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证试验结果表明 ,科学可信 ,重现性好。实验结果表
明 ,以粒径 600～ 400μm的微粒为母丸 ,采用粉末
层积式离心造粒法 ,在优化条件下可制得表面较为
光滑、圆整度较高的麝香保心微丸 ,期望粒径
1 000～ 700μm的微丸收率可达 90. 4%。
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甲基茉莉酮酸对悬浮培养南方红豆杉细胞代谢的影响
王艳东 ,路　明 ,元英进
(天津大学化工学院 制药工程系 ,天津　 300072)
摘　要:目的　探讨甲基茉莉酮酸作用下悬浮培养南方红豆杉细胞的系列生理生化反应。 方法　 TTC( 2, 3, 5-
triph eny ltetra zo lium chloride)和蛋白含量测定方法以及酶活分析技术。结果　甲基茉莉酮酸不仅强烈抑制细胞活
力 ,使细胞初生代谢受到显著抑制 ,并且还诱导 PAL (苯丙氨酸解氨酶 )活性增强 ,在一定程度上抑制了 PPO (多酚
氧化酶 )的活性 ,使胞外酚含量增加且极大峰比对照提前约 3 d出现。 结论　甲基茉莉酮酸不仅促进细胞由初生代
谢提前向次生代谢转化 ,并且能够增强细胞的次生代谢 ,有利于细胞相关次生代谢产物的合成。
关键词: 南方红豆杉 ;紫杉醇 ;甲基茉莉酮酸 ;悬浮培养
中图分类号: R282. 1; R286. 0　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 01 0027 04
Cell metabolism of Taxus chinensis var. mairei in suspension cultures
treated with methyl jasmonate
WANG Yan-dong , LU Ming , YU AN Ying-jin
( Depa rtment o f Pharmaceutica l Engineering , Schoo l o f Ch emical Engineering and Techno log y ,
Tianjin Univ ersity, Tianjin 300072, China )
Abstract: Object　 To study the physio logical changes o f Taxus chinensis va r. mairei ( Lemee et
Lé v l. ) Cheng et L. K. Fu in the case of methy l jasmonate ( M J) . Methods　 TTC assay, soluble pro tein
measurement and enzyme analysis w ere used. Results　 It w as observ ed tha t M J inhibi ted Taxus cell
g row th in the view of primary metabolism. M J induced phenylalanine ammonia-ly ase( PAL) activi ty w hi le
i t inhibi ted po lyphenoloxidase ( PPO ) activity. Ex tracellular phenolic content af ter addition of M J in-
creased to the maximum a t the three days than tha t o f the control g roup. Conclusion　 It w as demonst rat-
ed that M J induced the t ransition of Taxus cell f rom prima ry metabo lism to seconda ry metabolism. This is
fav o rable for secondary metabolism of Taxus cells. It i s impo rtant to study the physio logy o f Taxus cells
fo r rev ea ling the mechanism o f M J.
Key words: Taxus chinensis var. maireii ( Lemee et Lé v l. ) Cheng et L. K. Fu; taxo l; methyl jas-
mona te ( M J) ; suspension culture
·27·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 1期 2003年 1月
收稿日期: 2002-05-27基金项目:国家自然科学基金 ( 20176038) ;杰出青年科学基金 B( 20028607)作者简介:王艳东 ( 1974— ) ,女 ,内蒙古呼和浩特人 , 2000年获天津大学化工学院生物化工专业工学硕士学位 ,现攻读天津大学生化专业博士学位 ,主要从事天然产物开发及植物细胞培养的研究。 Tel: ( 022) 27401642　 E-mail: yandong. w ang@ eyou. com
* 通讯作者　 Tel: ( 022) 27401149　 E-mai l: yjyuan@ public. tpt . t j. cn
　　自从 1977年紫杉醇 ( tax ol )特殊的抗癌机制被
发现以来 [1 ] ,其较高的药用价值使需求量一直很大。
但是 ,由于其自然资源缺乏 ,目前的人工合成步骤繁
杂且产量低 ,其价格居高不下 ,严重限制了临床上的
应用。因此 ,拓宽紫杉醇来源途径 ,提高紫杉醇产量、
降低紫杉醇生产成本的研究尤为学术界关注。
植物细胞培养生产紫杉醇以其生长周期短、无
污染、连续可供等优点 ,近年来成为研究热点 [ 2]。但
研究中发现 ,该方法的难点在于细胞正常生长状态
下很难大量合成紫杉醇。为解决此问题 ,采用适当方
法影响细胞的正常生长状态 ,进而提高紫杉醇产量
的研究成为必须。 目前 ,在该过程中 ,添加生物或非
生物诱导子的方法以其简捷、高效等优点 ,成为国内
外众多研究者优先考虑和着重研究的方法 [3 ]。 甲基
茉莉酮酸 ( methy l jasmonate, M J)作为一种典型的
非生物诱导子 ,由于其在紫杉醇生物合成中的显著
作用更为研究者瞩目 [ 4]。已有研究表明 M J作为一
种重要的信号分子 ,在植物中影响细胞初生代谢的
同时 ,还可诱导防御基因表达 [5 ]。而防御反应的发生
与次生代谢紧密相关。 考虑紫杉醇是红豆杉细胞的
次生代谢产物 ,也是红豆杉细胞受外界刺激而发生
防御反应时产生的一种植保素。 因此考察 M J作用
下细胞相关生理生化反应的变化有利于揭示 M J对
细胞的诱导机制 ,进而指导紫杉醇的生物合成。但众
多已报道的研究只是集中于其对紫杉醇合成产量的
最终影响 ,很少涉及对细胞有关代谢及防御反应酶
类等生理指标的影响研究。 本研究选择南方红豆杉
细胞为研究体系 ,考察了在 M J作用下其初生代谢
及与紫杉醇合成有关的其他次生代谢的生理生化指
标 ,以期揭示 M J对红豆杉细胞的生理作用机制 ,为
指导紫杉醇的生物合成提供一些思路。
1　实验材料
研究用南方红豆杉 Taxus chinensis var. mairei
T细胞系由中国科学院植物研究所提供。细胞接种
于改良 B5固体培养基上扩大培养后 ,接种于含 50
m L改良 B5液体培养基的 250 mL锥形瓶中 , 25
℃ , 110 r /min黑暗振荡培养 5代以上。选取长势良
好细胞 ,继续培养 ,在第 7天加入诱导子 M J,终浓度
达 100μmo l /L;同时设立空白对照。在加入 M J后
0, 2, 3, 4, 5, 6, 8 d取样。
2　方法与结果
2. 1　细胞活力: 采用 TTC法 (氯化三苯四氮唑还
原法 )测定脱氢酶的活性作为细胞活力的判据 [6 ]。结
果见图 1。 在考察的前 4 d,对照组细胞活力呈上升
趋势 ,这是细胞处于指数生长期的表现 ;随后 3 d
内 ,细胞活力维持较高水平 , 7 d之后由于细胞衰老
表现为活力下降。与对照相比 , M J作用下的细胞活
力明显偏低 ,且在本研究考察范围内 ,细胞活力变化
幅度很小。分析认为 ,这是由于外加 M J显著抑制了
细胞生长所致。 这与 Furmanowa等人的研究结果
一致 [5 ]。 因此 ,推断在外源 M J作用下 ,细胞初生代
谢极有可能受到了明显的抑制。
A-对照组　 B-M J处理组
A-cont rol g rou p　 B-M J group
图 1　经 MJ处理的细胞活力变化曲线
Fig. 1　 Cell viability curve af ter treatment with M J
2. 2　总蛋白含量:有研究表明 ,在培养的细胞中细
胞的生长、分裂与分化和可溶性蛋白含量的变化有
紧密的联系 ,蛋白含量的增加与细胞的分裂有关 [7 ]。
因此对细胞总蛋白含量的变化进行了考察。 胞内外
可溶性蛋白含量测定方法如下:抽滤红豆杉细胞悬
浮培养物 ,收集滤液作为胞外待测液 ;称取 300 mg
抽滤后鲜细胞 ,液氮冷冻 ,加入 0. 01 g聚乙烯吡咯
烷酮和少量石英砂 , 4℃下充分研磨 ,加入 2 mL酶
粗提液 (含 0. 2 mol /L ED TA, 0. 4 mmol /L二硫苏
糖醇的 0. 1 mo l /L磷酸盐缓冲液 ) , 4℃下离心 ,取
上清液为胞内待测液。考马斯亮蓝法测定蛋白质含
量。细胞胞内、外总蛋白含量的变化见图 2。在考察
的前 3 d,两组细胞蛋白含量几乎处于同一水平 ,第
3, 4天两组蛋白水平均下降。第 4天时 ,对照组水平
不再降低 ,但经 M J处理组的蛋白含量继续下降 ,在
考察的第 4～ 8天 ,处理组蛋白含量明显低于对照。
对于对照组而言 ,在考察的前 3 d细胞一直处
于指数生长前期 (图 1) ,细胞的初生代谢较为旺盛 ,
使得蛋白合成速率与细胞总生物量增长速度几乎相
等 ,因此在考察的前 3 d,总蛋白含量相对于细胞干
重来说维持在较高水平。 但随着细胞进入生长停滞
期 ,细胞合成蛋白速率减慢 ,总蛋白含量下降。对于
对照组而言 ,加入 M J后细胞的刺激反应 (细胞信号
·28· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 1期 2003年 1月
A-对照组　 B-M J处理组
A-cont rol group　 B-M J g roup
图 2　MJ处理后可溶性总蛋白含量变化
Fig. 2　 Content curve of intracellular soluble
total protein after treatment with MJ
转导、基因启动以及蛋白的合成 )表现出来需要一定
的时间 ,因此在考察的前 3 d处理组未出现蛋白合
成抑制现象 ,表现为蛋白含量与对照组几乎处于同
一水平。 3 d后 ,由于受到一定刺激 ,引发抗性反应
的发生 ,细胞内要进行大量的蛋白更新 [8 ] ,表现为第
3～ 4天蛋白含量的快速下降 ;在第 4～ 8天 ,总蛋白
含量低于对照 ,与 M J抑制细胞活力相一致 , M J抑
制了蛋白的合成。
综上 ,经 M J处理的南方红豆杉细胞初生代谢
和细胞分裂受到了明显抑制。
2. 3　 PAL(苯丙氨酸解氨酶 )活性的变化: PAL活
性测定方法如下: 取 0. 1 mL胞内待测液 ,加入 2
m L 0. 05 mol /L Tris-H2 SO4缓冲液 ( pH= 8. 8)和 1
m L 0. 02 mo l /L苯丙氨酸 ,混匀 , 290 nm下测吸光
度值 ( A )。然后将溶液置于 30℃恒温水浴中反应 60
min, 290 nm下测 A290。以 ΔA290 /Δt= 0. 1 /60 min为
一个酶活单位。
PAL是植物细胞中连接初生代谢和次生代谢
的重要酶类 ,并且 PAL对紫杉醇的生物合成有一定
的催化作用 [9 ]。因此 ,考察 PAL的活性有利于了解
外源刺激下红豆杉细胞的代谢情况 ,以及外源刺激
下抗性反应的发生情况。 PAL的活性变化见图 3。
在考察的前 4 d,对照组 PAL的活性维持在较
高水平 ;结合图 1可知 ,这一时期细胞正处于指数生
长前期 , PAL酶活性较为稳定。 第 4～ 6天 ,细胞正
处于指数生长末期 ,细胞生长逐渐趋于稳定 (图 1) ,
在此期间 , PAL活性经历一突变过程 ,这是初生代
谢向次生代谢转化的表现。第 6天后 ,细胞进入生长
停滞期 , PAL活性变化不大。经 M J处理的处理组 ,
PAL的活性呈先升后降趋势 ,在处理后的第 3天达
到最高水平且明显高于对照 ,表明 M J对 PAL诱导
A-M J处理组　 B-对照组
A-M J g rou p　 B-cont rol group
图 3　经 MJ处理后 PAL活性变化
Fig. 3　 PAL activity af ter treatment with MJ
后 ,在第 3天表达最强 ,极值峰的出现表明了 M J在
第 3天发生了细胞由初生代谢向次生代谢的转化。
Gundlach等 [5 ]研究表明 M J对 PAL的最强诱导活
性发生在诱导后的第 25 h和第 33 h ,可见不同细胞
体系可有不同诱导效果。经 M J处理后第 3～ 8天
PAL呈下降趋势 ,推测 M J对 PAL的诱导为短期
行为 ,随着作用时间的延长 ,诱导作用逐渐减弱。 由
于苯丙烷途径是植物抗病原侵染的重要代谢途径 ,
而 PAL又是这一途径的关键酶。 因此 ,红豆杉细胞
中 M J诱导 PAL活性的增强表明红豆杉细胞经 M J
作用后抗病能力获得增强 ;同时 PAL又是紫杉醇侧
链生物合成的重要酶类 ,所以 PAL活性的增强也是
M J促进紫杉醇产量提高的原因之一。
2. 4　胞外酚含量和胞外 PPO (多酚氧化酶 )的变
化: 酚类是细胞受到外界胁迫时所产生的一种防御
性次生代谢产物 ,它的产生有利于细胞次生壁木质
素的沉积和合成相关次生代谢产物 [10 ]。因此 ,酚类
物质的合成可反映细胞次生代谢的旺盛程度 ,相应
的促进酚类物质的合成在一定限度内将有助于提高
其他相关次生代谢产物的合成。但是酚类物质的过
多累积会对细胞本身造成伤害。在实际过程中 ,细胞
能够进行相应的自我调节 ,即将多余的酚类物质及
时清除。 PPO通常被认为是一种典型的酚类物质清
除剂 ,它可将酚类物质转化为醌类 ,从而减轻酚类对
细胞的伤害。进一步揭示其作用关系 ,有利于优化指
导次生代谢产物紫杉醇的生物合成。
胞外酚测定方法如下:取 8 m L培养基滤液 ,加
入 10 mL乙酸乙酯 ,超声 ,静置萃取 2 h,取 5 mL上
相 (乙酸乙酯 )组分蒸发干燥后 ,残留物溶于 3 mL
75%乙醇 , 280 nm下测量吸光度值 ,以 3 mL 75%
的乙醇为对照。 胞外 PPO活性测定方法如下:比色
皿中加入 1. 5 mL 0. 02 mol /L邻苯二酚溶液和 1. 5
·29·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 1期 2003年 1月
m L 0. 05 mol /L磷酸盐缓冲液 ( p H= 6. 0) ,再加入
适量胞外待测液 ,立即于 398 nm下每隔 2 min读
数 ,以 0. 05 mol /L的磷酸盐缓冲液为对照。 以
ΔA398 /Δt= 0. 01 /min为一个酶活单位。 M J作用下
胞外酚和 PPO活力的变化见图 4, 5。
■ -对照组　□ -M J处理组
■ -con t rol g rou p　□ -M J group
图 4　经 MJ处理后的胞外酚含量的变化
Fig. 4　 Content curve of extracellular phenol
af ter treatment with MJ
A-对照组　 B-M J处理组
A-cont rol group　 B-M J g roup
图 5　经 MJ处理后 PPO活性变化
Fig. 5　 PPO activity after treatment with MJ
两组胞外酚含量均呈先升后降趋势。 对照组在
考察的第 6天出现最高值 ,而 M J处理组在处理后
第 3天即出现最高值 ,并且其胞外酚含量的极大值
远高于对照。可见 ,经 M J处理 ,不仅使胞外酚含量
增加 ,且使胞外酚的大量合成提前到处理后第 3天 ,
这与 PAL被诱导后获得最大活性的时间相一致 (图
3)。这充分表明经 M J处理 ,细胞不仅次生代谢被加
强 ,而且使细胞由初生代谢向次生代谢的转化提前。
由图 5可见 ,在考察范围内对照组 PPO活力随时间
呈先升后降趋势 ,在第 4天达到最高水平 ;经 M J作
用后 , PPO活性呈逐渐上升趋势。 但 M J处理后
PPO整体水平低于对照。说明 M J作用下 PPO活性
受到一定抑制作用。结合图 4,推测 M J作用下 PPO
的作用底物胞外酚的大量积累可能是抑制 PPO活
性的主要原因。大量酚类积累可能使细胞来不及合
成足够 PPO用以消除酚类毒性。因此 ,对酚类物质
的消除作用减弱 ,这可能也是细胞经 M J处理后褐
化的主要原因之一。
3　结论
　　 M J作为一种信号分子 ,它可启动多种基因表
达 ,由此可促进多种次生代谢产物的生成 [11 ] ,但其
对红豆杉细胞的诱导机制尚不明确。本研究从细胞
活力、蛋白含量及与次生代谢和抗性反应相关的酶
等指标出发 ,初步探讨了 M J对南方红豆杉细胞中
与代谢相关的生理态势的影响。结果表明 M J明显
抑制了细胞活力 ,对细胞的初生代谢造成了不良影
响: M J可促使细胞从初生代谢向次生代谢提前转
化 ,且可增强次生代谢的进行 ,这也是 M J促进紫杉
醇产量提高的原因之一 ; M J的作用使细胞消除胞
外酚的伤害能力减弱 ,推测这是细胞经 M J处理后
细胞褐化的原因之一。因此 ,本研究结果提示我们用
M J诱导南方红豆杉细胞 ,提高其次生代谢产物紫
杉醇的同时 ,采取相应措施 (比如加入抗氧化或抗衰
老物质 )消除大量酚累积对细胞的伤害是必需的。
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