全 文 ：·药材与资源·
银杏细胞固定化培养及其影响因素考察
于荣敏1 ,高　越2 ,吕华冲3,张　辉2,姚新生1, 2

( 1. 暨南大学药学院, 广东 广州　510632; 2. 沈阳药科大学,辽宁 沈阳　110016; 3. 广东药学院,广东 广州　510224)
摘　要: 目的　利用银杏细胞固定化培养法生产银杏内酯。方法　以聚胺酯泡沫为固定化材料,考察各种因素对固
定化银杏细胞培养的影响。结果　用高密度、小孔径聚胺酯材料 P29, 将其切成 0. 5 cm×0. 5 cm×0. 5 cm 的小块,
每瓶加 0. 72 g 载体, 加 65 mL 液体培养基( MS+ 2, 4-D 8. 0 mg / L+ KT 0. 04 mg / L + NAA 0. 4 mg/ L ) , 接种鲜重
200 g / L , 可得到高达 71%的固定化比例, 载体上细胞密度达到干重 22 mg / cm3。结论　以聚胺酯泡沫为固定化材
料进行银杏细胞固定化培养具有方法简便、成本低廉、细胞固定化比例高等优点,具有潜在的应用价值。
关键词: 银杏;细胞培养; 固定化;聚胺酯泡沫
中图分类号: R282. 13　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2004) 07 0803 06
Cell immobilization culture of Ginkgo biloba and determination of their affecting factors
YU Rong-min
1
, GAO Yue
2
, LU
　¨
Hua-chong
3
, ZHANG Hui
2
, YAO Xin-sheng
1, 2
( 1. College o f Pharmacy, Jinan Univ ersity, Guangzhou 510632, China; 2. Shenyang Pharmaceutical Univer sity ,
Shenyang 110016, China; 3. Guangdong Co llege o f Pharmacy, Guangzhou 510224, China)
Abstract: Obj ect 　 T o invest ig ate the applicat ion o f cell immobilizat ion cultur e to producing
ginkgolides in Ginkgo bi loba L. Methods　T o immobilize the cells by poly am inor esin foam as suppor t ma-
terials, and determine the ef fects of differ ent factor s. Results　The r esults show ed that 71% o f immobi-
lizat ion rat io and 22 mg/ cm3 o f cell density were obtained using P29 of high density, small bo re diameter
w ith pieces of 0. 5 cm × 0. 5 cm × 0. 5 cm, 0. 72 g of support matr ices per bot t le in 65 mL of M S medium
so lut ion supplemented w ith 2, 4-D 8. 0 mg / L+ KT 0. 04 mg/ L+ NAA 0. 4 mg/ L and the incoulum quant ity
w as 200 g/ L . Conclusion　It show s that present method has some advantages, such as simpleness, low
co st , high immobilizat ion rat io.
Key words : Ginkgo bi loba L. ; cell culture; immobilization; po lyaminoresin foam
　　植物培养细胞与微生物细胞比较,具有生长速
率慢、药用成分含量低等缺点。高密度发酵可以很好
的解决前者的缺陷, 而固定化细胞培养则有利于活
性成分的提高。虽然悬浮细胞能够生产次生代谢产
物,但与其生物量相比,次生代谢物的产量却不高。
科学研究发现,密集而有一定程度分化的、生长缓慢
的细胞培养物,较分散而无结构的、生长迅速的细胞
培养物累积更多的次生代谢物。其原因为: 前者细胞
所处的理化环境与其在整体植物中所处的环境类
似,细胞因而能够发挥正常的代谢功能;而对后者而
言,细胞在培养液中所处的环境既无极性, 也无理化
梯度。故而设想把细胞固定在一定的支持物上, 使它
们之间密切接触, 并形成一定的理化梯度, 即人为地
营造一个通过培养基循环供应的类似于在整体植物
分化组织中的生长环境。如此,既可以保障细胞的营
养需要, 又可避免由于代谢产物的累积而对细胞代
谢造成反馈抑制。基于上述理论, 目前,细胞固定化
技术已日臻完善, 且越来越多地引起了众多生物医
药学家的关注。
生长的休止、环境压力及分化对触发次级代谢
产物的形成至关重要。在固定化培养中,上述3种因
素相辅相成。就聚胺酯泡沫而言,细胞进入小孔径的
框架里,最初仅为纯物理滞留[ 1]。之后,细胞分泌出
蛋白、果胶、阿拉伯半乳聚糖和木糖-葡聚糖等糖类
成分而形成延伸层, 牢固地附着于泡沫基质内,在小
空间内进行生长、分裂。由于聚集度较高,形成生物
·803·中草药　Chinese T radit ional and Herbal Drugs　第 35 卷第 7 期 2004 年 7 月

收稿日期: 2003-11-29作者简介:于荣敏( 1955—) ,男,教授,博士,研究方向为中药生物技术和创新药物的研制开发。
膜而导致物质传递障碍 [ 2]。于是,形成了各种营养物
质(包括 O 2 )由外至内、各种代谢产物由内至外的浓
度梯度。物质的不均一性必然引起细胞质状态的不
均一——分化。细胞间的紧密联系、识别和反馈也导
致分化。当细胞填充孔隙达到某种程度,四周的固形
物给细胞某种反馈,细胞不再趋于分裂。这样将使得
初级代谢物积累, 并有利于生长方面的活动,包括大
量转化为次级代谢物及向多元化发展。在细胞固定
化的情况下, 有许多流变学的优点,使得整个培养过
程方便易控, 外部的大环境可人为改变,细胞团内部
有缓冲的不均一性,两者结合,可随时调控细胞的生
命方向。
植物细胞固定化的大量兴起始于 20世纪 80年
代,方法、材料和形式多种多样, 一些方法的优点尚
未完全明了, 而另一些方法却已因缺陷太多而被淘
汰。本研究使用聚胺酯泡沫作为银杏细胞固定化的
支持物。聚胺酯泡沫具有如下特点: ( 1)固定化初期
属于纯物理滞留型,之后逐步形成自然亲和型, 结合
后则属于紧密型, 在空间形式上属于微包囊型。聚胺
酯泡沫由商业成品获得,在固定化过程中其结构不
再改变; ( 2)聚胺酯泡沫质量轻, 单位质量的强度高,
回弹性好,冲击强度高,可根据需要获得任意形状及
大小,有较好的流变学特性。由于其伸展结构及性质
多样性,是现今所知最好的生物及血液相容性材料
之一,被广泛用于医疗器件制造等,范围从导管一直
到全人工心脏 [ 3]。本实验在前期工作[ 4～7]的基础上,
进行了银杏细胞的固定化培养研究。
1　材料与方法
1. 1　材料:培养细胞选取本课题组诱导并不断继代
选育得到的WDa 细胞系。
固定化材料采用市售聚胺酯泡沫,将其制成一
定边长的立方体, 共采用 3种型号的聚胺酯泡沫:
P29 ( 29. 6 kg/ m
3
) , P24 ( 23. 9 kg / m
3
) , P17 ( 16. 8
kg/ m
3)。灭菌前加入已分装培养液的瓶中。
1. 2　方法
1. 2. 1　培养方法: M S+ NAA 1. 0 mg / L+ KT 0. 1
mg / L+ 蔗糖 30 g / L + 琼脂 7. 5 g / L ,每 24天更换
一次培养基, 25 ℃培养。固定化培养时,采用MS+
NAA 1. 0 mg / L+ KT 0. 1 mg/ L+ 蔗糖 30 g / L ,接
种 10 d龄WDa细胞系,摇床 80 r / min, 25 ℃培养。
1. 2. 2　细胞数检测方法: ( 1)血球计数法: 悬浮细胞
数测定:将已移出泡沫的培养液加入玻璃珠打碎,振
摇,迅速用滴管取出一部分, 滴于血球计数板上,显
微镜下观察计数; 固定化细胞数测定: 将泡沫移至
10 mL 0. 9% NaC1溶液中,振荡器振荡( 120 r/ min)
30 s,将泡沫取出。重复以上操作两次。合并 3次的
NaC1 液体,加入玻璃珠, 振荡打碎, 镜检计数。( 2)
干重法: 将被固定的细胞及载体或悬浮细胞分别滤
过, 用蒸馏水洗 3遍, 置表皿中, 于烘箱 80 ℃烘烤
24 h, 称重。泡沫分装之前准确称质量,按一定质量
分装。滤纸在滤过之前称质量,与滤过物同时烘干,
同时称质量,以避免损失掉沾于滤纸上的细胞。
悬浮细胞量( g ) = 总质量- 称量纸质量- 滤纸质量
固定化细胞质量( g ) = 总质量- 称量纸质量- 滤纸质
量- 泡沫质量
总质量( g ) = 悬浮细胞质量+ 固定化细胞质量
固定化比例( % ) = 固定化细胞质量/悬浮细胞质量
1. 2. 3　载体材料预处理:载体材料取自于商业制成
品,是由两种不同单体经加聚反应制成的聚合物。由
于少量残留的单体(尤其是异氰酸酯)可能对植物细
胞产生毒性,故在使用前必须进行预处理。预处理现
多采用有机溶剂(甲醇或乙醇)法 [ 8]清洗。方法[ 9]为
将市售的泡沫按所需裁成一定规格的标准立方体,
经 95%乙醇浸洗 3遍, 挤干, 再浸泡于水中, 于 121
℃, 30 min 高温高压处理之后挤干,再用约 100 ℃
蒸馏水浸洗3遍,挤干,于烘箱 80℃烘干至恒重。称
取一定量,分装至 250 mL 三角瓶中。
1. 2. 4　载体内含气体的影响: 由于载体为网状泡
沫, 含有大量气体,如不经过处理就置于培养液中,
水分不会自动浸满, 加上载体本身很轻,故漂浮于液
体中。为了观察气体的存在与细胞吸附的关系,以及
载体的这种半气体充满半液体浸泡状态,经长期的
摇床细胞培养其性质是否会改变, 进行了脱气实验。
采取 3种方式脱气: ( 1)手动脱气 ( 2)真空脱气 ( 3)
超声脱气。
1. 2. 5　影响细胞固定化的因素考察:植物细胞固定
于聚胺酯泡沫上是一个复杂的过程, 有纯物理滞留
的作用, 也有细胞自发的分泌黏性物质的生物吸附
作用。整个过程或某一阶段到底哪个作用起主导, 各
种培养条件如何适合于各种固定化作用,至今没有
形成一致的看法。本研究就此进行了深入的探讨, 以
寻求一种可达到高固定化比例、高密度的固定化细
胞和低生长速率的条件。
( 1)载体孔径: 相同条件: 细胞种子来源为
WDa,接种量为鲜重 40 g / L , 85 mL/瓶。不同条件:
a )将P29切成1. 0 cm×1. 0 cm×1. 0 cm 的立方体,
0. 90 g /瓶; b) 将 P24 切成 1. 0 cm×1. 0 cm×1. 0
cm 立方体, 0. 72 g /瓶; c)将 P17切成 1. 0 cm×1. 0
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cm×1. 0 cm 立方体, 0. 51 g /瓶。原则:按体积计算,
使载体在液体培养基中的比例相同(约为 36%)。
( 2)载体大小:相同条件:细胞种子来源为WDa,
接种量为鲜重40 g / L , 65 mL/瓶, 载体均为P29。不同
条件: a) 2. 0 cm×2. 0 cm×2. 0 cm, 约为0. 72 g/瓶;
b ) 1. 5 cm×1. 5 cm ×1. 5 cm , 约为 0. 71 g /瓶; c)
1. 0 cm×1. 0 cm×1. 0 cm, 约为 0. 72 g /瓶; d) 0. 5
cm×0. 5 cm×0. 5 cm ,约为 0. 70 g/瓶。原则: 按体
积计算, 使载体在液体培养基的比例相同 (约为
36%)。
( 3)载体量: 相同条件: 细胞种子来源为WDa,
接种量为鲜重 40 g/ L , 65 mL/瓶。载体均为 P29,
1. 5 cm×1. 5 cm×1. 5 cm。不同条件: a )约为 0. 91
g /瓶, 载体量为 46%; b)约为 0. 68 g /瓶,载体量为
36%; c)约为 0. 51 g/瓶,载体量为 26%。
( 4)培养液体积: 相同条件: 细胞种子来源为
WDa, 接种量为鲜重 40 g / L ,载体均为 P29, 按体积
算,载体在液体培养基的比例相同(约为 36%)。不
同条件: a)载体 1. 0 cm×1. 0 cm×1. 0 cm , 0. 90 g/
瓶,培养液体积为 85 mL/瓶, 接种量为 3. 5 g /瓶; b)
载体 0. 5 cm×0. 5 cm×0. 5 cm, 0. 72 g /瓶, 培养液
体积为 65 mL/瓶, 接种量为 2. 6 g /瓶; c)载体 0. 5
cm×0. 5 cm×0. 5 cm , 0. 49 g /瓶,培养液体积为 45
mL/瓶,接种量为 1. 8 g /瓶; d)载体 0. 5 cm×0. 5
cm×0. 5 cm, 0. 27 g /瓶,培养液体积为 25 mL/瓶,
接种量为 1. 0 g/瓶。
( 5)溶氧: 相同条件: 细胞种子来源为WDa, 接种
量为鲜重 40 g/ L , 培养液体积为 65 mL/瓶。载体为
P29, 0. 5 cm×0. 5 cm×0. 5 cm,约为 0. 72 g/瓶。不
同条件: a)八层纱布盖; b)八层纱布盖+ 一层塑料盖。
( 6)细胞接种量与载体最大承载量: 由于吸附过
程初期属简单的物理过程, 故加大接种量必然会更有
效的利用这一过程,且固定化导致细胞生长缓慢。为
了获得高密度细胞发酵,实验进行了接种量的考察。
相同条件: 细胞种子来源为WDa,培养液体积
为 65 mL/瓶。载体为 P29, 1. 5 cm×1. 5 cm×1. 5
cm , 0. 72 g/瓶。不同条件:接种量分别为鲜重 2. 6、
5. 2、13. 0 g /瓶。
( 7)填充与游离的非可逆性:接种WDa 10 d龄
细 胞, 接 种 量 鲜 重 2. 6 g/瓶。载 体 采 用
P29, 1. 5 cm×1. 5 cm×1. 5 cm ,约为 0. 72g /瓶, 培
养液 65 mL/瓶。经过 13 d 培养将泡沫取出,移入新
的培养液中(该培养液中已有 3块新的载体泡沫) ,
每瓶加入4块已长有细胞的泡沫, 80 r/ min, 25℃继
续摇床培养。定时取样,观察细胞从原载体中转移至
液体及新的载体中的情况。
2　结果
2. 1　细胞数检测: 结果见图 1。干重法 RSD 值低,
操作也比较简单,故本实验均采用干重法。
1-血球计数法( n= 2,RSD= 0. 13% )
2-干重法 ( n= 3, RSD= 0. 08% )
1-h emacytometering ( n= 2, RSD= 0. 13% )
2-dry weight ing ( n= 3, RSD= 0. 08% )
图 1　细胞量检测方法比较
Fig. 1　Method comparison of cell number determining
2. 2　载体材料预处理结果:由图 2 可知,实验材料
预处理后,可避免延迟期延长及生长速率降低。
1-经全部预处理过程　2-未经过 95%乙醇预处理
1-by all pret reatment　2-by pret reatment b es ides 95% ethanol
图 2　载体材料预处理方法观察( n= 3)
Fig. 2　Pretreatment of support matrices ( n= 3)
2. 3　载体内含气体的影响:实验结果显示:不脱气,
则细胞依旧附着于载体上, 但远比脱气的吸附速度
慢;细胞的浸入仅扩张到有液体浸湿的边缘, 随着细
胞的浸入, 载体表面的极性被改善, 更有利于亲水,
且载体的比重加大, 最终完全浸没于液体中。此外,
超声脱气无效。
2. 4　影响细胞固定化的因素考察
2. 4. 1　载体孔径:实验结果显示: ( 1)游离细胞的量
P17> P24> P29; ( 2)固定化细胞的量: P29> P24>
·805·中草药　Chinese T radit ional and Herbal Drugs　第 35 卷第 7 期 2004 年 7 月
P17, P29 最高, 固定化比例在 40%左右。P24、P17
到后期由于结构疏松, 强度低,随着细胞的扩增及持
续的机械碰撞,导致部分破碎,细胞随载体碎片一起
游离于液体中,导致固定化水平锐减,游离的细胞量
激增。游离细胞量的增长与固定化的细胞量的增长
成反比关系; ( 3)固定化比例越高越好, 故 P29 最
优。但固定化影响生长速度, 最终倍增数仅为 2. 7
(按 P29计算)。由于生长消耗与代谢消耗的矛盾,
所以低生长是有利的。
2. 4. 2　载体大小:结果显示: ( 1)固定化细胞的量随
载体块体积的增大而增加, 即边长 2. 0> 1. 5> 0. 5,
这是由于物理滞留的累积作用, 2. 0边长的固定化
比例最高时达 81%; ( 2)随着细胞量的继续积累,使
通气及营养物交换困难,大块载体无法及时将有用
物质运输至载体内,也无法及时排除有毒代谢物。最
终,载体最大承载量出现了刚好相反的情形: 0. 5>
1. 5> 2. 0。Robins 等证明仅仅在泡沫块外围 1. 5
mm 深度以外处, 才能有良好的通 O 2状态[ 10]。此
外,载体体积越大,载体上的细胞越早进入到衰减
期, 即: ( a) 2～140 h; ( b) 1. 5～360 h; ( c) 1～280 h;
( d) 0. 5～430 h。所以, 低密度培养时采用大块泡沫,
而高密度培养时则宜采用小块泡沫; ( 3)游离细胞
量: 0. 5> 1. 5> 2. 0。由于小块载体最初的固定化比
例低, 游离的细胞基数大, 其量一直高于大块载体,
且不受固定化细胞密度的影响。
2. 4. 3　载体量:由结果可知:载体量增加, 固定化细
胞的量相应增加, 固定化比例也相应提高, 但总生物
量基本一致。
2. 4. 4　培养液体积:结果见图 3。采用 65 mL/瓶,
可使固定化比例达到最高值。这与银杏悬浮培养[ 8]
时细胞生长量达到最大的优化条件一致。由此推测
发酵液体积可能与溶氧有关。
2. 4. 5　溶氧和细胞填冲泡沫所需时间, 结果如图 4。
图 3　不同发酵液体积对固定化比例的影响( n= 3)
Fig. 3　Inf luence of various f ermentation solution
on immobilized ratio ( n= 3)
1-纱布盖　2-纱布盖+ 塑料盖
1-gau ze cover　2-gauze cover + p las t ic cover
图 4　溶氧对固定化比例的影响( n= 3)
Fig. 4　Inf luence of dissolved oxygen
on immobilized ratio ( n= 3)
由于塑料加盖, 使通气性能下降,但并未影响固定化
的比例。所以, 溶氧并不是影响固定化的重要因素。
由图 4还可以看出,银杏细胞固定化明显存在一个
快速吸附期,由于此期属物理吸附过程,较生物吸附
有更大的可控制潜力,故进一步对细胞填冲泡沫所
需时间进行了考察。结果显示, 在各种情况下, 6 h
以内均能完成第一阶段的吸附过程。
2. 4. 6　细胞接种量与载体最大承载量:结果见图5。
A-对细胞量的影响　B-对固定化比例的影响
A-effect on cell s　B-ef fect on imobiliz ed rat io
图 5　细胞接种量对固定化的影响( n= 2)
Fig. 5　Ef fect of cell inoculum on
immobilization ( n= 2)
( 1)当细胞接种量鲜重低于 80 g/ L 时, 仍然是 6 h
内完成最初的快速吸附期。在此接种量以内, 随接种
量的增加,固定于载体内的细胞的量呈正比例增加,
而固定于载体内的细胞占总细胞量的比例不变; ( 2)
·806· 中草药　Chinese T radit ional and Herbal Drugs　第 35 卷第 7 期 2004 年 7 月
当细胞接种量鲜重为 200 g / L 时, 其吸附过程在 70
h 达到最高点。固定化比例也在 70 h 时达到最大
值,且高于低接种量的最终固定化比例。( 3)最高的
固定化细胞密度为鲜重0. 52 g/瓶,高于本实验中已
获得的任何最终固定化细胞密度。
2. 4. 7　填充与游离的非可逆性:结果见图 6, 7( 0～
312 h 内每瓶固定化细胞的量为折算值, 即每瓶 7
块载体折算为相当于 4块载体的量)。
细胞从载体上脱落的比例极低, 新、旧载体间细
胞的转移率更低, 故不适宜用已固定的细胞作种子,
用悬浮细胞系或固体培养的细胞作种子较佳。
1-载体上生物量　2-旧载体上生物量
3-新载体上生物量　4-悬浮细胞生物量
1-biomass on support s　2-biomass on old support s　 3-biomas s
on new suppor ts　4-biomass of suspended cell s
图 6　载体上细胞的重新分配 ( n= 3)
Fig. 6　Redistribution of cells on supports ( n= 3)
1-最初栽培状态　2-移入旧介质附加新鲜介质
1-f irst cult ivat ing p hase　2-old medium w as removed
and f resh medium added
图 7　固定化比例的变化
Fig. 7　Dif f erence of immobilized ratio
3　讨论
植物细胞固定于聚胺酯泡沫中可分为 3个阶
段: 第 1 阶段( 0～12 h) :为快速吸附期, 在 12 h 之
内基本完成, 属纯物理滞留;第 2阶段( 35～60 h) :
为较快吸附期, 历时 25 h 左右, 此间游离细胞略有
生长, 在载体上细胞量却以更快的速度增加,最终,
使得固定化比例达到整个培养过程的最高值。此过
程可能是细胞本身分泌黏性物质, 自发的吸附于载
体上,分泌黏性物质需要一定的时间。第 3阶段( 130
h 后) : 为细胞生长阶段,此时细胞进入对数生长期,
开始在载体上以略低于游离细胞的生长速度生长,
固定化比例保持不变或略有下降。
单个载体上的细胞量并未随载体总量的增加而
明显减少, 有时载体量多, 单个载体的细胞量也多。
参考 Rhodes等的研究,当载体量很少时,增加载体
将明显分担固定化的压力, 导致单位载体上的细胞
量明显减少, 固定化比例明显增加,但距最高值很
远; 而当载体量很大时, 在增加其用量时,固定化比
例缓慢增加, 单位载体上的量不再有大的变化。所
以, 实验中所选载体的量较适宜, 即在此接种量时,
载体量已达饱和。
元英进等[ 11]在固定化长春花细胞时, 将泡沫块
与不锈钢丝连接起来,以达到泡沫与培养液的相对
运动,获得了很高的固定化比例及高细胞生长量。这
是因为相对运动造成的载体纯物理滞留,还是由于
物质高效率交换的缘故呢? 笔者未加探讨。且其伴
随的高细胞生长现象,也是固定化中所不常见的。
用0. 5 cm 边长的立方体作载体时,由于物质交
换良好,载体上细胞生长速度快,而游离的细胞量也
很高,所以最终总细胞量最大,且最终固定化比例不
低于 1. 5 cm 边长的载体;此外,由于边长1. 0 cm 的
载体数据取自密度因素考察实验中, 因其摇瓶体积
为 85 mL/瓶,所以数值偏低,由此可见,发酵液体积
对固 定化 过 程影 响 也很 大; 此 外, 2. 0 cm×
2. 0 cm×2. 0 cm 及1. 5 cm×1. 5 cm×1. 5 cm 的固
定化细胞在 200 h 以后不再增加的同时, 游离细胞
的生长也随之停止。本研究根据增代时间计算公
式[ 12]计算 P29, 载体大小为0. 5 cm×0. 5 cm×0. 5
cm 时,固定化细胞的增代时间约为 10 d。
由图 7可以看出,将载体移至新的培养液中, 因
为此时固定化的细胞占绝大多数,而悬浮的细胞极
少,正是一个排除游离细胞干扰,观察固定化细胞特
性的好时机。将载体移至新培养液以后,细胞从载体
上脱落,虽然很缓慢, 但却说明细胞与载体的结合确
实存在着小比例的非牢固结合。另外, 细胞被移入新
的培养基后,也存在一个延迟期, 之后进入生长期,载
体上细胞的生长趋势与移入前载体上细胞的生长趋
势很相似。可见,固定化细胞的生长与游离细胞的生
长是独立的,各自在不同的环境中完成其生长过程。
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石斛属 4种植物的 AFLP分析
虞　泓1, 2* ,和　锐1 ,倪念春1 ,张时刚1

( 1. 云南英茂生物技术实验室, 云南 昆明　650106; 2. 云南大学生命科学学院 生态遗传学实验室,云南 昆明　650091)
摘　要: 目的　研究石斛属植物 DNA 指纹图谱, 初步探讨 AFLP 分子标记技术在石斛地道性鉴别上的应用。方法
采用扩增片段长度多态性 ( AFLP )技术对石斛属内石斛组 4 个种和一个外类群种进行基因组 DNA 多态性分析。结
果　从 64 对引物组合中选出 5 对引物组合构建了 5 个种的 DNA 指纹图谱。通过聚类分析,石斛属 4 种植物聚成
一个大类, 彼此关系得到了很好的分辨, 并获得 boo tstr ap 校验的有力支持。结论　AFLP 技术可用于药用石斛
DNA 指纹图谱研究。
关键词: 石斛属; AFLP ; DNA 指纹图谱
中图分类号: R282. 7　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2004) 07 0808 03
Fingerprinting analysis of plants of Dendrobium Sw. by AFLP
YU Hong
1, 2 , HE Rui
1, NI Nian-chun
1 , ZHANG Shi-gang
1
( 1. Inmol Labo ra tor y o f Biotechnolog y o f Yunnan, Kunming 650106, China　2. Labor ator y o f Ecolog ical
Genet ics, College o f Life Science, Yunnan Univer sity , Kunming 650091, China)
Abstract: Object　Studies on DNA finger print ing of four species of Dendrobium Sw . and the applica-
tion o f amplified fr agment length polymorphism ( AFLP) to the ident if ication of natur al herbal . Methods
The po lymo rphisms o f four species f rom Dendrobium Sw . and one outg roup species were detected by
AFLP technique. Results　T he DNA fingerprint ing of f iv e species were gener ated by fine primer combina-
tions screened from 64 pr imer combinat ions. Four species of Dendrobium Sw . w ere clustered into one big
gr oup, w hose relat ionships w ere dist inguished very w ell . T he results w er e st rongly suppor ted by boot-
st rap test . Conclusion　AFLP technique has pro vided us with the method of study on the DNA finger-
print ing of medicinal species o f Dendr obium Sw .
Key words : Dend robium Sw . ; amplif ied f ragment length polymoyhism ( AFLP) ; DNA fingerprint ing
　　扩增片段长度多态性( AFLP)是在随机扩增多 态性( RAPD)和限制性片段长度多态性( RFLP)技
·808· 中草药　Chinese T radit ional and Herbal Drugs　第 35 卷第 7 期 2004 年 7 月

收稿日期: 2003-10-12作者简介:虞泓,博士生导师,云南大学生物系教授,云南英茂生物技术实验室主任,主持云南大学生命科学学院生态遗传学实验室工作,从事生态遗传学和居群生物学科研与教学。1996年评为云南省学术和技术带头后备人才; 1997年主持完成的《横断山区百合科四个属的细胞遗传与进化研究》获“云南省自然科学二等奖”; 1998年主持完成的《云南百合科遗传多样性与进化研究》获首届“云南省青年科技奖”; 2000年获云南省五四青年奖章; 2002年云南省人民政府授予“云南省中青年学术技术带头人”称号; 2003年获“云南省科技论文一等奖”。发表论文 40篇( SCI 论文 6篇)。
* 通讯作者　Tel: ( 0871) 8327767　Fax : ( 0871) 8327761　E-m ail : fis her @p ob lick . km. yn. cn