全 文 ：a low ering of c-M yc level could lead to apoptosis
by first deactiv ating the pro liferation path way
[ 12]
and preventing cell cycle pro g ression. Trea tments
that caused apoptotic death o f sev eral cel l types
had been shown to fi rst drastically low er c-Myc ex-
pression
[13, 14 ] .
While the accumula tion of sub-G1 cells and
apopto sis took place a fter 18 hours o f T HH trea t-
ment , c-M yc protein show ed a drastic decrease a f-
ter only a sho rt period of T HH trea tment (> 99%
decrease in 2— 4 hours) . This is consistent wi th
the cur rent thinking tha t c-M yc is one of the earli-
er signals in cell g row th regula tion. The above re-
sul ts show ed that THH ex tract ini tially caused a
decrease in c-M yc pro tein lev el in HL-60 cells, by
either transcriptiona l or t ranslational regula tion
mechanisms. Subsequent ly cellular metabo lism is
af fected
[7 ]
and cells stop at the hypodiploid sub-G1
pha se and eventually enter apopto sis.
　　Acknowledgement: This w ork is suppo rted by an Ap-
plied Resear ch Grant o f City Univ ersity of Hong Kong.
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用寡核苷酸芯片研究血虚小鼠造血相关细胞因子基因表达谱
佟　丽 1 ,陈苏红 1 ,马增春 1 ,黄　坚 2 ,丁　雨 2 ,王升启 1
( 1. 军事医学科学院放射医学研究所 全军生物芯片重点实验室 ,北京　 100850; 2. 深圳益生堂生物企业有限公司 ,广东 深圳
518026)
摘　要 :目的　应用细胞因子寡核苷酸表达谱芯片检测血虚小鼠不同脏器组织内造血相关细胞因子差异表达情
况 ,寻找差异表达基因 ,为血虚证治疗药物机制研究及治疗药物筛选奠定基础。方法　采用 5. 5 Gy60Co-γ射线照射
Ba lb /c小鼠 ,制备血虚模型。 在不同时间点提取正常和血虚小鼠不同组织总 RN A,反转录成不同荧光标记的
cDN A探针 ,与表达谱芯片进行杂交 ,对扫描数据进行分析获得血虚小鼠造血相关细胞因子基因的差异表达情况。
结果　在各组织中共发现 21个差异表达的基因。这些基因的功能大致分为 3类 :促细胞生长或增殖 ,免疫调节 ,诱
导血细胞形成或促造血祖细胞形成集落。结论　照射后上述细胞因子基因的下调 ,使机体的造血功能下降 ,造成血
虚 ,证明细胞因子间形成造血调节网络 ,整体调节机体造血。这与中医的全局理论是一致的。实验证明应用芯片技
·625·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 7期 2003年 7月
收稿日期: 2002-09-10基金项目:全军医药卫生科研基金课题 ( 01Z019) ; 北京市科委资助项目 ( H010210220113)作者简介:佟　丽 ( 1974— ) ,女 ,辽宁人 ,军事医学科学院放射医学研究所 2000级硕士研究生 ,研究方向为中药四物汤补血作用机制的基因组学研究。 　 E-mai l: t ongli29@ sina. com
* 通讯作者　 Tel, Fax: ( 010) 66932211　 E-m ail: s qw ang@ nic. bmi. ac. cn
术 ,从分子水平研究血虚形成的机制是可行的 ,可为进一步的血虚证治疗药物的筛选提供依据。
关键词: 细胞因子 ; 寡核苷酸芯片 ; 基因表达谱 ; 血虚
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 07 0625 05
Accessing gene expression profile of blood deficiency mice using
hematopoietic-related cytokine oligonucleotide microarrays
TONG Li
1 , CHEN Su-hong
1 , M A Zeng-chun
1 , HU ANG Jian
2 , DIN G Yu
2 , WANG Sheng-qi
1
( 1. Institute of Radiation Medicine, Academy of M illita ry Medica l Science, Beijing 100850, China;
2. Sh enzhen Yisheng tang Biolog ical Products Co. , L td, Sh enzhen 518026, China )
Abstract: Object　 To study the hema topoietic-rela ted genes dif ferential expression in blood deficiency
mice tissues using oligonucleo tide micro array in o rder to lay a fundation of inv estigating on the t rea tment
mechanism o f blood deficiency and screening the t reatment drug s. Methods　 Balb /c mice w ere i rradiated
w ith 5. 5 Gy
60
Co-γto make model of blo od deficiency in mice. The to tal RN As w ere isolated f rom dif ferent
tissues wi th Trizol reagent by one-step method at di fferent time, then reverse-transcribed into cDN A probe
w ith the inco rpo ra tion of fluo rescent dU T P. The mixed probe w as hybridized to the self-made microa r-
ray s, then scanned and analy zed wi th Bio-informa tion so f tw are. Results　 There w ere 21 hema topoietic-re-
lated genes expressed decreasing ly in all the detected tissues except spleen ir radia ted wi th
60
Co-γ. The
functions of a ll dif ferential expression genes were classified into three classes: prompting cell grow th o r
proliferation, regulating immunization, inducing the coloning of the hema topoietic progenitor cells. Con-
clusion　 The hematopoietic-rela ted genes which changed in blo od deficiency mice play impo rtant roles in a
netw o rk to regula te the hematopietic system. The netw ork-regulation ag ree w ith the “ whole theo ry” in
Chinese medica l science. The experiments have confi rmed that it i s po ssible to explo re the hematopoietic
mechanism at molecular level wi th the microarrays, and the further study can be carried out in this field.
Key words: cy tokine; oligonucleo tide micro array; gene expression profi le; blood deficiency
　　血虚是临床常见的症候 ,尤其是放化疗副反应
所致贫血、血虚是恶质病治疗所面临的最大障碍。对
其形成机制有很多的研究 ,但目前为止在基因水平
上尚无深入的研究。如果能够寻找到血虚证状态下
特定基因表达的改变 ,将从根本上阐明血虚证的形
成机制 ,并为其药物治疗提供靶标 ,为筛选治疗药物
提供理论基础。生物技术的发展 ,特别是基因芯片技
术的成熟与实际应用 ,使得基因水平上的研究成为
可能。 本实验设计并制备了造血相关寡核苷酸芯
片 [1 ] ,利用其快速、平行、高通量、相对准确的检测特
点 ,研究辐射致血虚小鼠不同组织造血相关基因表
达谱 ,探索分子水平上形成血虚的机制 ,为血虚证的
临床治疗提供相关的数据 ,同时为本课题的进一步
研究奠定基础。
1　材料与方法
1. 1　组织材料: Balb /c小鼠 40只 (购自军事医学
科学院动物中心 ) ,雌性 ,体重 16～ 20 g, 6～ 8周龄。
按体重随机分为两组:空白组 ( 10只 ) ,血虚模型组
( 30只 )。血虚模型组采用 5. 5 Gy 60 Co-γ射线照射。
照后不同时间点分批断颈处死小鼠 (每个时间点随
机取 10只 ) ,立即取胸腺、脾脏、肾脏等器官组织 ,
迅速液氮冻存备用。 骨髓有核细胞参照 Dex ter s[ 2]
方法制备并提取总 RNA。
1. 2　主要试剂及仪器: Trizo l试剂 ( Gibco BRL公
司 ) , RNasin 40 U /μL ( Gibco BRL公司 ) , Super-
scriptⅡ reverse t ranscripase ( 200 U /μL Gibco
RBL公司 ) , Cy3 /Cy5-dU TP ( 1 mmol /L, Amer-
sham Pha rmacia) ,阳性对照 pGL3 mRNA及芯片
由本实验室制备。 DU640核酸蛋白紫外分析仪
( Backman公司 ) , ScanArray 3000扫描仪 ( General
Scanning公司 ) , Imagine 4. 0分析软件 ( Bio-discov-
ery, Inc)。 60Co-γ射线照射由军事医学科学院 Co源
中心完成。
1. 3　寡核苷酸芯片的制备:从 Genebank中检索并
选取 74个造血相关的鼠源细胞因子基因的 mRNA
序列 ,用 Mprobe软件设计备选探针 ,长 40 mer。经
Blast分析从其中筛选出基因特异性寡核苷酸探针。
PE8909 DN A大规模合成仪合成 5′氨基修饰的寡
核苷酸探针。 3× SSC点样液溶解探针至浓度为 0. 5
μg /μL。 点样仪将探针点于本实验室自制的醛基化
基片上 ,放置过夜备用。
1. 4　荧光标记探针的制备: 按 Trizol试剂说明书
提取各脏器组织的总 RNA[ 3] , DU640紫外分析仪
测定纯度及浓度 ,甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析总
·626· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 7期 2003年 7月
RNA的完整性 [4 ]。取各组织总 RNA约 80μg置于
EP管中 ,分别加入阳性对照 pGL3 mRNA 0. 3μg
进行反转录 ,用 Cy3-dU TP标记空白组 cDN A,
Cy5-dU TP标记不同时间点模型组的 cDN A。取另
一组标本总 RNA进行反向的荧光标记 ,即 Cy3-
dU T P标记不同时间点模型组的 cDN A, Cy5-
dU T P标记空白组。如此实验重复两次。cDN A产物
溶于 2μL MiliQ水中备用。
1. 5　杂交:将已溶解的 cDN A探针与 6μL杂交液
充分混匀 , 96℃ 水浴变性 2 min后立即冰浴。将等
量的空白组 cDN A探针杂交液分别与不同时间点
血虚组 cDN A探针杂交液混合 ,均匀铺到芯片上 ,
用盖玻片封片 ,置于密封湿润的杂交仓中 , 42℃ 杂
交 3 h。杂交完毕 ,室温下分别用洗液 A ( 1× SSC,
0. 2% SDS) ,洗液 B ( 0. 2× SSC) ,洗液 C ( 0. 1×
SSC)梯度洗片 ,室温干燥。
1. 6　激光共聚焦扫描及结果分析: ScanArray 3000
扫描仪扫描芯片 , Imagine3. 0分析软件对扫描数据
进行定量分析。
2　实验结果
2. 1　总 RNA的纯度及完整性鉴定:紫外分析仪测
定总 RNA纯度在 1. 70～ 1. 85。甲醛变性 1% 琼脂
糖凝胶电泳显示总 RNA完整性较好 ,没有 DNA
污染 ,电泳图见图 1。
1-对照　 2-照后 2 h　 3-照后 6 h　 4-照后 12 h
1-blank cont rol　 2-2 h af ter irradiation
3-6 h af ter i rradiat ion　 4-12 h af ter i rradiation
图 1　小鼠总 RNA的甲醛变性电泳图 (骨髓 )
Fig. 1　 Agarose electrophoresis of total
RNA in mice ( bone marrow)
2. 2　表达谱芯片扫描结果: 杂交后的芯片用 Sca-
narray 3000扫描仪扫描。扫描获得的图谱显示照射
后随时间的延长 ,血虚组低表达基因逐渐增加。
2. 3　差异表达基因的筛选结果:应用 Imag ine 4. 0
分析软件筛选差异基因 ,标准是:①两种相互比较的
信号荧光强度值至少有一个大于 600,或者其中一
个约为 0,另一个信号值大于 1 000;②信号荧光强
度的比值大于 1. 5或小于 0. 66。进行信号归一化校
正的点为 pGL3及看家基因。分析过程仅以图 2为
例说明。图 2给出的是对照射后 6 h骨髓组织实验
结果进行差异分析的散点图。 图中对角线上及其附
近的点代表无差异表达的基因 ,左上方远离对角线
的点代表血虚组中表达下调的基因 ,右下方远离对
角线的点代表血虚组中表达上调的基因。图中实心
点代表差异表达基因。
图 2　辐照后 6 h基因表达谱分析散点图
(骨髓 , pGL3及看家基因校正 )
Fig. 2　 Scatter-plot of 6 h af ter irradiation ( bone
marrow , normalized by house-keeping
genes and positive control pGL3)
　　经分析比较发现 ,照射后血虚组不同脏器组织
中差异表达的基因共有 21个。各脏器中 GM-CSF,
G-CSF, SCF, EPO等因子基因表达量较高 ,但表达
没有差异。表 1～ 4中依次给出分析结果。
3　讨论
　　细胞因子是体内细胞相互作用的主要介质 ,在
免疫应答、造血等各个方面起着关键的作用 [5 ]。其异
常的增多、减少 ,异常的分布或细胞因子网络失衡常
常与疾病相关。实验结果显示 ,辐照后不同的时间点
各脏器组织血虚组均有表达下调的基因 ,这些差异
表达的细胞因子基因的功能大致分为 3类:促细胞
生长或增殖 ,免疫调节 ,诱导血细胞的形成或促造血
祖细胞的集落形成。他们的表达下调 ,使细胞因子间
形成的造血调节网络整体调节功能下降 ,造成血虚 ,
这与中医理论中的全局观念是一致的。
骨髓是生血、造血的主要器官 ,也是对辐照高度
的敏感的器官之一。辐射损伤造血干祖细胞的同时 ,
也破坏了造血细胞与其微环境之间的通讯。 实验中
检测到辐照后 2 h参与免疫应答的细胞因子基因
IL-2首先下调 , 6 h后间接促造血的 IL-4, LI-8R表
达下调 ,提示造血系统机能开始下降 ,到 12 h时 ,促
红细胞生成的 PDGF-R、促 GM-CSF生成的 IL-18
及主要造血因子 G-CSF本身均呈下调。同时参与信
号转导的一些细胞因子也下调 ,这些造血相关基因
·627·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 7期 2003年 7月
下调 ,并随时间延长呈增多的趋势 ,最终导致造血功
能下降 ,血液中血细胞减少 ,形成中医的血虚。 所获
得的差异表达基因 ,有可能是血虚形成机制中主要
节点或造血网络调控中的成员。
实验所选的其他脏器组织均有髓外造血的功
能 ,其造血相关细胞因子基因表达的改变反映机体
的造血功能的改变。脾脏组织在照射后 12 h发现一
个上调的基因 IL-12b,该因子具有直接促进骨髓干
细胞的增殖和形成集落作用。脾脏具有髓外造血功
能 ,当骨髓辐照后损伤较大 ,造血功能下降时 ,脾脏
将可能发挥其髓外造血的功能。 该细胞因子基因表
达的上调 ,是造血调控系统在脾脏的应激性反应 ,以
发挥其直接促进骨髓干细胞的增殖和形成集落作
用 ,维持机体造血功能。肾脏组织在辐照后 6 h出现
了大量的下调基因 ,需要注意的是 C-fo s, JUN两个
原癌基因表达的下调 ,他们均是在核中参与转录调
控的基因。由此推测血虚的形成可能是在基因的转
录过程中就已经开始了。 胸腺和脾脏辐照后 2, 6 h
未检测到差异表达的基因 ,可能是辐照后短时间内
的基因表达改变程度用芯片难以检测到所致 ,需要
进一步的实验验证。
实验表明细胞因子寡核苷酸表达谱芯片能够快
速平行检测因子基因表达情况 ,寻找到药物影响的
靶基因 ,可作为药物高通量筛选及药物作用机制研
究的技术平台。 同时所获得的阶段性结果为进一步
研究补血中药的作用机制及有效部位奠定基础。
表达谱芯片技术常用于定性检测 ,在定量检测
方面有一定的局限性 [6～ 8 ]。 实验中发现用单一的阳
性对照基因或内源性看家基因作为信号归一化校正
基因 ,对扫描数据进行定量分析时结果不一致。原因
表 1　 60Co-γ照射后小鼠骨髓中差异表达基因
Table 1　 Diff erent expression of genes in bone marrow of mice irradiated with 60Co-γ
组别 名称 基因库查询号 比值
(模型∶空白 ) 基因功能
2 h IL-2 M MIL04 0. 44∶ 1
0. 46∶ 1
在机体的免疫应答中起着重要的作用。
6 h AREG NM -009704 0. 57∶ 1
0. 51∶ 1
0. 47∶ 1
表皮生长因子家族成员 ,能刺激某些细胞的生长 ,也能抑制包括肿瘤细
胞的生长。 与 EGF竞争细胞表面受体而发挥作用。
IL-4 M US IL4CDAN 0. 42∶ 1
0. 41∶ 1
0. 47∶ 1
主要作用于 T细胞 ,能增强体液免疫 ,增强杀伤细胞的杀伤能力 ,增加造
血细胞的集落。
IL-8R MU SILK8 0. 58∶ 1
0. 46∶ 1
GT P结合蛋白相关受体超家族成员 ,几乎所有的细胞上都有该受体。
12 h AREG NM -009704 0. 35∶ 1
0. 50∶ 1
同上。
CD4 NM -013488 0. 25∶ 1
0. 65∶ 1
0. 53∶ 1
具有黏附功能 ,主要表现在 T细胞上 ,介导信号转导。
CDBb NM -009858 0. 62∶ 1
0. 51∶ 1
0. 31∶ 1
T细胞上主要的分化抗原 ,具有黏附和信号转导的功能。
G-C SF MU SGCSF 0. 56∶ 1
0. 45∶ 1
主要作用是促进骨髓造血细胞增殖分化形成粒细胞集落 ,诱导中性粒细
胞的终末分化和增强中性粒细胞的功能。
IL-18 M N-008360 0. 47∶ 1
0. 53∶ 1
主要功能是诱导 Th1细胞产生 IN F-γ,诱导 T细胞产生 GM-CSF,促进
T细胞增殖和增强 NK活性。
IL-2-R MU SIL2REC 0. 54∶ 1
0. 49∶ 1
由 3条链组成 ,α链是 IL-2特异的 ; β链属于造血因子受体家族 ;γ链与
IL-4, 7, 13等受体的γ链相同。可溶性 IL-2R作为免疫抑制剂。
PDGF-R NM -008808 0. 50∶ 1
0. 53∶ 1
间接促进红细胞的生成 ,能促进间叶来源的细胞分裂、生长 ,促 DN A合
成 ,诱导细胞分化。
表 2　 60Co-γ照射后小鼠胸腺中差异表达基因
Table 2　 Dif ferent expression of genes in thymus of mice irradiated with 60Co-γ
组别 名称 基因库查询号 比值
(模型∶空白 ) 基因功能
2 h 无
6 h 无
12 h IL-18 NM -008360 0. 63∶ 1
0. 61∶ 1
主要诱导 IN F-γ的产生 ,诱导 T细胞产生 GM-CSF,促进 T细胞的
增殖。
IL-2-R MU SIL2REC 0. 48∶ 1
0. 58∶ 1
IL -2受体。由 3条链组成 ,α链是 IL-2特异的 ;β链属于造血因子受体家
族 ;γ链与 IL-4, 7, 13等受体的γ链相同。 可溶性 IL-2R作为免疫抑
制剂。
·628· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 7期 2003年 7月
表 3　 60Co-γ照射后小鼠肾脏中差异表达基因
Table 3　 Dif ferent expression of genes in kidney of mice irradiated with 60Co-γ
组别 名称 基因库查询号 比值
(模型∶空白 ) 基因功能
2 h IL-12b NM -008352 0. 63∶ 1
0. 63∶ 1
有致炎和免疫调节作用。 可直接促进骨髓干细胞的增殖和形成集落 ,但
有 NK细胞存在时具有抑制骨髓造血、抗肿瘤的作用。
6 h β 2M NM -009735 0. 52∶ 1
0. 43∶ 1
是由人体淋巴细胞、单核细胞等合成的一种小分子量蛋白质 ,合成后作
为 HL A的轻链广泛存在于除红细胞和胎盘滋养层细胞以外的其他多
种细胞的细胞膜上。
C-FO S NM -010234 0. 57∶ 1
0. 20∶ 1
原癌基因 ,在细胞核中与多种基因转录调控有关。
EGF NM -010113 0. 63∶ 1
0. 48∶ 1
表皮生长因子。
FGF-R1 NM -010206 0. 40∶ 1
0. 34∶ 1
存在于 FGF敏感的细胞表面 , FGFR1具有酪氨激酶活性 ,属于 Ig受体
超家族。
HGF M USHGF1 0. 59∶ 1
0. 11∶ 1
与细胞表面的一种 c-met原癌基因产物 MET(该蛋白是受体的 β链 )结
合后诱导细胞产生一系列的反应。低浓度时有抑制某些肿瘤细胞生长
的作用。
IL-4 M US IL4CDN A 0. 35∶ 1
0. 23∶ 1
主要作用于 T细胞 ,能增强体液免疫 ,增强杀伤细胞的杀伤能力 ,增加造
血细胞的集落。
IL-9 NM -008363 0. 31∶ 1
0. 57∶ 1
Th 2细胞产生的细胞因子 ,主要促进胚胎细胞造血 ,诱导和维持肥大细
胞生长 ,诱导成熟 T细胞增殖。 IL-9有可能是正常造血的调节物。
LIF-R NM -993584 0. 61∶ 1
0. 28∶ 1
0. 32∶ 1
其α链上有造血因子受体结构域及 LIF结合部位。
M IP MMM IP 0. 63∶ 1
0. 50∶ 1
促进细胞的趋化 ,刺激肥大细胞和噬碱性细胞释放组织胺 ,是急性炎症
性肉芽肿介质 ,促进细胞黏附。
PDGF-R M M PDGFRE 0. 59∶ 1
0. 38∶ 1
间接促进红细胞的生成 ,能促进间叶来源的细胞分裂、生长 ,促 DN A合
成 ,诱导细胞分化。
12 h AREG NM -009704 0. 56∶ 1
0. 35∶ 1
0. 53∶ 1
表皮生长因子家族成员 ,能刺激某些细胞的生长 ,也能抑制包括肿瘤细
胞的生长。 其与 EGF竞争细胞表面受体而发挥作用。
C-FO S NM -010234 0. 65∶ 1
0. 66∶ 1
同上。
JUN NM -010591 0. 63∶ 1
0. 43∶ 1
0. 54∶ 1
核转录因子癌基因 ,其表达的蛋白与 DN A结合 ,参与多种基因的转录
调控。
V EGF NM -009505 0. 27∶ 1
0. 59∶ 1
能诱导血管生成 ,介导缺氧引起的血管形成。 血管内皮细胞对 V EGF有
高特异性增殖反应。
表 4　 60Co-γ照射后小鼠脾脏中差异表达基因
Table 4　 Dif ferent expression of genes in spleen of mice irradiated with 60Co-γ
组别 名称 基因库查询号 比值
(模型∶空白 ) 基因功能
2 h 无
6 h 无
12 h IL-12-b NM -008352 1. 51∶ 1
1. 57∶ 1
有致炎作用和免疫调节作用。 可直接促进骨髓干细胞的增殖和形成集
落 ,但有 NK细胞存在时具有抑制骨髓造血、抗肿瘤的作用。
可能是看家基因的表达有时也会发生变化 [7 ]。 为了
能够更好的定量 ,将外源定量加入的阳性对照基因
探针信号和内源细胞自主表达的看家基因探针信号
联合起来 ,作为信号校正基因。这样外源定量加入的
阳性对照既可监测整个反转录过程的质与量 ,又可
消减 cy3和 cy5荧光标记时掺入率的差别 ;而细胞
分泌的内源看家基因可综合监测总 RNA质与量等
不同方面的因素 ,提高芯片定量的相对准确性。
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·629·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 7期 2003年 7月