 , 造成尿
蛋 白排泄升高 。 降低 一 一 酶活性 。 国
外学者研究发现 , 应用 抑制剂可 明显改善肾
血 流 量 、 肾小 球 滤 过 率 及 内皮 细 胞 通 透 性 , 抑 制
增加 , 提高 一 一 酶活性 , 从 而减轻
的早期病理变化 。 因此抑制 活性 为治疗
提供了新途径 。 是从 中药葛根根 中提取的
有效成分 , 临床用于治疗心脑血管疾病和 , 不 良
反应较少 , 药源广泛 。 本实验结果表明 糖尿病大饭
尿蛋 白排泄率 、 、 肾脏肥大指数及形态学指标均
高于正常对照组 糖尿病大 鼠肾脏组织细胞膜
明显 升高 , 而细胞浆 活性 变化 不 明显 , 出现
由胞 浆 向胞 膜 的转 移 过 程 , 与 文 献 报 道 一
致 〕, 且 活性升高与肾脏肥大指数 、 尿蛋 白排
泄率呈相关关系 , 与肾功能下 降及组织学改变具有
时间一致性 , 而糖尿病大 鼠经 治疗后各项指标
均有明显改善 , 活性下降 , 与 治疗效果相
近 〕。 提示 有早期抑制肾小球肥大 、基底膜增
厚 、 系膜 区扩大的作用 , 对肾脏有一定 的保护作用 。
可通过下调 来改善高血糖状态下引起 的
肾脏形 态和 功能损伤 , 延缓 肾脏肥 大进程 , 对
产生一定的保护作用 。
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