全 文 ：活血化瘀注射液2Ⅰ号对细胞因子体外诱发大鼠肺微血管内皮细胞
E2选择素、P2选择素及细胞间黏附分子21 表达的影响
张艳军1 ,赵连根2 ,吴咸中2 Ξ
(11 天津中医学院 中药系 ,天津 　300193 ; 21 天津市中西医结合急腹症研究所 ,天津 　300100)
　　近年研究证明血管内皮细胞表达的黏附分子在
炎症性疾病的发病过程中对白细胞与血管壁内皮细
胞黏附、经内皮迁移及向组织浸润起了关键作用。
内皮细胞黏附分子过度表达在多发性损伤、脓毒血
症及多脏器功能不全的发生发展中起重要作用。肺
损害在急性重症胰腺炎 (SAP) 时极为常见 ,在多器
官衰竭综合征 (MODS) 中 ,肺损害发生最早 ,多表
现为成人呼吸窘迫综合征 (ARDS) ,约 20 % SAP
病人并发 ARDS ,发病后一周内死亡的 SAP 病人约
60 % 与 ARDS 有关。本实验研究了细胞因子对肺
微血管内皮细胞黏附分子表达的影响 ,并观察了活
血化瘀注射液2Ⅰ号 ( HHI2Ⅰ) 的作用。
1 　材料与方法
111 　仪器与试剂 : TE300 倒置显微镜 ( Nikon) ,
CO2培养箱 (美国) ,全自动酶标仪 ( SL T Spectra Ⅲ
Tecan) 。DMEM/ F12培养基 ( Gibco) ;特优级胎牛血
清 ( Hiclon) ;胰蛋白酶 (Sigma) ;白细胞介素21 ( IL2
1) 、肿瘤坏死因子2α ( TNF2α) ,北京邦定生物医学公
司 ; P2选 择 素、E2选 择 素、细 胞 间 黏 附 分 子21
( ICAM21) 、山羊抗鼠多克隆抗体 ( Santa Cruz 公
司) ;辣根酶标记兔抗山羊 Ig G (Vector 公司) ;封闭
用兔血清工作液 (北京中山公司) ; 30 % 过氧化氢
(中国医学科学院血液病研究所科技公司) ;邻苯二
胺、聚山梨酯 20 ( Sigma) 。其他常用试剂均为国产
分析纯。HHI2Ⅰ由天津市南开医院药厂制备 ,主要
由桃仁、红花等组成 ,含生药 1 g/ mL 。复方丹参注
射液由上海第一生化制药公司生产 ,批号 971002。
112 　大鼠肺微血管内皮细胞的分离和培养 :参照文
献[1 ]方法 ,稍加改进。取体重约 150 g 的健康 Wis2
tar 大鼠 (军事医学科学院第四研究所) ,雌雄不限。
以 10 % 乌拉坦 ip 麻醉 (10 mL/ kg) ,同时 ip 肝素
钠 3 000 U。仰卧位固定 ,无菌条件下颈动脉放血
处死。打开胸腔 ,从右心灌注 D2Hanks 液至双肺发
白 ,取出肺脏置 D2Hanks 液中 (以下工作在超净工
作台内进行) 。充分冲洗肺脏 ,剥去脏层胸膜 ,切取
周边不含大中血管的肺组织 ,切割至约 1 mm3大小
的组织块 , D2Hanks 液洗涤 3～5 次 ,100 目滤过。
用吸管将肺组织块均匀种于 25 cm2塑料培养瓶 ,每
瓶 15～20 块。瓶底朝上 ,置 37 ℃、湿度 95 %～
100 %、5 % CO2培养箱内孵育 115～2 h ,小心加入
含 20 % 胎牛血清、100 U/ mL 青霉素、100μg/ mL
链霉素的 DMEM/ F12培养基 ,重置培养箱内静置培
养 ,60 h 后 ,弃组织块 ,继续培养。2～3 d 换液 1
次。第 2 ～ 3 周绝大部分细胞单层汇合时 , 用
0108 % 胰蛋白酶消化后按 1∶2 传代。第 3 代细胞
进行实验。
113 　大鼠外周血白细胞悬液的制备 :健康 Wistar
大鼠 ,无菌心脏取血至离心管中 ,肝素抗凝 ,按体积
比 1∶1 加入无菌 6 % 右旋糖苷 (Dextran500 , 相对
分子质量为 510 ×105) 生理盐水溶液 ,反复翻覆 40
次 ,使其混匀 ;将离心管静置于 37 ℃温箱内使其沉
降 ;10 min 后可见清晰分层 ,小心吸取上层富含白
细胞的上清液 ,其余部分继续沉降 ,出现清晰分层后
吸取上清液 ,如此沉降 115 h ,将富含白细胞的上清
液收集于离心管中 ,1 500 r/ min 离心 10 min ,弃上
清液 ;加 8 mL 冷三蒸水 ,轻轻混匀 ,低渗破坏红细
胞 ,1 min 后加入 2 mL 415 % 氯化钠溶液 ,轻轻摇
匀 ;以生理盐水洗 2 次 ,1 500 r/ min 离心 10 min ,用
含 20 % 胎牛血清的 DMEM/ F12培养基制成 1 ×
106/ mL 白细胞悬液 ,经常规台盼蓝染色检查活细
胞 > 95 %者备用。
114 　含药血清制备 :健康 Wistar 大鼠 6 只 ,体重
250～300 g ,雌雄不限。其中 3 只经颈静脉输入
3 % HHI2Ⅰ,3 mL/ h ,连续 3 h[2 ] 。另外 3 只经颈静
脉输入复方丹参注射液 ,3 mL/ h ,连续 3 h。停药
015 h ,心脏采血 ,制备血清 ,56 ℃灭活 015 h ,低温
冰箱保存备用。
115 　白细胞与内皮细胞黏附实验
11511 　分组 : TNF2α 组 , 培养基中加入 TNF2α
(1 000 U/ mL) ; TNF2α+ HHI2Ⅰ组 :培养基中加入
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Ξ 收稿日期 :2003211217
TNF2α 及 HHI2Ⅰ含药血清 (体积分数 10 %) ;
TNF2α + 丹参组 : 培养基中加入 TNF2α ( 1 000
U/ mL) 及复方丹参注射液含药血清 (体积分数
10 %) ; IL21β组 :培养基中加入 IL21β (100 U/ mL) ;
IL21β+ HHI2Ⅰ组 :培养基中加入 IL21β (100 U/ mL) 及
HHI2Ⅰ含药血清 (体积分数 10 %) ; IL21β+ 丹参组 :培
养中加入 IL21β (100 U/ mL) 及复方丹参注射液含药
血清 (体积分数 10 %) 。以上各组培养基中均含有
10 % 胎牛血清 , TNF2α组、IL21β组以不含药大鼠血
清调整血清体积分数 20 %。空白对照组 :培养基中
加入 10 % 不含药血清 ,10 % 胎牛血清。
11512 　黏附实验[1 ] :培养的肺微血管内皮细胞按
1 ×105/ mL 接种于 96 孔板 (100μL/ 孔) ,37 ℃、湿
度为 95 %～100 %、5 % CO2培养箱内培养至生长融
合 ,倾去培养基 ,分别按 11511 项分组处理 ,每组 6
个复孔 ,12 h 后倾去培养基 ,用 37 ℃预热的 D2
Hanks 液小心冲洗 2 次 ,以每孔 100μL 加入白细胞
悬液 ,置 37 ℃、湿度 95 %～100 %、5 % CO2培养箱
孵育 1 h ,小心吸出未结合的白细胞悬液 ,光镜下计
数 ,计算细胞黏附率 ,每个样本计数 3 次 ,取平均
值。
细胞黏附率 = (加入白细胞计数值 - 未黏附白细胞计数
值) / 加入白细胞计数值 ×100 %
116 　肺微血管内皮细胞黏附分子表达测定[3 ]
11611 　分组 :分组同 11511 项 ,每组又分 1、3、6、
12、24 h 亚组。
11612 　测定 :肺微血管内皮细胞按 1 ×105/ mL 接
种于 96 孔板 ( 100 μL/ 孔) , 37 ℃、湿度 95 %～
100 %、5 % CO2培养箱内培养至生长融合 ,倾去培养
基 ,分别按 11611 项分组处理 ,每亚组 18 个复孔。
在相应时间段结束后 ,用 p H 712 PBS 洗板 2 次 ,用
4 ℃冷丙酮固定 15 min ,用含 0105 % 聚山梨酯 20
的 PBS 洗板 3 次 , 3 % 兔血清封闭 30 min ,每孔
200μL ,洗板后分别加入抗 P2选择素、抗 E2选择素、
抗 ICAM21 抗体工作液 (1∶200 PBS 稀释) ,每孔
100μL ,37 ℃孵育 1 h ,洗板 3 次后加入辣根酶标
记兔抗山羊 Ig G (1∶500) ,每孔 100μL ,37 ℃孵育
1 h ,PBS 洗板 3 次 ,每孔加入 100μL 底物溶液 (含
邻苯二胺 400μg/ mL 、30 % H2O2 5μL ) 。37 ℃作
用 30 min ,每孔加入 1 mol/ L H2SO4 100μL 终止反
应 ,96 孔板在全自动酶标仪 492 nm 波长测吸光度
( A ) 值。
117 　统计 :数据均以 x ±s 表示 ,方差分析 , q 检
验。
2 　结果
211 　肺微血管内皮细胞的培养 :60 h 弃组织块时 ,
接种的肺组织块周围可见大量内皮细胞生长 ,2～3
周单层汇合。细胞主要呈多角形、短梭形 ,铺路石状
排列 ,分裂相细胞呈类圆形 ,单层贴壁生长 ,表现出
接触抑制现象 ,即细胞完全单层汇合后停止分裂。
内皮细胞特异性抗原 ( PECAM21) 染色 ,细胞胞浆
阳性着色。
212 　白细胞与内皮细胞黏附实验 :肺微血管内皮细
胞与含 TNF2α、IL21β的培养基共同孵育后 ,可显著
增加白细胞与内皮细胞的相互黏附作用 ,与正常对
照组相比差异显著 ( P < 0101) ;在培养基中加入
HHI2Ⅰ含药血清后 ,黏附率明显降低 ( P < 0101) ;
加入复方丹参注射液含药血清 ,黏附率亦降低 ( P
< 0101) ,但其作用不如 HHI2Ⅰ明显 ( P < 0101) 。
见表 1。
表 1 　白细胞与内皮细胞黏附率比较 ( x ±s , n = 6)
Table 1 　Comparision of adhesion rate betwen leukocyte
and endothelial cells ( x ±s , n = 6)
组 　别 　 黏附率/ % 组 　别 　 黏附率/ % 　
正常 12172 ±1191 IL21β 31189 ±4125 3 3
TNF2α 32153 ±3122 3 3 IL21β+ HHI2Ⅰ 18122 ±2166 3 3 △
TNF2α+ HHI2Ⅰ 17123 ±2148 3 △ IL21β+ 丹参 24140 ±2163 3 3 △▲
TNF2α+ 丹参 24181 ±2102 3 3 △▲
　　与正常对照组比较 : 3 P < 0105 　3 3 P < 0101 ; 与相应模型组
比较 : △P < 0101 ; 与 HHI2Ⅰ组比较 : ▲P < 0101
　　3 P < 0105 　3 3 P < 0101 vs normal control group ; △P < 0101 vs
corresponding model group ; ▲P < 0101 vs HHI2Ⅰgroup
213 　肺微血管内皮细胞黏附分子表达 : TNF2α、
IL21β刺激肺微血管内皮细胞 3 h 后 , ICAM21 便明
显增加 ,与正常对照组相比差异显著 ( P < 0101) ,
此后逐渐增强 ,12 h 达高峰 ,虽然 24 h 有所下降 ,但
仍维持较高水平。HHI2Ⅰ含药血清对 ICAM21 表
达增强有显著抑制作用 ,与相应模型组相比差异显
著 ( P < 0101) ,复方丹参注射液含药血清对 ICAM2
1 的增强表达也有一定抑制作用 ,但不如 HHI2Ⅰ
明显。见表 2。
TNF2α、IL21β刺激肺微血管内皮细胞 1 h 后 ,
E2选择素便明显增加 ,与正常对照组相比差异显著
( P < 0101) ,此后逐渐增强 ,3 h 达高峰 ,6 h 明显下
降 ,12 h 已接近基线水平。HHI2I 含药血清对 E2选
择素表达增强有显著抑制作用 ,与模型组相比差异
显著 ( P < 0101) ,复方丹参注射液含药血清对 E2选
择素的增强表达也有一定的抑制作用 ,但其作用远
不如 HHI2I 明显。见表 3。
TNF2α、IL21β刺激肺微血管内皮细胞 1 h 后 ,
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P2选择素便明显增加 ,与正常对照组相比差异显著
( P < 0105) ,此后逐渐增强 ,6～12 h 达高峰 ,24 h 明
显下降。HHI2I 含药血清对 P2选择素表达增强有
显著抑制作用 , 与模型组相比差异显著 ( P <
0101) ,复方丹参注射液含药血清对 P2选择素的增
强表达也有一定的抑制作用 ,但其作用远不如 HHI2
I 明显。见表 4。
表 2 　HHI2I 对 TNF2α和 IL21β刺激肺微血管内皮细胞表达 ICAM2I 的影响 ( x ±s , n = 18)
Table 2 　Effect of HHI2I on expression of ICAM21 in lung microvascular endothelial cells
in rats stimulated by TNF2αand IL21β ( x ±s , n = 18)
组　别
ICAM2I ( A )
1 h 3 h 6 h 12 h 24 h
正常 01210 ±01029 01212 ±01018 01207 ±01029 01205 ±01012 01217 ±01034
TNF2α 01263 ±01037 3 3 01369 ±01030 △3 3 01490 ±01027 △3 3 01624 ±01019 △3 3 01510 ±01022 △
TNF2α+ HHI2I 01217 ±01019 01269 ±01024 △▲ 01327 ±01018 △▲ 01413 ±01038 △▲ 01334 ±01030 △▲
TNF2α+ 丹参 01215 ±01021 01322 ±01013 △# ▲ 01404 ±01019 △# ▲ 01517 ±01050 △# ▲ 01433 ±01021 △# ▲
IL21β 01258 ±01022 3 3 01371 ±01027 △3 3 01502 ±01014 △3 3 01631 ±01024 △3 3 01492 ±01026 △
IL21β+ HHI2I 01220 ±01016 01265 ±01018 △▲ 01323 ±01009 △▲ 01401 ±01011 △▲ 01310 ±01026 △▲
IL21β+ 丹参 01220 ±01016 01324 ±01012 △# ▲ 01400 ±01013 △# ▲ 01507 ±01010 △# ▲ 01409 ±01018 △# ▲
　　　与正常组比较 : △P < 0101 ; 与相邻时间段比较 : 3 3 P < 0101 ; 与相应模型组比较 : ▲P < 0101 ; 与 HHI2I 组比较 : # P < 0101
　　　△P < 0101 vs normal group ; 3 3 P < 0101 vs closed2time period ; ▲P < 0101 vs corresponding model group ; # P < 0101 vs HHI2I group
表 3 　HHI2I 对 TNF2α和 IL21β刺激肺微血管内皮细胞表达 E2选择素的影响 ( x ±s , n = 18)
Table 3 　Effect of HHI2I on expression of E2selectin in lung microvascular endothelial cells
in rats stimulated by TNF2αand IL21β ( x ±s , n = 18)
组　别
E2选择素 ( A )
1 h 3 h 6 h 12 h 24 h
正常 01057 ±01028 01068 ±01018 01052 ±01029 01083 ±01012 01065 ±01034
TNF2α 01337 ±01032 3 3 01601 ±01014 △3 3 01303 ±01022 △ 01217 ±01050 △ 01215 ±01035 △
TNF2α+ HHI2I 01120 ±01018 ▲ 01237 ±01019 △▲ 01192 ±01021 △▲ 01142 ±01038 △▲ 01139 ±01029 △▲
TNF2α+ 丹参 01221 ±01022 # 01397 ±01022 △# ▲ 01253 ±01027 △# ▲ 01214 ±01017 △# 01209 ±01030 △#
IL21β 01334 ±01023 3 3 01613 ±01021 △3 3 01308 ±01024 △ 01212 ±01028 △3 3 01205 ±01044 △
IL21β+ HHI2I 01115 ±01015 ▲ 01218 ±01018 △▲ 01182 ±01038 △▲ 01133 ±01034 △▲ 01120 ±01039 △▲
IL21β+ 丹参 01212 ±01026 # 01414 ±01014 △# ▲ 01274 ±01024 △# ▲ 01210 ±01027 △# ▲ 01206 ±01024 △# ▲
　　　表注同表 2
　　　Notes are same to Table 2
表 4 　HHI2I 对 TNF2α和 IL21β刺激肺微血管内皮细胞表达 P2选择素的影响 ( x ±s , n = 18)
Table 4 　Effect of HHI2I on expression of P2selectin in lung microvascular endothelial cells
in rats stimulated by TNF2αand IL21β ( x ±s , n = 18)
组　别
P2选择素 ( A )
1 h 3 h 6 h 12 h 24 h
正常 01148 ±01030 01139 ±01018 01142 ±01025 01135 ±01019 01139 ±01036
TNF2α 01231 ±01021 3 3 01378 ±01014 △3 3 01504 ±01028 △ 01600 ±01022 △3 3 01445 ±01023 △
TNF2α+ HHI2I 01153 ±01018 ▲ 01186 ±01019 △▲ 01249 ±01026 △▲ 01331 ±01039 △▲ 01241 ±01022 △▲
TNF2α+ 丹参 01184 ±01024 # 01287 ±01018 △# ▲ 01392 ±01020 △# ▲ 01449 ±01019 △# ▲ 01337 ±01033 △# ▲
IL21β 01232 ±01020 3 3 △ 01392 ±01020 △3 3 01511 ±01025 △3 3 01620 ±01023 △3 3 01448 ±01018 △
IL21β+ HHI2I 01124 ±01010 ▲ 01208 ±01013 △▲ 01242 ±01028 △▲ 01326 ±01026 △▲ 01242 ±01023 △▲
IL21β+ 丹参 01157 ±01016 # 01285 ±01019 △# ▲ 01404 ±01017 △# ▲ 01419 ±01016 △# ▲ 01346 ±01023 △# ▲
　　　表注同表 2
　　　Notes are same to Table 2
3 　讨论
　　目前有关细胞因子对内皮细胞表达的黏附分子
的调控研究 ,绝大部分是在脐静脉等大血管内皮细
胞上进行[4 ] ,但由于白细胞2内皮细胞黏附主要发生
在微血管 ,而大血管内皮细胞与微血管内皮细胞在
生物学上及对各种物质的反应性均不同[5 ] ,培养人
脐静脉内皮细胞用于研究炎症介质及细胞因子对黏
附分子的调节 ,能否反映微血管内皮细胞对炎症介
质及细胞因子的反应特征 ,目前仍有争论[6～9 ] 。而
且不同部位微血管内皮细胞的生物学形状也不尽相
·819· 中草药 　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 35 卷第 8 期 2004 年 8 月
同 ,这就要求不同的研究目的 ,要选用比较合适的细
胞模型。
肺微血管内皮细胞的体外培养在技术上一直比
较困难。1995 年 Chen [1 ]等建立了肺周边组织块
法 ,用于培养肺微血管内皮细胞 ,不但大大地简化了
肺微血管内皮细胞的培养 ,而且避免了在细胞分离
过程中的机械或化学损伤 ,提高了培养成功率。本
实验对该方法稍加改进 ,大鼠处死后经右心用 D2
Hanks 液进行肺循环灌注 ,清除了肺循环中滞留的
血液 ,避免了培养过程中血细胞对内皮细胞的影响 ,
很大程度上提高了培养成功率 ;另外 ,增加了组织块
接种数 ,使获得的细胞数明显增加。
TNF2α、IL21β是 SAP 病理生理过程中的炎性
细胞因子 ,在 SAP 由局部损害向全身并发症进展过
程中起重要作用[10 ] 。TNF2α、IL21β作用机制之一
就是上调黏附分子的表达 ,从而促使白细胞2内皮细
胞黏附、跨内皮迁移 ,引起毛细血管通透性增加及组
织损害[11 ] 。
本实验动态观察了 TNF2α、IL21β对体外培养
大鼠肺微血管内皮细胞表达黏附分子的影响。结果
表明 , TNF2α、IL21β处理内皮细胞 ,显著增加白细胞2内皮细胞的黏附率 ,可以引起大鼠肺微血管内皮细
胞黏附分子表达的明显上调 ,该结果与 Shen[12 ]等
在体外培养人内皮细胞上发现的结果相一致。但
Guttorm 等 [13 ]以 TNF2α、IL21β刺激体外培养的人
肠微血管内皮细胞 ,发现 E2选择素可持续高表达很
长时间 ,特别是 IL21β刺激后 72 h 仍可检测到 E2选
择素的高水平表达 ,这可能是由于内皮细胞类型不
同的缘故。
HHI2I 是从治疗 SAP 有效方剂中的活血化瘀
中药中筛选出的疗效最好的重要制剂 ,研究已证明
HHI2I 能抑制 SAP 大鼠在肠系膜毛细血管后静脉
白细胞内皮细胞的过度黏附 ,减少白细胞在胰腺、肺
和小肠组织的募集 ,降低肺和小肠组织黏附分子的
上调[1～3 ] 。本实验结果表明 , HHI2 I能显著降低
TNF2α、IL21β引起的白细胞内皮细胞的过度黏附
率 ,抑制 TNF2α、IL21β引起的肺微血管内皮细胞表
达的黏附分子的上调 ,从细胞水平进一步证明了
HHI2I 在调控白细胞内皮细胞黏附中的作用。
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生骨灵颗粒促进骨折愈合的实验研究
叶日乔1 ,李 　茂2 ,韦宝伟2 Ξ
(11 广西中医学院瑞康医院 ,广西 南宁 　530011 ; 21 广西中医药研究所 ,广西 南宁 　530011)
　　生骨灵颗粒具有活血祛瘀、消肿止痛、强筋健骨 的功效 ,临床辅助治疗骨折疗效显著。为进一步研
·919·中草药 　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 35 卷第 8 期 2004 年 8 月
Ξ 收稿日期 :2003211219