全 文 ：·药理与临床·
冬凌草甲素对 Raj i 细胞的增殖抑制作用及其机制
刘加军1, 3, 潘祥林2, 伍新尧1, 王江峰1, 陆惠玲1, 林东军3, 黄仁魏3Ξ
(11 中山大学中山医学院 法医物证学实验室, 广东 广州　510080; 21 山东大学第二医院 血液肿瘤中心,
山东 济南　250033; 31 中山大学附属第三医院 血液科, 广东 广州　510630)
摘　要: 目的　探讨冬凌草甲素对 B 淋巴细胞白血病细胞株 R aji 细胞的增殖抑制作用及其机制。方法　以不同浓
度的冬凌草甲素作用于体外培养的 R aji 细胞,M T T 法检测细胞生长抑制率, 应用流式细胞仪、Hoech st 33258 荧
光染色法观察细胞凋亡, TRA P2PCR 2EL ISA 法检测细胞凋亡前后的端粒酶活性。结果　冬凌草甲素可显著降低
R aji 细胞的端粒酶活性, 抑制细胞的生长, 诱导细胞发生凋亡, 并呈现出明显的剂量2效应与时间2效应关系。结论　
冬凌草甲素对 B 淋巴细胞白血病具有明显的体外抗白血病作用, 降低细胞端粒酶活性, 诱导细胞发生凋亡, 可能是
其重要作用机制。
关键词: 冬凌草甲素; 白血病; 端粒酶; 细胞凋亡
中图分类号: R 73317; R 28515　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 07 0774 04
Inh ib itory effect and m echan ism of or idon in on Ra j i cells prol ifera tion
L IU J ia2jun1, 3, PAN X iang2lin2, W U X in2yao 1, W AN G J iang2feng1, LU H u i2ling1
L IN Dong2jun3, HUAN G R en2w ei33
(1. L abo rato ry of Fo rensic and B io logical Science, M edical Co llege of Sun Yat2sen U niversity, Guangzhou 510080, Ch ina;
2. Cen ter of H em ato logy and O nco logy, the Second Ho sp ita l of Shandong U niversity, J inan 250033, Ch ina; 3. D epartm ent
of H em ato logy, the T h ird A ffilia ted Ho sp ita l of Sun Yat2Sen U niversity, Guangzhou, 510630, Ch ina)
Abstract: Object 　 To invest iga te the inh ib ito ry effect of o ridon in on R aji cells (B lymphocyte
leukem ic stra in) and its m echan ism. M ethods　R aji cells in cu ltu re m edium in v itro w ere given differen t
concen tra t ion s of o ridon in. T he inh ib ito ry ra t io of the cells w as m easu red by M T T assay, apop to sis of
cells w as ob served by flow cytom etry (FCM ) and Hoech st 33258 fluo rescence sta in ing, and the act ivity of
telom erase w as detected u sing TRA P2PCR 2EL ISA befo re and after apop to sis occu rred. Results　O ridon in
cou ld decrease the act ivity of telom erase, as w ell as cau se apop to sis and inh ib it the grow th of R aji cells sig2
n if ican t ly. T he supp ression w as bo th in t im e2 and do se2dependen t m anner. Conclusion　O ridon in has an t i2
leukem ic eff icacy on B lymphocyte leukem ia in v itro very sign if ican t ly, inducing apop to sis and decreasing
the act ivity of telom erase m ay be mo st impo rtan t m echan ism.
Key words: o ridon in; leukem ia; telom erase; cell apop to sis
　　冬凌草甲素 (o ridon in ) 是从冬凌草中提取分
离的一种四环二萜类化合物, 已有大量资料证明, 冬
凌草甲素具有广泛的抗肿瘤作用。端粒酶是一种新
型的肿瘤标志物, 端粒酶的活化是肿瘤发生发展的
重要机制之一。在造血系统的恶性肿瘤中端粒酶活
性均显著增高, 其中以急性白血病细胞活性最高, 端
粒酶活性的变化已成为筛选抗肿瘤药物的重要标准
之一。冬凌草甲素对B 淋巴细胞白血病的作用机制
尚未见资料报道, 为了探讨冬凌草甲素对其作用机
制, 本实验以体外培养的B 淋巴细胞白血病细胞株
R aji 细胞为研究对象, 观察不同浓度冬凌草甲素对
R aji 细胞的生长抑制及诱导凋亡作用, 并检测细胞
端粒酶活性的变化, 旨在探讨冬凌草甲素的体外抗
白血病作用机制, 为冬凌草甲素进一步应用于临床
治疗白血病提供实验依据。
1　材料
111　细胞系: B 淋巴细胞白血病细胞株 R aji 细胞
购自上海第二医科大学瑞金医院血液学研究所。
·477· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 7 期 2004 年 7 月
Ξ 收稿日期: 2003209223
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (30100216)
作者简介: 刘加军 (1966—) , 男, 山东省日照市人, 主治医师, 讲师, 山东大学博士, 中山大学博士后, 主要从事血液肿瘤的分子生物学及
细胞凋亡机制等方面研究。　T el: (020) 87330557　E2m ail: liu jj@gzsum s. edu. cn3 通讯作者　
112　药物: 冬凌草甲素 (纯度> 95% ) 由山东大学
血液肿瘤中心潘祥林教授馈赠。
113　主要试剂: R PM I 1640 培养液: 美国 Gibco 公
司产品。小牛血清: 杭州四季青生物制品厂产品。
TRA P2PCR 2EL ISA 试剂盒: 由山东大学遗传学教研
室提供。Hoech st 33258 荧光染液: Sigm a 公司产品。
114　主要仪器: 超净工作台 (杭州产)、CO 2细胞培
养箱、普通及倒置显微镜 (日本O lympu s 产品)、平
板离心机 (国产)、96 孔培养板 (D eta, 美国)、FA C2
Scan 型流式细胞仪 (Becton D ick in son, 美国)、普
通及超低温水箱、电热恒温干燥箱、微量移液器等。
2　方法
211　细胞培养: 将 R aji 细胞接种于含 10% 灭活小
牛血清的 R PM I 1640 培养液中, 在 37 ℃、5% CO 2、
饱和湿度下培养, 每 2～ 3 d 换液 1 次, 取对数生长
期的细胞进行实验, 分别用各种浓度的冬凌草甲素
处理细胞, 未加药物组为对照组。
212　细胞生长抑制率的测定: 采用噻唑蓝 (M T T )
还原法进行检测。取对数生长期的 R aji 细胞, 调整
细胞浓度为 2×105ömL , 并分装于 25 mL 培养瓶
中, 每瓶 3 mL , 加入 215 mo löL 冬凌草甲素储存液
0、10、20、30 ΛL , 使冬凌草甲素的终浓度分别为 0、
8、16、24 Λmo löL。取 96 孔板数个, 每孔加入上述细
胞悬液 100 ΛL , 每种药物浓度设 6 个平行孔, 培养
不同的时间 (0、12、24、36、48、60、72 h) 后从培养箱
中取出, 每孔加入M T T (5 m gömL ) 10 ΛL , 再继续
培养 4～ 6 h 后取出, 离心后吸去上清液, 每孔加入
DM SO 100 ΛL , 振荡混匀 (约 5 m in) , 显微镜下观
察着色颗粒消失后, 在 20 m in 内以 570 nm 为检测
波长, 630 nm 为参考波长, 测定吸光度 (A ) 值, 计算
细胞生长抑制率。
细胞生长抑制率= (A 对照- A 实验) öA 对照
213　流式细胞仪检测细胞凋亡比例: 收集不同药物
浓度处理不同时间后的 R aji 细胞, PBS 缓冲液清洗
2 次, 将细胞沉淀充分混匀, 用 70% 冷乙醇 4 ℃ 固
定 24 h 以上。离心去除乙醇固定液, 用 PBS 清洗 1
次后, 加入 200 ΛgömL RNA 酶, 流式细胞仪分析不
同DNA 含量的细胞分布。应用M odifit L TL 1. 00
(M A C) 分析系统进行数据处理, 低于 G1期的细胞
(亚 G1期) 为凋亡细胞, 其占细胞总数的比例为凋
亡细胞比例。
214　细胞凋亡的形态学观察: 采用 Hoech st 33258
DNA 染色。收集不同浓度药物处理不同时间后的
R aji 细胞, 离心 (3 000 röm in, 3 m in) 后将细胞吹
打均匀, 涂片并干燥后, 用甲醛液 (40 göL ) 固定 10
m in, 用蒸馏水洗 2 次, 室温下晾干; 然后用Hoech st
33258 (5 m göL ) 染色 5 m in, 用蒸馏水洗 2 次, 室
温下晾干, 在荧光 (检测波长 360 nm , 参比波长 450
nm ) 显微镜下观察, 并随机拍照。
215　端粒酶活性的检测: 采用 TRA P2PCR 2EL ISA
法检测, 严格按试剂盒说明进行操作。具体步骤为:
(1) 提取端粒酶: 收集 1×106个不同浓度药物处理
后的细胞, 用 PBS 洗涤 2 次, 4 ℃、3 000×g 离心
10 m in 后弃上清液, 加入 200 ΛL CHA PS 裂解液,
冰浴 30 m in, 4 ℃、12 000×g 离心 20 m in 后取上
清液检测。 (2) R T 2PCR 扩增: 按试剂盒说明书进
行。取上述提取物 2 ΛL , 反应混合液 25 ΛL , 加入
D EPC 处理的无菌重蒸水至总体积 50 ΛL , 并按以
下步骤循环: 25 ℃、30 m in 循环 1 次, 94 ℃、5 m in
循环 1 次, 94 ℃、30 s, 50 ℃、30 s, 72 ℃、90 s, 循环
30 次, 再经 72 ℃、10 m in 后置 4 ℃ 保存。 (3)检测
扩增产物: 取扩增产物 5 ΛL 加入 20 ΛL 变性液中,
室温放置 10 m in, 再加入 225 ΛL 杂交混合液, 充分
混匀, 取 100 ΛL 加入亲和素包被的酶标板内, 37 ℃
振荡孵育 2 h, 加入抗 D IG POD 的抗体与之作用,
最后加入 POD 的底物 TM B 显色, 加入中止液中止
反应, 在自动酶标仪上测定 450 和 690 nm 波长处
的 A 值。以A = A 450- A 690表示端粒酶活性。
216　统计学处理: 数据以 x ±s 表示, 采用 SA S
6112 统计软件进行方差分析及组间比较。
3　结果
311　对 R aji 细胞生长抑制率的测定: 结果见图 1。
随冬凌草甲素浓度的增加及作用时间的延长, 细胞
生长抑制率逐渐升高, 3 种浓度的药物作用 60 h
后 , 细胞生长抑制率均在50% 以上, 与对照组 (冬
120 Λmo löL 　228 Λmo löL 　3216 Λmo löL 　4224 Λmo löL
图 1　冬凌草甲素引起的细胞生长抑制率
F ig. 1　Cell growth inh ibitory rate caused by or idon in
·577·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 7 期 2004 年 7 月
凌草甲素为 0 Λmo löL ) 相比差异均有显著性 (P <
0101) , 8、16 Λmo löL 冬凌草甲素引起的生长抑制率
差异无显著性 (P > 0105) , 24 Λmo löL 冬凌草甲素
作用 60 h 后引起的生长抑制率明显高于其他两种
浓度的药物 (P < 0105)。
312　细胞凋亡率检测: 结果见图 2。细胞凋亡率随
作用时间的延长而逐渐增加。3 种浓度的药物与对
照组比较均能明显诱导细胞凋亡 (P < 0101) , 16、24Λmo löL 冬凌草甲素引起的凋亡率之间差异无显著
性 (P > 0105) , 但均高于 8 Λmo löL 冬凌草甲素引
起的细胞凋亡率 (P < 0105)。药物作用 48～ 60 h 后
凋亡细胞数量达高峰, 但随之细胞凋亡率下降, 这可
能是细胞大部分死亡所致。
120 Λmo löL 　228 Λmo löL 　3216 Λmo löL 　4224 Λmo löL
图 2　冬凌草甲素引起的细胞凋亡率
F ig. 2　Cell apoptotic rate caused by or idon in
313　细胞形态学的变化: 3 种浓度冬凌草甲素处理
R aji 细胞后, 随药物作用时间的延长, 细胞的生长逐
渐受到抑制, 48 h 后生长抑制明显。在倒置显微镜
下可见, 部分细胞核内染色质浓缩成块状, 有些染色
质块聚集在核膜边缘或近贴核膜, 染色质逐渐发生
断裂, 部分核膜逐渐崩解, 染色质呈分叶状或形成粗
细不均匀的碎块并相互分离, 呈现出细胞凋亡的典
型变化。24 Λmo löL 冬凌草甲素处理 R aji 细胞 60 h
后, 细胞凋亡最为明显, 在 Hoech st 染色图片上可
见 70%～ 80% 的细胞发生凋亡的特征性改变。但
随后这种特征性变化又逐渐减少, 60 h 后在
Hoech st 染色下, 可见细胞核的荧光强度逐渐减弱。
各浓度药物作用于 R aji 细胞后均未见细胞的分化
现象。
314　对 R aji 细胞端粒酶活性的影响: 结果见图 3。
R aji 细胞的端粒酶活性较高, 3 种浓度药物作用
12 h 后, 细胞端粒酶活性均显著低于对照组 (P <
0101)。随药物浓度的增加和作用时间的延长, 端粒
酶活性逐渐下降, 并呈现出剂量2效应与时间2效应
关系, 在药物作用 72 h 后, 细胞的端粒酶活性几近
为零, 其中 24 Λmo löL 冬凌草甲素对端粒酶活性的
影响最为显著, 与其他两种浓度药物比较差异有显
著性 (P < 0105, 0101)。
120 Λmo löL 　228 Λmo löL 　3216 Λmo löL 　4224 Λmo löL
图 3　冬凌草甲素对细胞端粒酶活性的影响
F ig. 3　Effect of or idon in on cell telomerase activ ity
4　讨论
　　冬凌草甲素对 EA C、HA C、S180、P 388及 L 1210等
多种移植性肿瘤均具有明显的抑制作用, 其对实体
瘤的治疗目前已广泛应用于临床, 常用于食道癌、胃
癌等多种实体瘤的治疗, 并且均取得了明显的临床
疗效。研究表明冬凌草甲素的抗癌作用可能与降低
肿瘤细胞的钠泵转运活性、抗突变作用及增强其他
抗肿瘤药物的疗效有关[1～ 3 ]。
最近的研究表明冬凌草甲素对某些血液系统的
肿瘤细胞具有明显的生长抑制作用, 并能诱导细胞
发生凋亡[4, 5 ] , 但冬凌草甲素对 R aji 细胞的作用机
制尚未见报道。本实验结果表明, 冬凌草甲素能明显
抑制 R aji 细胞的生长, 诱导其发生凋亡, 与文献报
道一致[6, 7 ]。为了探讨冬凌草甲素对白血病细胞的生
长抑制及诱导凋亡机制, 本实验检测了细胞生长抑
制及发生凋亡过程中细胞端粒酶活性的变化。结果
表明, 该药能显著降低细胞端粒酶的活性, 且呈现出
一定的时间2效应与剂量2效应关系。
端粒酶 ( telom erase) 是一种特殊的核糖核蛋
白多聚酶, 由 RNA 和蛋白质构成, 其中 RNA 成分
是端粒合成的模板, 其蛋白质成分是一种逆转录酶,
因此, 端粒酶的活化可以弥补复制造成的端粒缩短。
端粒2端粒酶学说认为大多数的肿瘤细胞均有端粒
酶活性的显著升高, 肿瘤细胞在其复制过程中, 尽管
其端粒不断缩短, 甚至比相应的正常组织更短, 但由
于细胞在恶变过程中发生了端粒酶的再激活, 因此
仍表达端粒酶活性。由于持续存在高水平的端粒酶
活性, 细胞的端粒长度随着细胞的不断分裂仍保持
·677· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 7 期 2004 年 7 月
相对的稳定, 使得细胞成为一种“永生化”状态, 因
此, 端粒酶活性的增加与肿瘤的发生、发展密切相
关; 临床资料表明造血系统的恶性肿瘤普遍表现出
端粒酶活性增强[8 ] , 其中以急性白血病端粒酶活性
最强, 在白血病的不同阶段其端粒酶水平也不完全
一样, 端粒酶活性的高低与白血病的进展程度相一
致, 复发及难治性急性白血病的端粒酶水平明显高于
缓解及恶性程度较低的急性白血病, 端粒酶活性越高
的白血病患者其化疗效果及预后越差, 存活率也越
低。因此, 端粒酶活性的高低对于判断白血病的疗效、
恶性程度、预后及复发等均具有重要的临床意义。
端粒酶活性的变化与细胞凋亡的关系目前尚未
完全阐明。近期研究资料显示, 在细胞凋亡过程中,
端粒酶可能起重要的调节机制[9, 10 ] , 端粒酶活性下
降可以促进细胞的程序性死亡过程, 端粒酶活性抑
制剂可以增加急性白血病细胞的凋亡率, 而且可以
增加其他化疗药物的临床疗效,“抗端粒酶疗法”有
可能成为一种广泛的白血病治疗方法, 而且也是筛
选新型抗肿瘤药物的重要指标之一。本实验结果显
示, 冬凌草甲素可显著降低 R aji 细胞的端粒酶活
性, 抑制细胞的生长, 诱导细胞发生凋亡, 这可能是
冬凌草甲素体外抗白血病作用的重要机制之一。
References:
[ 1 ]　W u K M 1 Effect of o ridon in on the activity of tumo r cell
sodium pump [J ]1 Cancer R es P rev T rea t (肿瘤防治研究) ,
1994, 21 (4) : 20822091
[ 2 ]　Yang S L , H an S Y, Zhang Q , et a l. Study on the an tim u2
t ion of o ridon in [J ]1 Carcinog T era tog M u tag (癌变·畸
变·突变) , 2001, 13 (1) : 82101
[ 3 ]　Yang S L , Zhang Q , Song A Y, et a l. T he effect of o ridon in
on UD S in the p rim ary cells of the lung and liver in rat [J ]1
H enan M ed U niv (河南医科大学学报) , 2001, 36 (4) : 4152
4181
[ 4 ]　W ang J , L iu Q Y, H u H Y, et a l. O ridon in induces apop to2
sis in hum an leukem ia HL 260 cells [J ]1 Ch in P harm acol B u ll
(中国药理学通报) , 2001, 17 (4) : 40224041
[ 5 ]　L iu J J , W u X Y, Pan X L , et a l. M echan ism of o ridon in in2
duced apop to sis on NB4 cells [J ]1 Ch in T rad it P a t M ed (中
成药) , 2003, 25 (11) : 90029021
[ 6 ]　 Ikezoe T , Chen S S, Tong X J , et a l. O ridon in induces
grow th inh ib it ion and apop to sis of a variety of hum an cancer
cells [J ]1 In t J O ncol, 2003, 23 (4) : 1187211931
[ 7 ]　H an Q B, L iM L , L i S H , et a l. En t2kaurane diterpeno ids
from Isod on rubescens var. lushanensis [J ]1 Chem P harm
B u ll, 2003, 51 (7) : 79027931
[ 8 ]　O hyash ik i J H , Sash ida G, T auch i T 1T elom eres and telom 2
erase in hem ato logic neop lasia [J ]1 O ncog ene, 2002, 21 (4) :
68026871
[ 9 ]　Saretzk i G1 T elom erase inh ib it ion as cancer therapy [J ]1
Cancer L ett, 2003, 194 (2) : 20922191
[ 10 ]　N akajim a A , T auch i T , Sash ida G. T elom erase inh ib it ion
enhances apop to sis in hum an acu te leukem ia cells: po ssib ility
of an titelom erase therapy [J ]1 L eukem ia, 2003, 17 (3) : 5602
5671
Effects of crocetin on exper im en ta l a therosclerosis in rats
D EN G Yuan2x iong, Q IAN Zh i2yuΞ , TAN G Fu2t ian
(D epartm ent of Pharm aco logy, Ch ina Pharm aceu tical U niversity, N an jing 210009, Ch ina)
　　Abstract: Object　To study the effect of crocet in (CCT ) on experim en ta l a thero sclero t ic fo rm at ion in
ra ts. M ethods　A thero sclero t ic ra t models w ere rep lica ted by adm in ist ra t ion of excessive vitam in D 2
(VD 2) fo llow ed by feeding a h igh2cho lestero l d iet. T he b lood samp les w ere assayed fo r the con ten t of TC,
T G, LDL 2C, HDL 2C, M DA level, and the act ivity of SOD in serum. T he sect ion s of ao rt ia and liver w ere
exam ined. Results　H igh2and low 2do sages of CCT w ere found sign if ican t ly to reduce serum TC, LDL 2C,
and M DA level; and elevate serum HDL 2C level, SOD act ivity, and an t ia thero sclero t ic index (AA I) in
athero sclero t ic ra ts. T he h istopatho logica l ob servat ion of ao rt ic arch show ed the allevia t ion of a thero scle2
ro t ic dam age by CCT. Conclusion　CCT has obviou s an t ia thero sclero t ic effect in ra ts.
Key words: crocet in; an t ia thero sclero sis; b lood lip id; vitam in D 2 (VD 2)
西红花酸对大鼠实验性动脉粥样硬化的影响
邓远雄, 钱之玉3 , 唐富天
(中国药科大学 药理教研室, 江苏 南京　210009)
摘　要: 目的　研究西红花酸对大鼠实验性动脉粥样硬化的影响。方法　采用给予大剂量维生素D 2 (VD 2) 后饲喂
·777·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 7 期 2004 年 7 月
Ξ 收稿日期: 2003210210
作者简介: 邓远雄 (1968—) , 男, 湖南桂东人, 主管药师, 硕士研究生, 主要从事生化药理研究。　E2m ail: dengyx1968@ tom. com3 通讯作者　T el: (025) 83271322