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碱提山茱萸多糖的理化性质及抗氧化活性研究
李　平 ,王艳辉 ,马润宇
(北京化工大学 可控化学反应科学与技术基础教育部重点实验室 ,北京　 100029)
摘　要: 目的　研究碱提山茱萸多糖的单糖组成及抗氧化活性。方法　经热水抽提后的山茱萸残渣用碱提取、盐酸
中和、浓缩、透析、乙醇沉淀、 DEAE-纤维素柱色谱分离 ,再通过 Sephadex G-200柱色谱进一步纯化 ,得到白色粉末
状多糖 PFCCⅠ 。结果　该多糖经过完全酸水解、薄层色谱、红外光谱分析 ,证明 PFCCⅠ 由木糖和葡萄糖以 18. 8
∶ 81. 2摩尔比组成 ,平均相对分子质量为 7. 57× 104。 以羟基自由基 (· OH)清除剂苯甲酸和甘露醇为对照 ,用
Fenton反应检测 PFCCⅠ 对· O H的清除作用 ,三者对· O H的清除率达 50%所需浓度为 18, 330, 80μg /mL。
PFCCⅠ 可以有效抑制猪油和芝麻油的氧化 ,对 O÷2 的清除率达 50%所需浓度为 35. 0μg /m L。结论　该多糖为首
次提取制得 ,具有良好的抗油脂氧化及清除自由基能力。
关键词: 山茱萸 ;多糖 ;理化性质 ;抗氧化
中图分类号: R284. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 11 0973 04
Study on phys iochemical characteristic and antioxidation activity of polysaccharide
extracted with sodium hydroxide from fruit of Cornus off icinalis
LI Ping , WANG Yan-hui, MA Run-yu
( Key Labo ra tor y o f Science and Techno log y o f Contro llable Chemical Reactions, M inistry
o f Education, Beijing Univ er sity o f Chemica l Techno log y , Beijing 100029, China)
Abstract: Object　 To study the chemical composi tion and antioxidation activi ty of poly saccha ride
f rom the f rui t of Cornus of f icinal is Zieb. et Zucc. Methods　 The po lysaccharide PFCCⅠ was iso lated
f rom C . of f icinalis through NaOH ex traction, neutra l reaction, ethano l precipi tation and DEAE-cellulose
column chromato graphy. It was further purified by Sephadex G-200 co lumn chroma tog raphy. Results　
The molecular w eigh t of PFCC Ⅰ was 7. 57× 104 . Monosaccharide composi tion analy sis by T LC and
HPLC show ed that it was composed of x ylo se and g lucose in a molar ratio of 18. 8∶ 81. 2. PFCCⅠ had
st rong activi ties of oxidation resistance to axunge and gingi li. It also had an action to scavenging hydroxyl
f ree radical (· OH) generated by Fenton raction and supero xide anion f ree radical ( O÷2 ) g enerated by pyro-
ga llol autoxidation system. The scavenging activi ty to· OH and O÷2 was represented by the content scav-
enging 50% of all radicals o r anion ( Ec50 ) , w hich w ere 80μg /mL and 35. 0μg /mL respectiv ely. Conclu-
sion　 This po lysaccharide is iso lated f rom C. of f icinal is fo r the fi rst time, which could resist oxidation of
axunge and gingili and scavenge f ree radical ef fectiv ely.
Key words: Cornus of f icinalis Sieb. et Zucc. ; polysaccha ride; phy siochemical cha racteristic; antioxi-
da tion
　　山茱萸为山茱萸科植物山茱萸 Cornus of f ici- nal is Sieb. et Zucc. 的干燥成熟果肉 ,性平、味酸 ,
·973·中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 11期 2003年 11月
收稿日期: 2003-01-07作者简介:李　平 ( 1973- ) ,女 ,山东济南人 ,博士研究生 ,研究方向为生化分离与制药工程。
Tel: ( 010) 64433790　 E-mail: lpxa@ 163. com
* 通讯作者　 Tel: ( 010) 64433790　 Fax: ( 010) 64423610　 E-mail: r. ma@ mail. buct . ed u. cn
入肝、肾经 ,具有补肝肾、涩精气、固虚脱的功效 [1 ]。
山茱萸具有增强免疫系统功能 ,抗休克、降血糖、抗
癌、抗炎抑菌、利尿降压、抗氧化等作用 [2 ]。山茱萸除
被用于医药外 ,还用于制作保健食品、果酱、酒及饮
料 [3 ]。近年来关于山茱萸化学成分的研究报道较多 ,
但有关山茱萸多糖的研究报道较少。 本实验以四川
产山茱萸为原材料 ,对山茱萸水提取后的残渣用碱
提取 ,研究了碱提山茱萸多糖的理化特性和抗氧化
活性。
1　仪器、材料与试剂
722型可见光栅分光光度计 (北京光学仪器
厂 ) ; Cint ra 20紫外 -可见扫描仪 ( GBC- Aus) ; FT
- IR 170 SX红外光谱仪 ( Nicolet , U S) ;山茱萸购
自四川省绵阳市圣科天然药物研究所 ; DEAE-52
(Wha tman公司 ) ; Sephadex G-200( Pisca taw ay公
司 ) ;葡萄糖 ,阿拉伯糖、岩藻糖、木糖、半乳糖 (生化
试剂 , Sigma公司 ) ;番红 (生化试剂 , Sigma公司 ) ;
其他试剂均为国产分析纯。
2　实验方法
2. 1　多糖的提取、分离和纯化: 将已干燥的山茱萸
粉碎 ,依次过 40目、 40～ 60目和 60～ 80目筛。将筛
分后的山茱萸分别用 8～ 10倍体积的 95%乙醇回
流 8 h脱脂 ,降至室温 ,滤过 ,滤渣晾干即为多糖提
取的原料。预处理后的原料先用水提取制备水提多
糖 ,滤过 ,残渣晾干后用 4倍体积 2. 5 mo l /L NaOH
4℃提取 4 h,重复提取两次。 滤过 ,合并滤液 ,用 2
mol /L HCl中和滤液至中性 ,减压浓缩 ,浓缩液经过
醇沉、洗涤、真空干燥 ,得褐色山茱萸碱提粗多糖
( PFCC)。
取少量 PFCC溶于水 ,离心 ,上清液上 DEAE-
cellulo se柱 ( 2. 6 cm× 100 cm ) ,依次以 0, 0. 1, 0. 3,
0. 5, 1. 0, 2. 0 mol /L NaCl溶液洗脱 ,流速为 1 mL /
min。苯酚 -硫酸法跟踪检测 ,分部收集各高峰部分的
洗脱液 ,洗脱液经过减压浓缩、透析、醇沉、洗涤、真
空干燥 ,得白色山茱萸多糖。 将此多糖继续以
Sephadex G-200柱 ( 1. 5 cm× 70 cm )纯化后得到白
色山茱萸多糖 ( PFCCⅠ )。
2. 2　糖含量测定:苯酚-硫酸法测定糖含量 ,以葡萄
糖为对照品 ,校正系数取为 0. 9[4 ]。
2. 3　纯度及相对分子质量测定:将 PFCCⅠ纯品溶
于 0. 2 mo l /L NaCl溶液 ,上 Sephadex G-200柱
( 1. 5 cm× 70 cm ) , 0. 2 mol /L NaCl溶液洗脱 ,苯
酚 -硫酸法跟踪检测 ,绘制洗脱曲线。 将 5 mg Dex-
tran T-2000溶于 0. 2 mol /L NaCl溶液并定容至
5 mL,上 Sephadex G-200柱 ( 1. 5 cm× 70 cm) , 0. 2
mo l /L NaCl溶液洗脱 ,洗脱体积为 Ve;将 Dex tran
T-500, T-70, T-40, T-10, PFCCⅠ 以同样的方法上
Sephadex G-200柱 ,得到的洗脱体积分别为 V1。 根
据方程 V1 /Ve= K 1+ K 0 1 gMw 及各标准 Ex tran T
的相对分子质量计算 PFCCⅠ的相对分子质量。
2. 4　单糖组成分析:精确称取多糖样品 20 mg ,加
入 2 mol /L H2 SO4 2 mL, 110℃水解 8 h,用 BaCO3
中和水解液 ,离心 ,上清液浓缩至 20 mg /mL,备用。
用硅胶板对水解浓缩液进行薄层色谱分析 ,点样量
为 5μL,展开剂为醋酸乙酯-吡啶 -冰醋酸 -水 ( 5∶
5∶ 1∶ 3) ,苯胺 -邻苯二甲酸显色。 HPLC分析:色谱
柱: ZO RBAX NH2 Analytical column ( 5μm, 4. 6
mm× 150 mm) ,数据处理采用面积归一法 ,单糖对
照品溶液浓度 1 mg /mL,水解样浓度为 20 mg /mL,
进样量为 5μL,流动相为水 -乙腈 ( 22∶ 78) ,流速为
1 mL /min,柱温为 25℃。
2. 5　油脂过氧化值测定: 采用强化实验法进行
PFCCⅠ 对油脂的抗氧化性能研究。将样品置于 65
℃的恒温烘箱中 ,每隔一定时间取样检测其过氧化值
( POV )。 POV测定方法按 GB5009. 37-85标准执行。
2. 6　清除· OH实验方法 [5 ]: · OH由 EDTANa2-
Fe (Ⅱ ) -H2O2体系产生 ,由于· OH可特异地使番红
褪色 ,根据褪色程度用比色法来衡量· OH的含量。
反应体系中加入 pH7. 4的磷酸缓冲液 1. 0 mL,番红
溶液 ( 520μg /mL) 0. 2 m L, EDT ANa2-Fe (Ⅱ ) 1. 0
mL,再加入不同浓度的样品溶液 7. 0 mL,最后加入
6% H2O2 0. 8 m L,混合均匀后于 40℃水浴保温 30
min,在 520 nm波长处测吸光度 ( A )值。空白组以等
体积的重蒸水代替样品溶液 ;对照组以等体积的重蒸
水代替样品溶液和 EDTANa2 -Fe(Ⅱ )溶液。实验结
果以清除率 E表示: E= ( A样品 -A空白 )× 100 /( A对照 -
A空白 ) , E c50表示清除率为 50%时的样品浓度。
2. 7　清除 O÷2 实验方法 [6 ]: 先测定邻苯三酚自氧化
吸收光谱 ,确定自氧化速率最大值及最大吸收波长。
在此条件下测定加入样品后反应系统的吸收光谱。
各系统自氧化的速率为 S , S= △A /△ t ,清除率 E=
( S对照 - S样品 )× 100 /S对照。
3　结果与讨论
3. 1　分离纯化与组成分析: 粗多糖 PFCC用
DEAE-cellulose柱进行分离 ,用 0～ 2 mol /L NaCl
溶液洗脱得到 3种不同的组份 ,将主要组份经过
Sephadex G-200纯化后得到 PFCCⅠ 。
PFCCⅠ 经过 Sephadex G-200柱的洗脱曲线
·974· 中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 11期 2003年 11月
为单一对称峰 ,可知 PFCCⅠ为相对分子质量均一
的纯品。经凝胶渗透色谱分析 ,可知 PFCCⅠ的重均
相对分子质量为 7. 57× 104。
将 PFCCⅠ 水溶液在 200～ 400 nm波长进行
紫外光谱扫描 ,在 260 nm和 280 nm处未见吸收
峰 ,表明 PFCCⅠ中不含核酸和蛋白质。PFCCⅠ完
全酸水解后用 T LC和 HPLC分析其单糖组成。薄
层色谱图中出现木糖和葡萄糖的斑点 , HPLC色谱
图中出现与木糖 ( 3. 17 min)和葡萄糖 ( 3. 90 min)保
留时间相同的特征峰 ,二者的摩尔比为 18. 8∶
81. 2。
红外光谱检测结果表明: PFCCⅠ在 3 408 ( O-
H伸缩振动 )、 2 887( C-H伸缩振动 )、 1 642( C= O
伸缩振动 )、 1 371, 1 424( C-H变角振动 )及 1 022,
1 150 cm
- 1
( C- O伸缩振动 )处有多糖的特征吸收
峰。其中 1 022, 1 150 cm- 1的吸收峰提示葡萄糖残
基为吡喃型 , 890 cm- 1处的吸收峰为 β -端基差向异
构的 C-H变角振动。
3. 2　抗氧化性能研究
3. 2. 1　油脂的抗氧化性能:实验以抗氧化剂 VC及
TBHQ作为对比组 ,不加任何抗氧化剂的油脂作对
照组 ,研究了 PFCCⅠ对新鲜猪油和芝麻油的抗氧
化性能 ,实验结果见图 1、图 2。 由图 1, 2可知 ,在几
种抗氧化剂对新鲜猪油的抗氧化实验中 , TBHQ的
抗氧化能力最高 , PFCCⅠ 的抗氧化能力与 V C相
近 ;在对新鲜芝麻油的抗氧化实验中 , PFCCⅠ 与
TBHQ及 V C的抗氧化能力接近 ,说明 PFCCⅠ 可
以有效抑制植物油氧化。
时间 t /d
A-空白 ( cont rol)　 B-PFFCⅠ 　 C-V C　 D-TBHQ
图 1　不同抗氧化剂对猪油的抗氧化作用
Fig. 1　 Antioxidation to axunge by dif ferent antioxidants
3. 2. 2　清除自由基:实验研究了 PFCCⅠ 对油脂的
抗氧化性能后 ,又进行了多糖清除自由基实验。以甘
露醇和苯甲酸作对比 ,研究了 PFCCⅠ 清除羟基自
由基能力 ,实验结果见表 1。 由表 1可知 ,苯甲酸清
时间 t /d
A-空白 ( con trol )　 B-PFFCⅠ 　 C-VC　 D-TBHQ
图 2　不同抗氧化剂对芝麻油的抗氧化作用
Fig. 1　 Antioxidation to gingili by diff erent ant ioxidants
除羟基自由基的能力最强 , PFCCⅠ 清除羟基自由
基的能力比苯甲酸稍弱 ,比甘露醇强 ,三者达 50%
清除率所需浓度 (E c50 )分别为 18, 80, 330μg /mL。
以 V C作对比研究了 PFCCⅠ清除活性氧自由
基的能力 ,实验结果见表 2。由表 2可知 , PFCCⅠ 有
一定的清除 O÷2 的能力 ,但其清除能力比 V C稍弱 ,
二者达 50%清除率时所需浓度分别为 35. 0μg /mL
和 22. 7μg /mL。
表 1　不同抗氧化剂对· OH的清除作用
Table 1　 Scavenging ef fect to· OH
by diff erent antioxidants
抗氧化剂 浓度 /(μg· mL- 1 ) E /% Ec50 / (μg· mL- 1 )
甘露醇 　　　 200 43. 3
300 46. 9
400 55. 1 　　　 330
500 64. 0
600 66. 9
700 76. 0
苯甲酸 12. 5 43. 1
25. 0 58. 3
50. 0 68. 6 18. 0
75. 0 82. 3
PFCCⅠ 12. 5 23. 0
25 26. 7
50 38. 0 80
75 48. 0
100 60. 1
12. 5 71. 9
表 2　不同抗氧化剂对 O÷2 的清除作用
Table 2　 Scavenging ef fect to O÷2
by diff erent ant ioxidants
抗氧化剂 浓度 /(μg· mL- 1 ) E /% EC50 / (μg· mL- 1)
VC 20 43. 7
30 67. 1 22. 7
50 82. 1
60 82. 6
PFCCⅠ 25 38. 1
50 68. 0 35. 0
·975·中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 11期 2003年 11月
4　结论
研究表明 ,碱提山茱萸多糖 PFCCⅠ 是由木糖
和葡萄糖以 18. 8∶ 81. 2的摩尔比聚合而成的杂多
糖 ,其水溶性较好。对油脂抗氧化性能实验表明 ,该
多糖具有较好的抗氧化能力 ,是一种较好的天然抗
氧化剂: 对猪油的抗氧化能力接近于 V C,稍弱于
TBHQ;对植物油的抗氧化能力与 V C及 TBHQ接
近。以· OH清除剂苯甲酸和甘露醇为对照 ,用 Fen-
ton反应检测 PFCCⅠ对· OH的清除作用 ,三者对
· OH的清除率达 50%所需浓度为 18, 330, 80μg /
m L,说明该多糖对 Fenton体系产生的羟基自由基
有较强的清除作用 ; PFCCⅠ 对邻苯三酚体系产生
的 O÷2 有一定的清除作用 ,但清除率低于相同条件
下 V C对超氧阴离了自由基的清除率 ,二者达 50%
清除率所需浓度分别为 35. 0μg /mL和 22. 7μg /
mL。
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长柄梭罗细胞毒活性部位的化学成分研究
朱　慧 1 ,屠鹏飞 1* ,陈　琪 2 ,徐安龙 2
( 1. 北京大学药学院中医药现代研究中心 ,北京　 100083;　 2. 中山大学生命科学院 ,广东 广州　 510275)
摘　要: 目的　对长柄梭罗 Reevesia longipetiolata树皮具细胞毒活性的醋酸乙酯部分化学成分进行研究。 方法　
采用常压、加压硅胶柱色谱、 Sephadex LH-20凝胶柱色谱、高效液相色谱进行分离和纯化 ,通过理化和波谱分析方
法鉴定化合物结构。结果　从其醋酸乙酯部分分离得到 5个化合物 ,分别鉴定为 β -谷甾醇 (β -sito stero l,Ⅰ )、胡萝卜
苷 ( daucoster ol,Ⅱ )、白桦脂酸 ( betulinic acid,Ⅲ )、羽扇豆醇 ( lupeol,Ⅳ )和 (+ ) -儿茶素 [(+ ) -catechin,Ⅴ ]。结论　
5个化合物均为首次从该属植物中分得 ,并分别讨论了它们的细胞毒活性。
关键词: 长柄梭罗 ;细胞毒 ;化学成分
中图分类号: R284. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 10 0976 03
Studies on chemical constituents of cytotoxicity portion in bark of Reeves ia longipet iolat
ZHU Hui
1 , T U Peng-fei
1 , CHEN Qi
2 , XU An-long
2
( 1. School of Pharmaceutical Sciences, Modern Resea rch Center o f TCM , Peking Univ er sity , Beijing 100083, China;
2. Schoo l o f Life Science, Sun Yat-sen Univ er sity , Guang zhou 510275, China )
Abstract: Object　 To study the chemical consti tuents of cy to tox icity portion in the bark of Reevesia
longipetiolata Mer r. et Chun. Methods　 The consti tuents w ere iso la ted and purified by various chro-
ma tog raphic methods, such as gel column chroma tog raphy under no rmal pressure and increased pressure,
Sephadex LH-20 column ch romatog raphy and HPLC, and the st ructures w ere identified by phy sicochemi-
cal properties and spect ral analysis. Results　 Five compounds w ere obtained in the ethyl aceta te f ractions
and identified as β -si tostero l (Ⅰ ) , daucosterol (Ⅱ ) , betulinic acid (Ⅲ ) , lupeol (Ⅳ ) and (+ ) -ca techin
(Ⅴ ) . Conclusion　 All above compounds are obtained from the plants o f Reevesia Lindl. fo r the fi rst time,
and thei r cy to toxicity is discussed.
Key words: Reevesia longipetiolata Merr, et Chun; cytotoxici ty; chemical consti tuent
·976· 中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 11期 2003年 11月
收稿日期: 2002-10-24
* 通讯作者　 Tel: ( 010) 82802750　 E-mai l: pengfei tu@ bim u. edu. cn