全 文 ：同 , DHAP明显增加红细胞的 ADI和 Dmax ,表明
DHAP能增加红细胞变形性 ,这有利于红细胞通过
毛细血管 ,减少细胞间的叠连 ,降低血液粘度 ,疏通
微循环 ,从而活血化瘀。这一现象与以往临床观察发
现 DHAP能改善 IUGR患者血液流变学的结果相
吻合 [1 ]。 总之 ,本结果表明 , DHAP改善微循环的作
用 ,不仅与其增强 V EC刚性和降低其弹性 ,加强其
屏障作用有关 ,同时也与 DHAP增加红细胞变形性
有关。本实验将生物力学概念引入血液流变学相关研
究 ,从细胞变形性、粘弹性变化的角度分析了活血化
瘀中药的可能作用机制 ,具有重要的理论和实用价
值 ,也是血液流变学活性药物筛选的一种实用方法。
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槲皮素对重组人蛋白激酶 CK2全酶的抑制作用及其动力学分析
刘新光 ,梁念慈
(广东医学院生物化学与分子生物学研究所 ,广东 湛江　 524023)
摘　要: 目的　观察槲皮素对重组人蛋白激酶 CK2全酶的直接作用及其酶动力学机制。 方法　利用基因工程克
隆、表达和纯化获得重组人蛋白激酶 CK2α和 β 亚基 ,在体外等摩尔数混合构成有最大生物活性的重组 CK2全
酶 ,在不同条件下测定 CK2的活性。 CK2活性通过测定转移到 CK2底物上的 [γ-32 P ] AT P的 [32 P ]放射活度来
检测。 结果　重组人蛋白激酶 CK2是一种 Ca2+ 、 cAMP和 cGMP等第二信使非依赖性蛋白激酶 ,与天然 CK2的
性质一致。槲皮素对重组人 CK2全酶具有很强的抑制作用 , IC50为 522 nmol /L,抑制作用大于 CK2已知抑制剂
DRB和 A3。 槲皮素对重组人蛋白激酶 CK2的动力学研究表明:它与 ATP和酪蛋白分别呈竞争性和非竞争性抑
制作用。 结论　槲皮素是 CK2有效抑制剂 ,该抑制作用可能是槲皮素抗肿瘤作用又一分子机制 ,为今后筛选更有
效的 CK2抑制剂提供了一种较为简便的筛选方法。
关键词: 蛋白激酶 CK2;重组蛋白 ;全酶 ;槲皮素 ; IC50;酶动力学
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 07 0626 04
Inhibitory effect of quercetin on recombinant human protein kinase CK2
holoenzyme and its kinetics analysis
LIU Xin-guang , LIAN G Nian-ci
( Institute of Bio chemistry & Mo lecula r Bio lo gy , Guangdong M edical Colleg e, Zhanjiang 524023, China )
Abstract: Object　 To study the direct ef fect of quercetin on recombinant human protein kinase CK2
holo enzyme and its kinetics. Methods　 Recombinant human pro tein kinase CK2α and β subunits w ere
cloned and expressed by gene engineering , and w ere purified. The tw o subunits w ere mixed a t the same
molar ratio , thus reconsti tuting CK2 ho loenzyme, w hich display ed the maximum bioactivi ty. The CK2 ac-
tivi ty was assayed by detecting incorporation of 32 P of [γ-32 P] A TP into the subst rate in the va rious condi-
·626· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 7期
收稿日期: 2001-10-08
基金项目:广东省自然科学基金 ( 011766) ;广东医学院标志性成果扶持项目
作者简介:刘新光 ( 1964-) ,男 ,江西九江人 ,博士 ,副教授 ,硕士生导师 ,现任广东医学院医学检验系副主任 ,生化教研室主任。 1999年毕
业于中山医科大学生物化学与分子生物学专业 ,获医学博士学位。 主要研究方向是肿瘤生化 ,蛋白激酶的分子生物学与生化
药理学 ,目前负责省、厅、市和学院级科研项目 7项 ,以第一作者发表科研论文 26篇 ,获湛江市科技进步一等奖 1项 (第一完
成人 )。 Tel: ( 0759) 2388582,个人主页 h t tp: / /hom e. gdmc. edu. cn / jyx /jian /person /lx g. htm E-mail: xig liu@ gdmc. edu. cn
tions. Results　 The recombinant human pro tein kinase CK2 w as the second messenger ( Ca2+ , cAM P and
cGMP) independent pro tein kinase, the characteriza tion and function o f the reconsti tuted holoenzyme w ere
consistent wi th tho se of na tiv e CK2. It w as found that quercetin st rong ly inhibi ted the holoenzyme activi ty
o f recombinant human pro tein kinase CK2 w ith an IC50 of 522 nmol /L, w hich w as much more effectiv e
than DRB and A3, known as CK2 special inhibi to rs. Kinetic studies o f quercetin on recombinant human
pro tein kinase CK2 show ed: the inhibi tion w as competitiv e wi th ATP and noncompeti tiv e wi th casein.
Conclusion　 Quercetin is a potent inhibi to r of recombinant human pro tein kinase CK2. The inhibi tion may
be another mo lecular mechanism of anti tumo r ef fect of quercetin. This study provides a simple and rapid
screening method for the development of mo re effectiv e inhibi to rs o f recombinant human protein kinase
CK2.
Key words: pro tein kinase CK2; recombinant protein; holo enzyme; quercetin; IC50; enzyme kinetics
　　蛋白激酶 CK2曾称为酪蛋白激酶 2,是一种真
核细胞普遍存在的信使非依赖性丝 /苏氨酸蛋白激
酶 ,由两个催化亚基 (α或α′)和两个调节亚基 (β )
组成的不均一四聚体 (α2β2 ,α′2β2或αα′β2 ) [1～ 3 ]。蛋白
激酶 CK2的重要特点之一就是可磷酸化的底物有
200余种 ,且底物不断增加 ,这些底物在细胞的许多
方面起重要作用 ,但真正作用至今仍不清楚 [1～ 3 ]。此
外 ,与正常和静止细胞相比 ,转化和正在增殖的细胞
蛋白激酶 CK2活性升高 [1～ 3 ]。有研究表明 [4, 5 ]: CK2
的 α或 α′基因可能是原癌基因。 最近有学者指
出 [1, 6 ]: CK2可能是肿瘤和艾滋病治疗的分子靶点
之一 ,其特异性抑制剂具有潜在的临床治疗价值。
槲皮素 ( 3, 3′, 4′, 5, 7-五羟黄酮 , quercetin,
Que )是一种广泛存在于植物中的黄酮类化合物 ,
对人体健康具有许多有益作用 ,如祛痰、止咳、平喘、
心血管保护、抗血小板聚集、抗癌、抗溃疡、抗变态反
应、抗病毒、抗炎作用以及白内障预防等广泛的药理
作用 [7～ 9 ]。 还可抑制乳腺癌、白血病、结肠癌、卵巢
癌、鳞癌、子宫内膜癌、胃癌和非小细胞肺癌等细胞
的生长 ,一些动物和人的初步资料表明也可抑制肿
瘤生长 ,使之已成为一种有应用潜力的抗癌化合
物 [7, 9 ]。由于 CK2的活性与增殖相关 ,抑制细胞增殖
可能会影响 CK2活性。为了探讨槲皮素对 CK2的
作用机制 ,本文在已克隆表达人 CK2α和 β 亚基的
基础上 [10～ 13 ] ,研究了槲皮素对纯化的重组人 CK2
全酶活性的直接作用及其动力学。
1　材料和方法
1. 1　材料: 槲皮素 ,肝素 ,精胺 , AT P为 Sigma公
司产品。 5, 6-二氯 -1-β -呋喃糖苯并咪唑 ( DRB)和
N -( 2-氨乙基 ) -5-氯萘 -1-硫胺 ( A3) 为 Calbio chem
公司产品 , P81磷酸纤维素滤纸为 Wha tman产品。
[γ-3 2 P] ATP为北京亚辉生物医学工程公司生产 ,
其余为国产分析纯产品。
1. 2　方法
1. 2. 1　人 CK2α和 β亚基 cDN A重组质粒 pTCK A
和 pTCKB的克隆与测序:方法见作者以前报道 [10, 11 ]。
1. 2. 2　重组人 CK2α和 β亚基的原核表达、纯化与
鉴定:方法见文献 [ 12, 13]。
1. 2. 3　蛋白定量:按常规的考马斯亮蓝 R-250染
色法 ,以牛血清白蛋白作为标准。
1. 2. 4　蛋白激酶 CK2的活性测定: 方法见文
献 [11, 12 ]。酶反应总体积为 35μL,反应混合液中含
50 mmol /L Tris-HCl, pH 7. 2, 150 mmol /L KCl,
10 mmo l /L M gCl2 , 50μmol /L AT P, [γ-32 P ] A TP
1. 85× 104 Bq (比活 1. 85× 1017 Bq /mo l) ,去磷酸化
酪蛋白 2 g /L。反应温度为 30℃。加 15μL重组
CK2全酶启动酶反应 ,反应 10 min后取 30μL点
至直径 2 cm的 P81磷酸纤维素滤纸上终止反应 ,
阴干 ,用 85 mmol /L磷酸洗涤数次 ,最后用丙酮洗
涤 1次 , 80℃ 烤干后 ,加闪烁液于液闪仪计数 ,每
组同时做 3个平行管。每分钟催化 1 pmol [γ-32 P]
ATP上的 32 P转移到酪蛋白上所需的酶量为 1个
酶单位。
1. 2. 5　槲皮素对重组人 CK2全酶的直接作用与
IC50的计算: IC50的计算根据半数效量概率单位法 [14 ]
进行。以浓度的对数为横坐标 ,相应浓度抑制率的概
率单位为纵坐标 ,求出直线回归方程 ,并根据方程计
算 IC50值 ( 50% 抑制时的概率单位为 5)。
1. 2. 6　酶的动力学分析: 根据 IC50结果 ,选择 3种
不同浓度槲皮素 ( 0, 250, 1 000 nmol /L )进行实验
分组。在固定酪蛋白浓度为 2 g /L , ATP浓度从
12. 5～ 100μmol /L情况下 ,测定 CK2的活性 (相当
于反应速度 ) ;或在固定 A TP的浓度为 12. 5μmol /L ,
改变酪蛋白浓度 ( 1～ 8 g /L ) 条件下 ,测定 CK2
活性 ,每个样品同时做 3个平行管 ,采用 Linew eaver-
Burk作图法求出表现 Km和表观 Vmax酶动力学参
·627·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 7期
数 ,以此判断槲皮素对 CK2抑制作用类型。
1. 2. 7　统计学处理: 差异的显著性检验采用配对 t
检验。
2　结果
2. 1　重组人蛋白激酶 CK2全酶的构成: 蛋白激酶
CK2在细胞中是由两个催化亚基 (α或 α′)和两个
调节亚基 (β )组成的四聚体。为了观察原核表达的人
CK2α和 β亚基能否构成有活性的全酶 ,作者曾将
这两种蛋白按不同的摩尔分子比在体外直接简单地
混合 ,结果显示 α和 β亚基等摩尔混合可构成有完
全生物活性的全酶 [12, 13 ]。
2. 2　重组人 CK2全酶的性质鉴定: 结果见表 1,从
中可以看出 ,混合后的 CK2全酶具有与天然 CK2
一致的性质 ,如可以部分去磷酸化的酪蛋白作底物 ,
而用碱性蛋白组蛋白 Ⅲ S和酪氨酸蛋白激酶
( T PK)的底物 Poly ( Glu-Ty r= 4∶ 1) 作底物时 ,
CK2的活性则很低。 重组人 CK2全酶的活性还受
到肝素和 CK2特异性抑制剂 DRB的抑制 ,精胺则
有激活作用。而一些第二信使分子如 cAMP, cGMP
和 Ca2+则对 CK2的活性基本没有影响。
表 1　重组人 CK2全酶的性质
组　别 CK2活性
( mU, x± s) 　 (% )
对照组 1 264. 9± 95. 7 100
+ 组蛋白 ( 0. 5 g /L)- 酪蛋白 52. 4± 9. 5 　 4. 1* *
+ po ly ( Glu-T yr= 4∶1) 0. 4 g / L-酪蛋白 124. 7± 24. 2 　 9. 9* *
+ 肝素 ( 8 mg /L) 507. 0± 44. 7 40. 1* *
+ DRB ( 40μm ol /L) 325. 5± 71. 3 25. 7* *
+ 精胺 ( 2. 5 mmol /L) 1 840. 4± 107. 1 145. 5* *
+ Ca2+ ( 5 mmol /L) 1 248. 5± 63. 4 98. 7
+ cAM P ( 10μmol /L) 1 365. 7± 112. 0 108. 0
+ cGM P ( 10μmol /L) 1 267. 8± 108. 3 100. 2
　　注:使用等摩尔数 ( 14 pmol ) 的 CK2α和 β 亚基构成 CK2全
酶 ,其活性测定方法见材料与方法。 在对照组中酪蛋白作为 CK2的
底物 ,每个数值代表 3次实验的平均值。
与对照组相比: * * P < 0. 01
2. 3　槲皮素对重组人 CK2全酶的直接作用:向反
应体系中加入不同浓度槲皮素 ,结果见表 2。槲皮素
对重组人 CK2全酶有很强的抑制作用 ,且随着浓度
不断增加 ,对 CK2全酶活性抑制率逐渐升高 ,呈现
浓度依赖性关系 ,以浓度对数为横坐标 ,相应浓度抑
制率的概率单位为纵坐标 ,求出直线回归方程为:
Y= 1. 858 1 X - 0. 049 7, r= 0. 956 1,因此其 IC50
为 522 nmo l /L ( log nmol /L为 2. 718)。
2. 4　槲皮素抑制重组人 CK2全酶的动力学分析
表 2　槲皮素对重组人 CK2全酶的影响
浓　度
(nmol /L) log值
CK2活性
( cpm, x± s )
抑制率
(% ) 概率单位
0 15 156± 1 076
125 2. 097 14 381± 651 5. 1 3. 355 1
250 2. 398 9 141± 817 39. 7* * 4. 747 7
500 2. 690 6 026± 331 60. 2* * 5. 253 3
1 000 3. 000 4 037± 228 73. 4* * 5. 612 8
2 000 3. 301 2 101± 131 86. 1* * 6. 080 3
4 000 3. 602 1 231± 214 91. 9* * 6. 405 1
　　与 0 nmol / L组相比: * * P < 0. 01
2. 4. 1　不同 ATP浓度条件下槲皮素对 CK2活性
的影响: 在固定酪蛋白浓度 ,改变 ATP浓度条件下 ,
进行了槲皮素对 CK2全酶的动力学分析 ,结果见图
1。 槲皮素与 AT P呈现竞争性抑制重组人 CK2活
性 ,以 1 / [S ]和 1 /V作图显示酶的动力学结果。
　　固定酪蛋白浓度为 2 g /L,按图中所示改变 ATP浓度
条件下测定不同浓度槲皮素对重组人 CK2全酶的影响 ,每
个值代表 3次实验的平均值。
槲皮素 0μmol /L(● ) ; 250 nmol /L(× ) ; 1 000 nmol /L(■ )
图 1　 Lineweaver-Burk作图法分析槲皮素对
重组人 CK2全酶的抑制作用的动力学
2. 4. 2　不同酪蛋白浓度情况下槲皮素对 CK2活性
的影响: 在固定 AT P的浓度 ,改变酪蛋白浓度情况
下 ,槲皮素的酶动力学实验结果见图 2。槲皮素与酪
蛋白呈非竞争性抑制重组人蛋白激酶 CK2。
　　固定 AT P浓度为 12. 5μmol /L,按图中所示改变酪蛋
白浓度条件下不同浓度槲皮素对重组人 CK2全酶的影响 ,
每个值代表 3次实验的平均值。
槲皮素 0μmol /L(● ) ; 250 nmol /L(× ) ; 1 000 nmol /L(■ )
图 2　 Lineweaver-Burk作图法分析槲皮素对
重组人 CK2全酶的抑制作用的动力学
·628· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 7期
2. 5　 DRB与 A3对重组人 CK2全酶的抑制作用:
DRB和 A3是已知对 CK2有抑制作用的两种化合
物 [1, 2 ] ,结果 (表 3和 4)表明:它们对重组人 CK2都
有较强的抑制作用 ,其 IC50分别为 10. 4μmol /l和
25. 5μmol /L ,说明槲皮素较 DRB和 A3对重组人
CK2全酶的抑制作用更强。
表 3　 DRB对重组人 CK2全酶的抑制作用
浓　度
(μmol /L) log值
CK2活性
( cpm, x±s )
抑制率
(% ) 概率单位
0 20 542± 1 272
5 0. 699 13 109± 550 36. 2* * 4. 641 5
10 1. 000 9 971±　 94 51. 5* * 5. 025 1
20 1. 301 7 631± 741 62. 9* * 5. 331 9
40 1. 602 6 104± 126 70. 3* * 5. 524 4
80 1. 903 3 357± 641 83. 7* * 5. 994 5
　　 IC50= 10. 4μmol /L; 与 0μm ol /L组相比: * * P < 0. 01
表 4　 A3对重组人 CK2全酶的抑制影响
浓　度
(μmol /L) log值
CK2活性
( cpm, x±s )
抑制率
(% ) 概率单位
0 33 624± 2 784
10 1. 000 23 996± 1 716 28. 6* * 4. 446 6
20 1. 301 18 415± 511 45. 2* * 4. 874 3
40 1. 602 12 358± 1 062 63. 2* * 5. 331 9
80 1. 903 9 037± 1 441 73. 1* * 5. 612 8
160 2. 204 5 855± 172 82. 6* * 5. 954 2
　　 IC50= 25. 5μmol /L; 与 0μm ol /L组相比: * * P < 0. 01
3　讨论
蛋白激酶 CK2在肿瘤细胞的生长、增殖和信号
传导过程中起重要作用 [1～ 3 ]。 CK2与 HIV-1的关系
非常密切 ,在 HIV-1的复制、转录及裂解细胞等功
能的调控中起着重要作用 , CK2抑制剂具有抗
HIV-1活性 [6 ]。因此有观点认为蛋白激酶 CK2是肿
瘤和艾滋病治疗的靶分子之一 , CK2的抑制剂具有
潜在的抗肿瘤和抗 HIV -1的临床应用价值 [1, 6 ]。
研究表明槲皮素具有抗氧化作用、抗血小板聚
集和抗肿瘤作用 [7～ 9 ] ,槲皮素抗肿瘤作用的主要分
子机制 [7 ]是下调突变的 P53蛋白、阻滞肿瘤细胞于
G1期、抑制 TPK、与 Ⅱ 型雌激素受体结合、抑制热
休克蛋白的产生、抑制 Ras蛋白表达等。通过槲皮素
对 HL-60细胞的影响 [15 ]的研究 ,发现其可抑制该白
血病细胞的生长 ,抑制其 TPK、 PKC以及肌醇磷脂
的转换作用 ,说明它可影响信号传递的多个环节。
我们在获得大量有生物学活性的重组人 CK2
的基础上 [12, 13 ] ,首先进行了 CK2性质鉴定和构成
重组全酶 (表 1) ,又首次观察了槲皮素对重组人
CK2全酶的直接作用。结果发现槲皮素对重组 CK2
全酶具有很强的抑制作用 (表 2) ,其 IC50仅为 522
nmol /L。 进一步的酶动力学结果揭示了槲皮素对
CK2的作用机制 ,与 ATP呈现竞争性抑制 (图 1) ,
说明槲皮素与 ATP对重组人 CK2具有竞争性抑
制作用 ,与酪蛋白则呈非竞争性抑制 CK2活性 (图
2)。槲皮素与 ATP呈竞争性抑制 CK2,提示这种抑
制作用可能是槲皮素抑制肿瘤增殖的另一分子
机制。
DRB与 A3作为已知的蛋白激酶 CK2的抑制
剂 [1, 2 ] ,尤其是 DRB是 CK2的特异性抑制剂 ,它还
可抑制依赖 CK2的 RNA聚合酶 Ⅱ。 A3除了可抑
制 CK2外 ,还可抑制 CKI,肌浆球蛋白轻链激酶
( M LCK) , PKA, PKG, PKC等蛋白激酶的活性 ,本
实验证实了纯化的重组人 CK2全酶可受到已知抑
制剂的抑制。有意义的是 ,本实验结果还表明:槲皮
素抑制 CK2的作用 ( IC50仅为 522 nmol /L ) 较
DRB和 A3更强 ,说明槲皮素可能是 CK2有效的
抑制剂。 因此本实验为进一步研究槲皮素的作用机
制以及应用开发槲皮素提供了重要的实验依据。
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