全 文 ：参照苋科植物 rRNA 基因 IT S片段序列确定, 所得
DNA 序列输入计算机后,用 Clustal W 软件对序列
进行对位排列,并输以人工校对。以尽量减少排列所
需缺失的数目。得到的序列用 MEGA ( Molecular
Evolut ionary Genet ics Analy sis Version 1. 02)软件
进行系统发生分析。在图中18 S, 26 S 及 5. 8 S 用阴
影部分所示,“·”表示具相同碱基, “- ”表示缺失,
序列上方的数字为排序后的各碱基的位置编号。
2. 5　碱基序列大小:共测得 16个牛膝样品 ITS-1,
5. 8 S rDNA 和 ITS-2全序列 18 S rDNA 基因 3’端
和 26S rDNA 基因 5’端部分碱基序列, 共约 630
bp。其中 IT S-1约为 230 bp, 5. 8 S rDNA约为 160
bp, IT S-2约为 209 bp(见表 2)。
表 2　ITS-1, 5. 8 S rDNA , ITS-2
的碱基大小及 G+ C的含量
Table 2　Size and G+ C contents of ITS-1,
5. 8 S rDNA , and ITS-2 sequence
样品 IT S-1
/ bp G+ C/ %
5. 8 S rDNA
/ bp G+ C/ %
IT S- 2
/ bp G+ C / %
总计
/ bp
1 231 51. 3 160 50. 6 209 52. 6 600
2 231 51. 3 160 50. 6 206 56. 8 597
3～16 231 51. 3 160 50. 6 206 56. 8 597
3　讨论
3. 1　通过对 16个牛膝样品序列分析可知, 不同产
地牛膝基因变异不大, 种间有明显差异,且差异均在
ITS-区内, 川牛膝 ITS-1 有差异, 土牛膝 IT S-1及
ITS-2均有差异,说明 IT S区易变异。此方法可用于
牛膝种间及真伪品鉴别,不能用于鉴别道地药材。
3. 2　牛膝属苋科植物牛膝含大量牛膝多糖,在提取
DNA 时与 DNA 一起沉淀, 常常像凝胶一样, 很难
去除,并抑制随后 PCR中 DNA 多聚酶的活性。通
过 DNA 纯化的方法可以去除这些物质。其药用部
位为根茎类且多糖含量高,故药材提取量要大, 用 5
mL 离心管,大体积抽提。
3. 3　实验过程中发现,提取的 DNA 用 5 LL 点样
电泳检测, 有时并不能看到 DNA, 但并不意味着没
有抽提到 DNA。可以继续 PCR扩增。将 DNA 模板
适当增多,有时同样可得到好的 PCR扩增产物。只
有检测不到 PCR 扩增产物才能确定没有抽提到
DNA。
3. 4　PCR扩增产物用试剂盒纯化后, 如果电泳检
测产物仍不纯, 一般可采取提高反应条件(如退火温
度) ,切胶纯化、克隆纯化等措施。本实验的 3号样品
即采用克隆技术才达到良好的测定效果。
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盾叶薯蓣根状茎不同部位和不同生长期薯蓣皂苷元含量的差异性研究
曹玉芳1, 2 ,王太霞1, 3,胡正海1X
( 1. 西北大学植物研究所, 陕西 西安　710069; 2. 莱阳农学院生命科学学院,山东 莱阳　265200;
3. 河南师范大学生命科学学院,河南 新乡　453002)
摘　要: 目的　揭示盾叶薯蓣根状茎不同部位和不同生长期中皂苷的积累与分布以及薯蓣皂苷元含量的差异。方
法　组织化学和高效液相色谱法( HPLC)。结果　皂苷主要分布在基本组织内, 有小维管束分布的区域皂苷积累最
丰富, 薯蓣皂苷元的含量也最高; 其次是无维管束分布的区域;有大维管束分布的区域皂苷积累最少,薯蓣皂苷元
的含量最低。结论　雄株 3 个区域的皂苷元含量均明显的高于雌株,雌雄同株其含量界于雄株和雌株之间。
·562· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 5 期 2004年 5月
X 收稿日期: 2003-08-30作者简介:曹玉芳( 1963—) , 男,山东莱西市人,博士生,副研究员,主要从事植物学、药用植物学和结构植物学的教学与科研工作,已发表论文 30余篇。T el : ( 0535) 2922145
* 通讯作者　E-mail: zhenghaihu@ yahoo. com. cn
关键词: 盾叶薯蓣;组织化学; HPLC;薯蓣皂苷元
中图分类号: R286. 6　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2004) 05 0562 04
Studies on diversity of diosgenin in different part of rhizome
of Dioscorea z ingiberensis in various growing period
CAO Yu-fang
1, 2
, WA NG Tai-x ia
1, 3
, HU Zheng-hai
1
( 1. Institute o f Bo tany , Nor thwest U niver sity , Xian 710069, China ; 2. Colleg e of L ife Science, Laiyang Ag r icultur al
Co lleg e, Laiy ang 265200, China; 3. Co lleg e of L ife Science, Henan No rmal Univer sity , Xinx iang 453002, China)
Abstract: Object　T o study the accumulat ion and dist ribut ion o f dio scin in the dif ferent part of r hi-
zome of Dioscor ea z ingiber ensis C. H. Wr ight and the dif ferences of its diosgenin. Methods　Histochem-
ist ry has been used to study the accumulat ion and dist ribut ion of dioscin in the dif ferent part of rhizome
and diosg enin w as determined by HPLC. Results　 Dioscin dist ributed mainly in g round t issue. T he
amount of dio scin accumulated in the plant part fr om the region dist ributed w ith small vascular bundle
( SVB) is the most abundant , and the dio sgenin is also the highest in the same r eg ion; bo th o f them in the
region w ith no vascular bundle ( N VB) are nex t to that o f SV B; the amount o f dioscin accumulated in the
region distr ibuted w ith big vascular bundle ( BVB) is the low est , and the diosg enin is the low est in the
same reg ion to o. Conclusion 　Diosgenin in every region of the three of male rhizome is higher than that of
female rhizome and diosgenin in every reg ion o f the three of monoecism is betw een those o f male and fe-
male rhizome.
Key words : Dioscorea z ingiberensis C. H. Wright ; histochem ist ry; HPLC; diosgenin
　 　 盾 叶 薯 蓣 Dioscor ea z ingiberensis C. H.
Wright 又名黄姜、火藤根, 多年生缠绕草质藤本植
物,隶属于薯蓣科薯蓣属根状茎组,为我国特有种。
该属植物的根状茎中含有丰富的薯蓣皂苷元,是重
要的甾体激素类药源植物,盾叶薯蓣由于其含量高
为我国主要药源植物。其水溶性甾体皂苷成分对心
肌缺血、胸痹、高脂血症等有明显的治疗作用[ 1] ,生
药具有清肺止咳,利湿通淋, 通络止痛,解毒消肿的
功能[ 2]。目前,薯蓣皂苷元是300多种甾体激素类药
物合成的起始原料 [ 2]。对它的研究已有甾体皂苷的
分离鉴定[ 3, 4]、薯蓣皂苷元的测定方法[ 5, 6]、胚胎发
育[ 7]、根状茎的发育解剖 [ 8]、薯蓣皂苷元含量与气候
因子的相关性 [ 9]等报道。但有关盾叶薯蓣根状茎不
同部位其皂苷的分布与积累、薯蓣皂苷元含量的差
异尚未见报道。本实验利用组织化学和 HPLC 法对
盾叶薯蓣根状茎不同部位和不同生长期其皂苷的积
累与分布以及薯蓣皂苷元的含量进行了系统研究。
1　材料与方法
1. 1　材料:盾叶薯蓣, 采于西北大学植物研究所实
验材料繁殖园。材料采集的时期分别为:盛花期、果
期、枯萎前期。
1. 2　仪器:薯蓣皂苷组织化学定位研究的实验材
料,用 LEICA CM 1850冷冻切片机进行冷冻切片,
切片厚度为 30～40 Lm, 用三氯化锑的浓盐酸溶液
或三氯化锑的高氯酸溶液[ 1 0]进行显色, 在 LEICA
DMLB 显微镜下观察并照相。HP 1100高效液相色
谱仪。
1. 3　薯蓣皂苷元含量的测定
1. 3. 1　色谱条件: 柱为 Zor bax SB-C18 ( 150 mm×
4. 6 mm, 3. 5 Lm) ;流动相为甲醇-水( 95∶5) ; 流速
1 mL/ min;柱温 30 ℃;检测波长 208 nm ;进样量为
10 LL。
1. 3. 2　对照品溶液的配制:薯蓣皂苷元对照品由西
部植物化学国家工程研究中心提供(纯度98%)。准
确称取干燥后的薯蓣皂苷元对照品 5 mg, 置于 10
mL 量瓶中,加入甲醇溶解并定容至刻度, 得浓度为
0. 5 mg / mL 的对照品溶液。
1. 3. 3　样品溶液的制备:测定薯蓣皂苷元含量的根
状茎样品在 60℃的恒温箱内烘干至恒重。粉碎后准
确称取 1 g , 置入索氏提取仪中用 60 mL 甲醇提取
至馏出液无色。回收溶剂,加 20 mL 2 mol/ L HCl,
水浴回流 4 h。溶液冷却后, 用30 mL 氯仿分3次萃
取, 合并氯仿萃取液, 回收溶剂,用甲醇溶解并定容
为10 mL,经 0. 45 Lm 膜滤过后制成样品溶液,供进
样用。取 3次重复的平均值, 作为每个样品的含量。
2　实验结果
2. 1　根状茎的结构及其皂苷的组织定位:盾叶薯蓣
根状茎的横切面由外到内是由周皮、基本组织和分
散在基本组织中的维管束构成[ 8]。基本组织最外围
有一圈约 1～1. 5 mm 厚的薄壁组织区域,无维管束
·563·中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 5 期 2004年 5月
分布。其内为基本组织的内部区域, 有维管束分布,
其中, 外侧的维管束较小、排列较稀疏;中心部位散
生排列的维管束较大, 排列较紧密。
　　根状茎切片与显色剂作用 1～2 min以后, 其因
皂苷浓度和含量的不同而呈现浅红色到深红色的颜
色反应。
　　周皮及其以外的保护组织中无显色反应,说明
没有皂苷的积累。基本组织细胞中显示出含有皂苷
的红色液滴。在外围没有维管束分布的基本组织中,
细胞内含皂苷的液滴呈浅红色, 靠外侧的皂苷的液
滴较大,数量少,而靠近内侧的细胞中液滴大小不
一,但是数量多。在有维管束分布的基本组织中,小
维管束分布部位的基本组织细胞中皂苷的积累最丰
富,细胞中红色液滴数量最多, 大小不一, 最大的红
色液滴也分布在此部分。在有大维管束分布的基本
组织细胞中红色液滴相对较小,数量少,含皂苷的液
滴大多沿细胞壁分布。二年生根状茎皂苷的积累与
分布情况与一年生根状茎中皂苷的分布基本相同,
但是所含皂苷液滴的大小比一年生根状茎中的大而
且多,呈深红色。显示皂苷的积累与分布较一年生的
丰富。
　　以上结果表明,有小维管束分布的基本组织中
皂苷的积累最多, 其次是没有维管束分布的基本组
织,中心部位大维管束分布的基本组织最少; 二年生
根状茎中皂苷的积累比 1年生的根状茎的多。
　　组织化学研究结果初步表明了皂苷在根状茎内
的存在部位及其含量的丰富程度。为进一步证实上
述研究, 采用了高效液相色谱仪对根状茎中薯蓣皂
苷元的含量进行了测定。
2. 2　测定薯蓣皂苷元含量的高效液相色谱图: 见图1。
图 1　对照品( A) ,根状茎甲醇提取液(B) ,根状茎甲醇提取液水解后( C)的 HPLC 色谱图
Fig. 1　HPLC chromatograms of reference substance (A) , rhizome methanol extractive (B) ,
and rhizome methanol extractive after hydrolysis (C)
2. 3　不同性别、不同部位根状茎中薯蓣皂苷元含量
的差异: 在地上缠绕茎枯萎前期( 11月中旬) ,分别
取该种植物的雌株、雄株和雌雄同株由根茎营养繁
殖的 1年生根状茎。根状茎去掉外面的栓皮层后,将
无维管束分布的基本组织、有小维管束分布的基本
组织、中心部分有较大的维管束分布的基本组织 3
个部分分割后分别测定薯蓣皂苷元的含量。结果见
表 1。
表 1　不同性别、不同部位根状茎中薯蓣皂苷元的含量
Table 1　Diosgenin of rhizome in dif f erent part
of male, f emale, and monoecism
不同部位 无维管束分布区
NVB/ %
小维管束分布区
SVB/ %
大维管束分布区
BVB/ %
雌株　　 1. 87 1. 98 1. 80
雄株　　 2. 47 2. 85 2. 37
雌雄同株 2. 31 2. 57 2. 20
　　由表 1可以看出, 在雌株、雄株和雌雄同株,其
各自不同部位之间薯蓣皂苷元的含量有较明显的差
异。无论是雌株、雄株还是雌雄同株都以小维管束分
布的区域含量最高,其次是没有维管束分布的区域,
在根状茎中心部位有大维管束分布的区域薯蓣皂苷
元的含量最低。雌株、雄株和雌雄同株 3者的相同部
位之间,薯蓣皂苷元含量也有很明显的差异。无论是
在无维管束分布的区域、小维管束分布的区域还是
大维管束分布的区域,雌株与雄株之间的差异比较
大,雄株的含量较显著的高于雌株的含量。雌雄同株
根状茎 3个不同区域薯蓣皂苷元的含量在雌株和雄
株的之间, 但是其含量与雌株之间的差异较大而与
雄株之间的差异较小。
2. 4　不同生长期根状茎中薯蓣皂苷元含量的测定:
分别于盛花期( 6月下旬)、果期( 9月中旬)、枯萎前
期( 11月中旬)取 1年生和 2年生由根茎营养繁殖
的根状茎,其薯蓣皂苷元含量测定的结果见表 2。1
年生和 2年生根状茎薯蓣皂苷元含量的差异如图
2。结果表明, 2年生根状茎在盛花期薯蓣皂苷元的
含量最高,果期的含量低,在枯萎前期皂苷元的含量
又有回升。1年生根状茎薯蓣皂苷元的含量呈逐渐上
升的趋势, 枯萎前期含量最高。每个生长发育期, 2年
生根状茎薯蓣皂苷元的含量都比 1年生的含量高。
·564· 中草药　Chinese T raditional and Herbal D rug s　第 35 卷第 5 期 2004年 5月
表 2　1年生和 2年生根状茎薯蓣皂苷元的含量
Table 2　Diosgenin in annual and biennial rhizomes
样品采收期 根状茎薯蓣皂苷元含量/ %
1年生 2年生
盛花期　 1. 53 2. 88
果期　　 1. 76 2. 35
枯萎前期 2. 29 2. 68
图 2　1年生和 2年生根状茎薯蓣皂苷元含量的差异
Fig. 2　Dif ferences of diosgenin between annual
and biennial rhizomes
3　讨论
　　有关皂苷的组织化学研究, 一些学者曾报道过
人参、西洋参和绞股蓝人参皂苷在组织中的积累动
态[ 11 , 12] ,并根据其与显色剂反应产生颜色深浅的变
化来确定组织中人参皂苷含量的高低。笔者在对盾
叶薯蓣根状茎进行组织化学研究中发现有类似的结
果。关于皂苷的存在位置,西洋参根中人参皂苷主要
分布于周皮和韧皮部中,其中以分泌道内最多, 人参
根中人参皂苷不仅存在于韧皮部中,还存在于木质
部导管附近的薄壁细胞和木射线细胞中[ 11]。绞股蓝
中人参皂苷主要分布在营养器官的同化组织及韧皮
部薄壁细胞中 [ 12]。对盾叶薯蓣根状茎的组织化学研
究表明,薯蓣皂苷主要分布在基本组织薄壁细胞中,
又以有小维管束分布的基本组织中积累最多,其次
是无维管束分布的基本组织, 中心部位有大维管束
分布的基本组织最少。
　　通过 HPLC 法对根状茎中薯蓣皂苷元含量的
测定,进一步证实:有小维管束分布的区域薯蓣皂苷
元的含量最高,其次是没有维管束分布的区域, 中心
部位有大维管束分布的基本组织含量最低; 2年生
根状薯蓣皂苷元的含量高于 1年生的含量。所得结
果与组织化学研究的结果完全一致。同时发现不同
性别的植株之间薯蓣皂苷元含量的差异也是非常明
显的, 在基本组织的 3个不同的区域内雄株的含量
都较显著的高于雌株的含量, 而雌雄同株 3 个不同
的区域内薯蓣皂苷元的含量均在雄株和雌株之间。
其原因可能与开花结实有关。丁志遵等 [ 13]认为薯蓣
皂苷元的变化与地下根状茎营养物质的积累与消耗
有一定关系。雄株根状茎中薯蓣皂苷元含量高于雌
株, 很可能雄株开花所消耗的营养物质要比雌株开
花、结实所消耗的营养物质少,从而使二者薯蓣皂苷
元含量不同。
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