全 文 ：CEREALS AND OILS PROCESSING
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2009 年第 12 期
粮油加工
反应条件为 ： 二硫化碳用量 31．5％， 氢氧化钠用量
20％， 反应时间 2．5 h， 反应温度 35℃， 硫酸镁用量
20％， 各因素对试验指标影响的主次顺序为二硫化碳用
量、 反应温度、 反应时间、 NaOH用量。
（2） 随着二硫化碳用量、 氢氧化钠用量和反应时
间的增加， ISX 硫含量增加， 但硫含量达到一定值时，
再增加二硫化碳用量、 氢氧化钠用量和反应时间， ISX
硫含量增加缓慢； 升高温度有利于反应进行， 但因二
硫化碳的挥发性， 反应温度应低于 40℃； 硫酸镁用量
对 ISX硫含量影响不大。
参 考 文 献
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收稿日期： 2009－09－04
作者简介： 马冰洁 （1956—）， 女， 黑龙江人， 教授， 研究方向为天
然高分子表面改性、 精细化工产品开发。
通信地址： （110178） 沈阳经济技术开发区沈辽西路 111 号
利用全基因组芯片研究新型保鲜剂白鲜碱的抗真菌转录组学
杨 柳 1 王学林 2 于 录 2 金 晶 3 石建平 4 吴秀萍 2 邓旭明 3 郭 娜 3
（1．吉林工商学院 2．吉林大学人兽共患病研究所， 人兽共患病教育部重点试验室，
吉林大学畜牧兽医学院 3．吉林大学军需科技学院 4．吉林出入境检验检疫局）
【摘要】 白鲜碱， 一种从植物白鲜中分离的生物碱成分， 具有抗微生物的活性， 可作为天然
食品保鲜剂。 本试验应用寡核苷酸芯片从全基因组水平考察了白鲜碱对模式真菌酿酒酵母表达
谱的影响， 用聚类软件 T－profiler， 分析了基因芯片数据。 结果表明： 889 个基因差异表达 （表
达倍数≥2 倍）， 其中 511 个基因上调， 378 个基因下调。 一些主要的转录反应如 DNA 复制和重
组等相关基因受到白鲜碱的影响。
【关键词】 酿酒酵母； 白鲜碱； 寡核苷酸芯片； 转录
中图分类号： TS 255．3 文献标识码： A 文章编号： 1673-7199(2009)12-0134-04
新鲜果蔬采后腐烂是一个全球性的问题。 仅中国
易腐烂特色水果总产量达 1．16 亿 t， 采后损失 25％～
30％， 约 700亿元。 当前国内实际使用的主要食品防腐
剂有苯甲酸、 山梨酸及其盐类、 对羟基苯甲酸酯等，
这些防腐剂大多是化学合成的， 对人体健康有一定影
响。 以植物资源为原料的防腐保鲜材料的无化学毒害、
无残留、 无副作用等优点受到大众的认同与青睐。 中
药白鲜皮是芸香科植物白鲜的根皮， 其主要化学成分
为生物碱， 而白鲜碱为其重要活性成分。 具有抗微生
物的活性， 可作为天然食品保鲜剂， 但其作用机制报
道甚少。
基因芯片是 20 世纪 90 年代兴起的一项前沿生物
技术， 该技术以及相关基因转录组学研究大大促进了
生命科学的发展。 基因芯片技术解决了传统核酸印迹
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杂交等技术操作繁杂、 检测效率低等不足， 能够同时
平行地检测成千上万个基因的表达情况， 为现代医学
科学及医学诊断学的发展提供了强有力的工具。 基因
芯片技术的广泛应用将会使新基因的发现、 基因诊断、
药物筛选、 给药个性化等方面取得重大突破。
酿酒酵母作为一种模式真菌， 具有外界变化的适
应力强， 与高等生物的特性相似， 全基因组测序已经
完成， 70％的基因功能已知的优势， 是研究抗真菌药物
作用机制的理想模型。 本试验利用基因芯片技术从全
基因组水平考察了白鲜碱对模式真菌酿酒酵母的作用
机制， 为深入研究白鲜碱对其他致病真菌的作用途径
奠定了基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株
酿酒酵母 L1190， 由北京博奥基因芯片有限责任公
司张亮博士赠送。
1．1．2 主要试剂
YPD 培养基 （1％酵母提取物， 2％蛋白胨， 2％葡
萄糖）， 反转录酶， 订购于 Difco 公司； Taq polymerase，
订购于 Takara 公司； Tag DNA 聚合酶、 RNase H、 DNA
polymerase、 NTP Mix、 DTT、 dCTP， 订购于 Amersham
公司； RNA 纯化试剂盒， 订购于 MN 公司； Cy3 ／ Cy5
荧光标记试剂盒， 订购于 Invitrogen Bioprime公司。
1．1．3 主要仪器
DND–9052 型真菌杂交箱， 上海精宏试验设备有
限公司； CX－1000， 美国 UVP 紫外交联仪； LuxScanTM
扫描仪， 北京博奥。
1．2 方法
1．2．1 基因芯片的制备
7K Yeast Genome Array， 由北京博奥基因芯片有限
责任公司提供。
1．2．2 菌液样品制备及总 RNA抽提
将酿酒酵母 L1190 接种于 YPD 培养液中， 30℃，
200r ／min振荡培养活化， 使菌处于指数生长期。 取该菌
液至新的 YPD 培养液中继续培养至 OD600＝0．8。 100mL
上述菌液中加入白鲜碱， 使得药物浓度为 64μg ／mL， 空
白组加等量 DMSO。 试验组和空白组 DMSO含量均低于
0．5％。 菌悬液于 30℃， 200r ／min振荡培养 90min后， 离
心收集细胞。 采用热酸酚法抽提样品总 RNA。
1．2．3 RNA样品的线性扩增及标记
以 mRNA 为模板， 反转录合成 cDNA， 轻轻混匀，
浓缩至 16μL， 加入 4μL T7 10×Reaction buffer， 4μL T7
Enzyme Mix和 4μL NTP Mix， 轻轻混匀， 37℃反应 14h，
得到 cRNA， 反应完后在产物溶液中加入 60μL 无核酸
酶水， 纯化 cRNA。 取 cRNA 纯化产物 2μg， 调整体积
到 7．5μL， 加入 4μL Random Primer， 混匀 。 65℃反应
10min， 冰浴 5min， 加入 5μL 4 ×CbcScriptⅡ Buffer，
2μL 0．1M DTT和 1．5μL CbcScriptⅡ轻轻混匀。 25℃反应
10min， 37℃反应 1．5h。 反应结束后 ， 加入 Terminate
solution 5μL， 混匀。 65℃反应 10min， 冰浴 5min， 加入
Neutralize solution 1μL， 无核酸酶水 24μL， 混匀， 纯化
反转录得到的 DNA， 真空浓缩到 14μL， 加入 4μL
Random Primer， 混匀， 95℃反应 3min， 冰浴 5min， 加
入 5μL 5×Klenow Buffe， 1μL Cy3－dCTP 或 Cy5－dCTP
（药物处理组加入 Cy3－dCTP， 空白对照组加入 Cy5－
dCTP）， 1．2μL Klenow Fragment， 混匀。 37℃反应 1．5h，
70℃反应 5min， 冰浴 5min。 反应结束后， 加入无核酸
酶水 25μL， 纯化已标记好的 cDNA。
1．2．4 表达谱芯片的杂交与清洗
使用 60mm×24mm 盖片杂交。 将 80μL 杂交液， 转
移到 0．2mL 的离心管中， 短暂离心。 95℃热变性 3min，
冰浴骤冷 2～3min， 用于杂交。 将杂交液加至玻片的一
侧， 小心地将盖片从加有杂交液的一侧慢慢盖下， 避免
出现气泡。 快速把玻片放入杂交盒内， 盖紧杂交盒盖，
再将杂交盒放入芯片杂交仪中， 42℃， 杂交 12～14h。
杂交结束后， 先后在 42℃的洗液 I （2×SSC， 0．2％
SDS） 和洗液 II （0．2 × SSC） 中清洗芯片 4min。
1．2．5 芯片扫描及数据分析
LuxScanTM 10K－A 双通道激光共聚焦扫描仪扫描芯
片， 利用 LuxScan3．0提数后对芯片扫描结果进行 lowess
归一化处理， 计算归一化之后的荧光强度比值。 运用
T－profiler 软件， 对差异表达的基因 （表达倍数≥2） 的
基因进行功能分析。
2 结果
2．1 芯片杂交散点图
散点图可以比较直观地看出在两个样品之间基因
表达的差异情况。 由图 1 可知： 每一个数据点代表芯
片上一个基因点的杂交信号。 红色和绿色标记的数据
点分别表示 Y ／ X的 Ratio值≥2和≤0．5， 可能是属于表
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注： t－values ≥ 4 或≤ －4 表示差异显著。 t ＞ 0， 表示 motif
被诱导； t ＜ 0， 表示 motif 被抑制。
表 2 用 T－Profile 软件分析 motifs 结果
Motif Name t－value ORFs
TCCGYGGA PDR3 14．84 65
AAAATTT rRPE －12．01 1324
CGATGAG PAC －9．36 254
GGTGGCRA RPN4 5．72 92
YCCGSGGS Novel Filamenta 5．14 70
TATAWAW TBP 4．79 2936
TCGTTTA UPC2 4．20 258
HRCCCYTWDT MSN2 ／ 4 3．84 231
达有差异的基因， 黑色标记表示 Y ／X 的 Ratio 值在 0．5
和 2之间， 表达基本无差异。
2．2 表达谱芯片结果
白鲜碱处理酵母菌细胞后， 889 个基因差异表达
（表达倍数≥2 倍）， 其中 511 个基因上调， 378 个基因
下调 。 芯片结果已经上传 Gene Expression Omnibus
（GEO）， GEO 序列号为： GSE9817。 利用 T－profiler 软
件以芯片数据进行分析， 结果见表 1。 其中， 一些调控
基序 （motif） PDR3， rRPE， PAC， RPN4， Novel fila-
ment， TBP， UPC2和 MSN2 ／ 4变化明显 （见表 2）。
3 讨论
3．1 硫氨酸生物合基因的变化
软件分析表明： 硫氨酸生物合成途径中的一些相关
基因如： CBF1、 CYS4、 MET6、 STR3、 MET22、 MET2、
MET13、 MET28、 MET17基因表达倍数增高。 甲硫氨酸
生物合成途径和硫吸收的变化是代谢表型的主要转录标
志。 有关文献报道， 酵母细胞经 DMSO和单萜处理后也
有同白鲜碱处理后相似的基因表达变化。 这种基因变化
主要是由于麦角固醇生物合成途径中， ERG6 基因催化
的甲基化反应中甲基团的连续供应和该途径中三个连续
的甲基化反应激活了腺苷蛋氨酸生物合成。
3．2 DNA复制和重组的基因的变化
DNA 复制和重组的基因 ， 如 ： RAD51、 RAD52、
RAD54、 RAD55、 RAD57、 RAD59、 RDH54、 RFA1 也
被白鲜碱诱导高表达。 据文献报道， 白鲜碱是一种致
遗传改变的的突变剂， 在紫外照射下可引起丝状真菌
的致死性损伤。 另外， 白鲜碱 （3H 标记） 可损伤毛酶
属菌的 DNA。 本研究中， 腺嘌呤代谢途径被抑制， 该
途径包括一系列 ADE 基因 （ADE1、 ADE2、 ADE4、
ADE5， 7、 ADE6、 ADE8、 ADE12、 ADE13、 ADE16、
ADE17） 和 HPT1、 GUK1、 HPT1、 APT1）。 另外， 一些
ATP合酶基因同样受到抑制。
3．3 白鲜碱诱导的压力反应
T－Profiler 结果显示， 白鲜碱作用酿酒酵母后， 与
压力反应相关的一些基因的表达倍数发生明显的变化。
白鲜碱诱导的与压力相关的基因主要受 Msn2p 和
Msn4p转录因子的控制。 被白鲜碱抑制的基因主要包含
在 RNA 代谢和核糖体生物合成中， 表明白鲜碱作用酿
注： t－values ≥ 4 或≤ －4 表示差异显著。 t ＞ 0， 表示 category
被诱导； t ＜ 0， 表示 category 被抑制。
表 1 与白鲜碱作用相关的 GO数据库的 T－Profiler分析部分结果
Category t－value Mean ORFs
Sulfate assimilation 9．31 2．811 8
Cellular component unknown 6．90 0．185 826
Multidrug transporter activity 6．65 1．768 10
Endoplasmic reticulum 6．54 0．341 358
Response to stimulus 5．70 0．179 486
Sulfur amino acid biosynthesis 5．57 1．455 9
Vacuole 4．88 0．260 177
Peroxisome 4．43 0．419 55
Purine nucleotide metabolism －4．87 －0．526 45
Cytoplasm organization and biogenesis －5．04 －0．133 684
Thiamin metabolism －6．62 －1．122 19
Mitochondrion －9．05 －0．143 661
Protein biosynthesis －13．73 －0．409 452
Nucleolus －15．70 －0．812 192
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酒酵母后可导致细胞内基因转录活性的降低， 同时也
可导致包含 PAC （RNA polymerase A and C box） 和
rRPE （ribosomal RNA processing element） 基序的基因的
转录活性的降低。 以往研究表明， 核糖体基因的抑制
是环境压力反应 （environmental stress response， ESR）
的标志。 因为核糖体的产生是细胞的最多能量需求过
程之一。 核糖体生物的调控与周围环境的变化密切相
关。 在下调的核糖体基因中， 大多是编码线粒体核糖
体蛋白 （MRP） 的基因。 MRP 匮乏或钝化可导致线粒
体 DNA 的损耗。 线粒体核糖体蛋白合成的阻断会阻止
线粒体蛋白翻译， 导致线粒体功能丧志。 与以前的报
道相似， 经白鲜碱处理后， MRP基因也被明显的抑制。
3．4 白鲜碱诱导的脂质生物合成
真菌细胞膜上的固醇为麦角甾醇。 在麦角甾醇生
物合成途径中， 关键酶之一的 14α－去甲基酶 （14α－
demethylase， P45014DM） 是所有唑类药物共同作用的
靶位。 在甾醇水平上存在负反馈调控机制， 使用抑制
剂或使下游基因突变都能上调一些 ERG 基因的表达。
在氟康唑存在下， 作为弥补麦角甾醇耗竭的反馈机制
之一， 酵母样致病真菌白色念珠菌基因表达的上调，
可反馈性的补偿因药物作用而引起麦角甾醇含量减少。
本研究表明： 白鲜碱作用下基因 UPC2被诱导。 在酿酒
酵母中， UPC2 是麦角甾醇生物合成基因 （ERG） 的转
录激活子， 调控甾醇生物合成、 吸收和鞘脂生物合成。
我 们 发 现 一 些 ERG 基 因 ERG3、 ERG4、 ERG9、
ERG12、 ERG24、 ERG25、 ERG27 和 ERG28 表达倍数
分别上调了 2．93、 2．96、 2．13、 3．14、 2．01、 2．38、 2．94、
2．26 倍。 本研究芯片分析结果表明： 白鲜碱影响了酿
酒酵母脂质生物的合成， 尤其是细胞膜上的麦角甾醇
的生物合成。
本试验从全基因组水平揭示了白鲜碱对模式真菌
酿酒酵母表达谱的影响， 为白鲜碱作为保鲜剂的进一
步开发和利用奠定了重要的理论基础， 也为深入研究
白鲜碱对其他微生物的作用机制奠定了基础。
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本研究由国家重点基础研究发展计划 （973） （2006CB504402） 和国
家自然科学基金项目 （30871889） 资助。
收稿日期： 2009－09－21
作者简介： 杨柳 （1975—）， 女， 吉林松原人， 讲师， 硕士， 主要从
事食品工艺学、 食品微生物学研究。
通讯作者： 郭娜 （1980—）， 女， 山西太原人， 讲师， 博士， 主要从
事食品质量与安全研究。
通信地址： （130062） 长春市西安大路 4728 号
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