全 文 ：乌苏里藜芦碱对大鼠脑缺血2再灌注损伤的保护作用
由广旭1 ,周 　琴1 ,李卫平1 Ξ ,韩国柱1 ,赵伟杰2
(11 大连医科大学基础医学院 药理教研室 ,辽宁 大连 　116027 ; 21 大连理工大学 化学制药系 ,辽宁 大连 　116027)
摘 　要 :目的 　研究乌苏里藜芦碱 (VnA) 对大鼠局灶性脑缺血2再灌注损伤的保护作用及可能机制。方法 　采用
线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞 (MCAO) 模型 ,缺血 90 min 后再灌注 24 h ,观察 VnA 对大鼠神经行为、脑梗死灶
大小、相关脑区组织病理学改变、细胞间黏附分子 ( ICAM21) 和神经元型一氧化氮合酶 (nNOS) 阳性细胞表达的
影响。结果 　与对照组相比 ,VnA 各给药组均能显著改善大鼠神经功能障碍 ,降低行为评分 ,并降低相关脑区神经
元损伤程度 ;并能显著降低缺血2再灌注后大鼠脑梗死面积 ,20、40μg/ kg VnA 分别使脑梗死面积降低 3413 % ( P
< 0105) 和 6116 % ( P < 0101) 。VnA 可显著抑制大鼠局灶性脑缺血2再灌注区 ICAM21 表达 ,但对 nNOS 表达无
明显影响。结论 　VnA 对大鼠局灶性脑缺血2再灌注损伤有保护作用 ,其保护作用与降低损伤区 ICAM21 有关。
关键词 :乌苏里藜芦碱 ; 脑缺血2再灌注 ; 细胞间黏附分子21 ; 神经元型一氧化氮合酶
中图分类号 :R28515 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 2670 (2004) 08 0908 04
Neuroprotection of Verat rum nigrum var. ussurience alkaloids
on focal cerebral ischemia2reperfusion injury in rats
YOU Guang2xu1 , ZHOU Qin1 , L I Wei2ping1 , HAN Guo2zhu1 , ZHAO Wei2jie2
(11Department of Pharmacology , College of Basic Medicine , Dalian Medical University , Dalian 116027 , China ;
2. Department of Chemical Pharmaceutical , Dalian University of Technology , Dalian 116027 , China)
Key words : V erat rum nigrum L . var. ussurience Nakai alkaloids (VnA) ; cerebral ischemia2reperfusion
(CIR) ; intercelular adhesion molecule21 ( ICAM21) ; nit ric oxide synthase (nNOS)
　　藜芦系百合科多年生草本植物藜芦 V erat rum
nigrum L . 的根及根茎。始载于《神农本草经》,有
涌吐风痰作用。“藜芦可用于治疗中风失语、黄疸、
疥疸”(《中药大辞典》) ,提示其有抗脑缺血作用。本
实验采用的是从千山乌苏里藜芦 V . nigrum L .
var. ussuriens Nakai 根中提取的乌苏里藜芦碱
( V . nigrum L . var. ussuriense Nakai alkaloids ,
VnA) 。经色谱等现代分析技术证明 ,该总碱中至少
含有 11 种酯型异甾体生物碱[1 ] 。现代研究证实本
品具有降压和抗血栓作用[1～3 ] ,本实验室曾发现其
对永久性全脑和局灶性缺血性脑损伤具有保护作
用[4 ] ,本研究旨在进一步探讨其对局灶性脑缺血2再
灌注损伤的保护作用及可能机制。
1 　材料
111 　药品和试剂 :盐酸乌苏里藜芦碱注射液 (100
μg/ mL) , 大连医药科学研究所植化室 , 批号
950613 ,用前以生理盐水稀释成所需浓度 ;红四氮唑
( TTC) ,上海试剂三厂 (化学纯) ; SABC 试剂盒 ,武
汉博士德试剂公司。
112 　仪器 : SXP —1 手术显微镜 ,上海医用光学仪
器厂 ;显微镜 ,日本 OL YMPUS 公司 ; HPIAS —1000
高清晰度彩色病理图文分析系统 ,同济医科大学千
屏影像工程公司 ; MA240D 电子天平 ,上海第二天
平仪器厂 ;小型三用水箱 ,北京医疗设备总厂。
2 　方法
211 　动物及分组 :雄性 SD 大鼠 ,体重 280～320 g
(大连医科大学实验动物中心提供) 。随机分为 4
组 :模型 + NS 组、模型 + VnA ( 20μg/ kg) 组、模
型 + VnA (40μg/ kg) 组、假手术组。
212 　对大鼠局灶性脑缺血2再灌注损伤的影响
21211 　大鼠局灶性脑缺血2再灌注模型的制备 : ①
线栓制备 :单股尼龙线 (日本) 直径 0126 mm ,头端
5 mm 均匀涂以硅树脂 ,加工后直径为 0140 mm ,光
镜下见表面光滑。在距起始端 1810 mm 处作标志 ,
酒精清洁后置生理盐水中备用。②取 SD 大鼠 ,
12 % 水合氯醛 360 mg/ kg , ip 麻醉 ,无菌条件下 ,参
考 Koizumi 方法 [5 ]将线栓经颈外动脉插入颈内动脉
行大脑中动脉栓塞 ,造成局灶性缺血。缺血 115 h
·809· 中草药 　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 35 卷第 8 期 2004 年 8 月
Ξ 收稿日期 :2003212203
作者简介 :由广旭 (1972 —) ,男 ,辽宁省海城人 ,医学硕士 ,主治医师 ,现于沈阳军区大连第一疗养院工作 ,主要从事脑血管病康复医疗及
研究。3 通讯作者　
后将插线退出至颈外动脉残端 ,进行再灌注。假手
术组除不插线栓外 ,其余操作同其他组。术中以灯
照保持动物体温恒定 ,控制室温恒定在 25 ℃。③
模型成功标准 :动物苏醒后出现线栓同侧 Horner 征
和线栓对侧肢体瘫痪 ,表现为左前肢不能伸出、行走
时向左侧倾倒或按逆时针方向旋转。
21212 　给药方法 :各组均于再灌注时尾 iv 相应剂
量的药物 ,6 h 后重复给药 1 次。
21213 　神经行为指标评定 :参考文献方法[6 ] ,大鼠
于再灌注 4 h 及 24 h 各评分 1 次 ,评分标准 : ①提
鼠尾悬空时 ,左肩内旋 ,左前肢内收 ,屈曲 ,依程度轻
重评 1～4 分 ; ②将大鼠置于光滑地面 ,推双侧前
肩 ,右肩阻力下降评 1～3 分 ; ③提鼠尾 ,使其两前
爪抓金属网 ,判断左前肢肌张力下降程度评 1～3
分。满分为 10 分 ,为避免主观操作的干扰 ,采用单
盲法。
21214 　梗死面积测定 :于再灌注 24 h 断头处死 ,迅
速取脑 ,去嗅球、小脑及低位脑干 ,按照解剖位置切
成厚约 2 mm 的脑片 ,切点依次为 :前脑最前端与视
交叉的边线中点处 ;视交叉处 ;漏斗柄处 ;漏斗柄与
枕叶尾端中点处。将脑片置于 1 % TTC 染色 ,正常
组织染成玫瑰红色 ,梗死组织为白色。用图像分析
系统统计梗死区及全脑区面积 ,计算梗死面积百分
比。
21215 　病理改变 :取上述第 3 片脑片做病理切片 ,
常规石蜡包埋 ,切片 (厚约 5μm) HE 染色 ,在光学
显微镜下 ,观察缺血区及缺血周边区病理改变 ,相邻
切片用于免疫组化染色。
21216 　统计方法 :实验数据用 x ±s 表示 ,采用
SPSS1010 统计软件包 One2Way ANOVA 法检验 ,
组间用 L SD 法两两比较。
213 　对局灶性脑缺血2再灌注损伤区细胞间黏附分
子 ( ICAM21) 及神经元型一氧化氮合酶 ( nNOS)
表达的影响
21311 　免疫组织化学染色 :取上述第 3 片脑片切
片 ,参照武汉博士德试剂公司说明书操作 ,进行免疫
组化的 SABC 法染色。
21312 　指标观察及统计方法 :在光镜 (10 ×10)
下 ,以阳性染色的单个神经细胞为一个阳性标记 ,每
例观察 1 张切片 ,于右侧纹状体及其周围皮质区随
机选取 5 个相互非重叠视野进行观察 ,进行定量图
像分析 ,测出每平方毫米组织切片的阳性神经细胞
数 ,数据以 x ±s 表示 , SPSS1010 统计软件进行 t
检验。
3 　结果
311 　对大鼠局灶性脑缺血2再灌注损伤的影响
31111 　对局灶性脑缺血2再灌注大鼠行为指标的影
响 :于再灌注 4 h 及 24 h 各评分 1 次 ,除假手术组
外 ,其余各组均出现不同程度神经功能障碍。24 h
时症状较 4 h 时有所减轻。与模型 + NS 组相比 ,模
型 + VnA 组均能显著改善大鼠神经功能障碍 ( P <
0105 ,0101) ,两剂量组之间差异无显著性 ( P >
0105) 。结果见表 1。
表 1 　VnA 对脑缺血2再灌注损伤大鼠神经
行为评分的影响 ( x ±s)
Table 1 　Effect of VnA on score of neurological
def icits in CIR rats ( x ±s)
组　别
剂量
/ (μg·kg - 1)
动物数
/ 只
评分
4 h 24 h
模型 + NS - 7 719 ±115 610 ±016
模型 + VnA 20 9 519 ±114 3 415 ±110 3 3
40 9 419 ±117 3 3 410 ±016 3 3
假手术 - 6 　　0 　　0
　　与模型 + NS 组比较 : 3 P < 0105 　3 3 P < 0101
　　3 P < 0105 　3 3 P < 0101 vs model + NS group
31112 　对局灶性脑缺血2再灌注大鼠脑梗死面积的
影响 :与模型 + NS 组相比 ,VnA 可明显缩小缺血2
再灌注后的脑梗死面积 ,VnA 20 及 40μg/ kg 使梗
死面积分别减少 3910 % 和 6714 % ( P < 0105 ,
0101) ,但两给药组间差异无显著性 ( P > 0105) ,结
果见表 2。
表 2 　VnA 对脑缺血2再灌注损伤大鼠
脑梗死面积的影响 ( x ±s)
Table 2 　Effect of VnA on infarction
area in CIR rats ( x ±s)
组　别
剂量
/ (μg·kg - 1)
动物数
/ 只
梗死面积百分比
/ %
抑制率
/ %
模型 + NS - 6 1911 ±511 -
模型 + VnA 20 6 1011 ±518 3 3413
40 6 511 ±412 3 3 6116
假手术 - 6 　　0 -
　　与模型 + NS 组比较 : 3 P < 0105 　3 3 P < 0101
　　3 P < 0105 　3 3 P < 0101 vs model + NS group
31113 　组织形态学和病理学改变 :假手术组大脑半
球外观正常 ,切片 HE 染色镜下见手术侧半球组织
结构无异常。模型 + NS 组大体见额颞顶部颜色苍
白、肿胀 ,并向对侧移位 ,脑表面静脉充血。切片
HE 染色镜下见神经细胞呈三角形 ,胞浆呈深伊红
着色 ,核固缩或溶解 ,半影区有不同程度的渗出 ,细
胞间隙增大 ,神经细胞肿胀 ,梗死灶主要分布于额顶
叶皮质及纹状体区域 ,后者明显。模型 + VnA 组大
·909·中草药 　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 35 卷第 8 期 2004 年 8 月
体见额颞顶部略苍白 ,轻度肿胀 ,无移位 ,切片 HE
染色镜下可见细胞肿胀程度、间隙及胞核变化均较
模型 + NS 组轻。
312 　对局灶性脑缺血2再灌注梗死区 ICAM21 表达
的影响 :在脑组织切片中 ICAM21 免疫阳性染色表现
为神经元及血管内皮细胞胞浆棕黄色深染。假手术
组双侧大脑半球均只有极少量的 ICAM21 阳性染色
血管 ;模型 + NS 组及两给药组未缺血侧脑半球可见
少量的、低表达的 ICAM21 免疫阳性血管 ,但神经细
胞未见阳性染色。明显的 ICAM21 免疫阳性染色出
现在缺血2再灌注侧半球 ,阳性反应部位主要以梗死
灶及其周围区域的神经细胞为主 ,而且缺血区皮质星
形细胞表达最为明显。镜下观察两给药组、模型 +
NS 组阳性细胞表达数量均明显高于假手术组 ,给药
组较模型组明显减少 ,差异有显著性 ( P < 0101) ,两
剂量间差异无显著性 ( P > 0105) 。结果见表 3。
表 3 　VnA 对脑缺血2再灌注损伤大鼠梗死区
ICAM21 表达的影响 ( x ±s)
Table 3 　Effect of VnA on ICAM21 expression in
ischemic lesion area of CIR rats ( x ±s)
组　别
剂量
/ (μg·kg - 1)
动物数
/ 只
阳性神经细胞数
/ (个·mm - 2)
模型 + NS - 6 288 ±48 △
模型 + VnA 20 7 223 ±52 3 △
40 6 194 ±35 3 3 △
假手术 - 6 　8 ± 3 3 3
　　与模型 + NS 组比较 : 3 P < 0105 　3 3 P < 0101 ; 　与假手术组
比较 : △P < 0101
　　3 P < 0105 　3 3 P < 0101 vs model + NS group ; 　△P < 0101 vs
Sham operation group
313 　对局灶性脑缺血2再灌注大鼠脑梗死周边区
nNOS 表达的影响 : nNOS 阳性表达表现为胞浆或
血管壁棕黄色深染。本实验结果显示 :假手术组双
侧脑半球、模型 + NS 组与给药组左侧脑半球除少
数微血管可见内皮细胞染色阳性外 ,余未见明显染
色。模型 + NS 组与给药组右侧脑半球缺血区及其
周边区损伤和未损伤的神经元都有 nNOS 的阳性
表达。镜下观察模型 + NS 组及给药组较假手术组
nNOS 免疫阳性细胞的数量均明显增高 ( P <
0101) ,模型 + NS 组与给两药组之间阳性神经元表
达数量差异无显著性 ( P > 0105) ,结果见表 4。
4 　讨论
　　本实验采用局灶性脑缺血2再灌注模型研究了
VnA 对缺血2再灌注性脑损伤的影响 ,发现 VnA 具
有明显的脑保护作用。临床上初次脑卒中的病例中
大脑中动脉梗死占 70 % 左右 ,所以大脑中动脉栓
死再灌注模型模拟的病理过程与临床脑卒中较相
表 4 　VnA 对脑缺血2再灌注损伤大鼠脑梗死
周边区 n NOS 表达的影响 ( x ±s)
Table 4 　Effect of VnA on n NOS expression in peri2
ischemic lesion area of CIR rats ( x ±s)
组　别
剂量
/ (μg·kg - 1)
动物数
/ 只
阳性神经细胞数
/ (个·mm - 2)
模型 + NS - 6 284 ±32 △
模型 + VnA 20 7 245 ±67 △
40 6 213 ±79 △
假手术 - 6 11 ± 3
　　与假手术组比较 : △P < 0101
　　△P < 0101 vs Sham operation group
似。Koizumi 法制备的大鼠脑缺血2再灌注模型梗死
灶发生率高 ,可有效地阻断大鼠 MCA 供血区血流 ,
而且可以模拟血管再通后的再灌注情况 ,部位固定
于皮质及纹状体区 ,创伤小 ,损伤程度稳定 ,术后动
物存活期较长。本实验结果显示 VnA 两个剂量组
均可明显减小脑缺血2再灌注损伤梗死灶面积 ,降低
缺血周边区神经元损伤程度 ,改善缺血2再灌注所致
行为障碍。据此可推测 ,VnA 可以挽救濒危的急性
缺血神经元 ,减少缺血周边区转化为梗死区 ,为受损
神经元功能恢复提供机会。另外 ,VnA 能明显降低
损伤后神经行为障碍 ,可能更具有实际意义。
脑缺血2再灌注后炎性机制是加重缺血区损伤
的重要原因。正常情况下 ,中性粒细胞及血管内皮
细胞表面有少量 ICAM21 表达 ,中性粒细胞及血管
内皮细胞表面黏附分子的亲和力较弱 ,不会影响血
循环功能。但在脑缺血等病理情况下 , ICAM21 明
显上调 ,细胞黏附性增强 ,导致白细胞牢固地黏附于
血管内皮细胞表面。此改变一方面可机械性堵塞微
循环通道 ,影响组织的血液供应 ,另一方面活化的以
及进入组织内的白细胞可释放大量的毒性氧自由基
和蛋白水解酶、炎症介质、细胞因子等 ,损害局部的
血管 ,导致血管通透性增强 ,造成组织水肿 ,破坏残
存的神经元和胶质细胞 ,从而加重神经组织的损伤 ,
并吸引更多的白细胞进入组织 ,形成恶性循环 ,直到
组织完全破坏。Bowes 等报道在大鼠大脑中动脉缺
血2再灌注损伤中使用 ICAM21 抗体减少了脑缺血
性损伤[7 ] 。Zhang 等发现在阻断大鼠大脑中动脉 2
h2再灌注 1 h ,使用 ICAM21 单克隆抗体能使缺血性
损伤面积明显缩小[8 ] 。本实验显示 :在脑缺血 115
h 再灌注至 24 h ,给药组较模型 + NS 组大鼠脑缺血2再灌注区 ICAM21 免疫阳性神经元数目明显减少 ,
而且形态学观察表明 ,其相应区域的神经细胞损伤
·019· 中草药 　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 35 卷第 8 期 2004 年 8 月
也轻于模型 + NS 组 ,提示 VnA 减轻脑缺血性损伤
与其阻断血管内皮细胞与白细胞的黏附 ,抑制中性
白细胞的浸润 ,减轻缺血脑组织的炎症反应有关。
NO 作为多功能生物效应分子 ,不仅参与细胞
的各种生理活动 ,而且在许多病理过程中也发挥了
重要作用。合成 NO 的一氧化氮合酶 (NOS) 存在
于脑组织细胞中。缺血早期主要表达结构型一氧化
氮合酶 cNOS [ cNOS 包括神经元型一氧化氮合酶
(nNOS) 和内皮型一氧化氮合酶 (eNOS) 。已有研
究表明 NO 在局灶性脑缺血病理过程中具有双重
作用[9 ] ,来自 eNOS 的 NO 通过保持局部脑血流起
到有益作用 ,而 nNOS 激活后产生过量 NO 有神经
毒性。正常情况下 ,含 nNOS 的阳性细胞散在于脑
实质及脑血管表面 ,该种神经元约占全脑神经细胞
的 2 % 左右[10 ] 。本研究显示 ,脑缺血2再灌注 24 h
时 ,nNOS 大量表达于缺血区神经元而未缺血区却
较少表达亦证实了其毒性作用。许多研究已证实选
择性 nNOS 抑制剂可减轻缺血性脑损伤。本实验
目的之一是观察 VnA 脑保护作用是否有抑制
nNOS 机制参与 ,结果显示给药组与模型 + NS 组相
比未见有显著性差异。
脑缺血的病理过程中有诸多因素参与 ,VnA 的
脑保护作用具体作用于哪些环节有待进一步研究。
References :
[ 1 ] 　Li H , Gao G Y , Li S Y , et al . Effects of Verat rum nigrum
alkaloids on central catecholaminergic neurons of renal hyperten2
sive rats [J ]1 Acta Pharmacol S in (中国药理学报) , 2000 , 21
(1) : 232281
[ 2 ] 　Chung M I , Teng C M , Cheng K L , et al . An antiplatelet
principle of Verat rum f ormosanum [J ]1 Planta Med , 1992 ,
58 (3) : 27422761
[ 3 ] 　Han G Z1 The study of effects of Verat rum nigrum alkaloids on
antithrombus [J ]1 Chin Pharmacol B ull (中国药理学通报) ,
2001 , 18 (2) : 332341
[ 4 ] 　Li W P , Gao D Y , Zhou Q , et al . Neuroprotective effects of
VnA on rats with focal cerebral ischemia injury [J ]1 Chin
Pharm J (中国药学杂志) , 2002 , 37 (8) :6241
[ 5 ] 　Laing R J , Jakubowski J , Laing R W1 Middle cerebral artery
occlusion without craniectomy in rats. Which method works
best ? [J ]1 S t roke , 1993 , 24 (2) : 29422971
[ 6 ] 　Bederson J B , Pitts L H , Tsuji M , et al . Rat middle cerebral
artery occlusion : evaluation of the model and development of a
neurological examination [J ]1 S t roke , 1986 , 17 :47224761
[ 7 ] 　Bowes M P , Zivin J A , Rothleic R. Monoclonal antibody to the
ICAM21 adhesion site reduces neurological damage in a rabbit
cerebral embolism stroke model [J ]1 Ex p Neurol , 1993 , 119
(1) : 21522191
[ 8 ] 　Zhang R L , Chopp M , Jiang N , et al . Anti2intercellular adhe2
sion molecule21 antibody reduces ischemic cell damage after tran2
sient but not permanent middle cerebral artery occlusion in the
Wistar rats [J ]1 S t roke , 1995 , 26 (5) : 1438214441
[ 9 ] 　Iadecola C1 Bright and dark sides of nitric oxide in ischemic brain
injury [J ]1 Trends Neurosci , 1997 , 20 (3) : 13221391
[ 10 ] 　Bredt D S , Huang P H , Snyder S H1 Localization of nitric oxide
synthase indicating a neural role for nitric oxide [J ]1 Nat ure ,
1990 , 347 : 76827701
川芎嗪及其衍生物抗凝血活性的研究
夏承建 ,王 　松 Ξ ,朱鹤孙
(北京理工大学 材料研究中心 ,北京 　100081)
　　川芎嗪即四甲基吡嗪 ( tet ramethyl pyrazine ,
TMPZ) ,是从伞形科藻本属植物川芎 L igusticum
chuanxiong Hort . 的根茎中提取分离的生物碱单
体 ,是川芎的主要有效成分 ,现已可人工合成[1 ] 。
临床上 TMPZ 主要用于治疗闭塞性脑血管疾病 ,如
脑血栓、脑动脉栓塞等。实验研究表明其具有降压、
抗肿瘤、扩张血管、抑制血小板聚集作用 ,并对已聚
集的血小板有解聚作用[2 ,3 ] 。本实验通过测定活化
部分凝血激酶时间 (APTT) 、凝血酶 (凝固) 时间
( TT) 以及凝血酶原时间 ( PT) 3 种指标作为评价
标准 ,初步研究 TMPZ、川芎嗪212氮氧化物 ( TMP2
ZO) 、22羟甲基23 ,5 ,62三甲基吡嗪 ( TMPZ2OH) 、3 , 5 ,62三甲基吡嗪222甲酸 ( TMPZ2COOH) 、川芎嗪21 ,42双氮氧化物 ( TMPZO2) 5 种化合物的抗凝血活性。1 　材料111 　试剂 :川芎嗪 ( TMPZ) ,购自百灵威公司 ;磷酸川芎嗪 ,购自北京市燕京制药厂 ,白色结晶性粉末 ,批号 020401。30 % 双氧水 ,购自天津市东方化工厂。采自健康人体的冰冻血浆 ,购自北京北太平庄血站。凝血酶、部分凝血活酶、凝血活酶、氯化钙溶液 ,均购自上海医科大学华山医院技协生物试剂公司。其余试剂均购自北京化学试剂公司 ,且均为分析纯。
·119·中草药 　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 35 卷第 8 期 2004 年 8 月
Ξ 收稿日期 :2003212218
基金项目 :国家重点基础研究“973”项目 ( G1999064705)
作者简介 :夏承建 (1978 —) ,男 ,山东威海人 ,北京理工大学材料研究中心 2001 级硕士研究生 ,主要从事抗凝血材料的研究。
Tel : (010) 68949661 (O) 　(010) 68943346 ( H) 　E2mail : xchengjian @163. com3 通讯作者　Tel : (010) 68949661 　E2mail : wangsong @bit . edu. cn