全 文 ：以期提高其葛根素含量 ,为野葛细胞培养生产葛根
素的工业化提供技术支持。
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化橘红黄酮类成分的 HPLC指纹图谱研究
陈志霞 1 ,林　励 2 ,孙冬梅 3
( 1. 广东省药品检验所 ,广东 广州　 510180;　 2. 广州中医药大学 ,广东 广州　 510405;　 3. 广东省中医研究所 ,广东 广州
510095)
摘　要: 目的　研究不同品种和产地化橘红药材黄酮类成分的色谱指纹图谱分析方法。 方法　应用 HPLC法以柚
皮苷为参比 ,以相对保留时间和峰面积百分比为参数 ,建立 10个样品的 HPLC指纹图谱。 结果　标示出 30多个
峰 ,且不同品种化橘红 (毛橘红和光橘红 )的图谱存在较大的差异。 结论　该方法准确、重现性好 ,适用于化橘红药
材的质量控制与鉴定。
关键词: 化橘红 ;黄酮类成分 ;高效液相色谱 ;指纹图谱
中图分类号: R282. 710. 3　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 07 0657 05
HPLC fingerprint of flavonoids inExocarpium Citr iGrand is
CHEN Zhi-xia
1
, LIN Li
2
, SUN Dong-mei
3
( 1. Guangdong Institute fo r Drug Contro l, Guang zhou 510180, China;　 2. Guang zhou Univ ersity o f TCM ,
Guang zhou 510405, China;　 3. Guangdong Institute of Chinese Medicine, Guang zh ou 510095, China)
Abstract: Object　 To establish the HPLC fingerprint of f lav onoids in Exocarpium Citri Grandis
( ECG) . Methods　 HPLC fingerprint o f ten samples w ere established. The na ringin w as used as standard.
The relative mig ration time and the percentag e o f peak area were used as parameters. Results　 More than
30 peaks occurred on the HPLC fingerprint of f lav onoids of ECG. The fingerprints of C . grandis `Tomen-
tosa’ and C. grands had obivous dif ferences. Conclusion　 The method is simple and accura te w ith a good
reproducibility. It could be used fo r quali ty cont rol and identification of ECG.
Key words: Exocarpium Citri Grandis ( ECG) ; f lav onoids; HPLC; fing erprint
　　化橘红是芸香科植物化州柚 Citrus grandis
` Tomentosa’或柚 C. grandis ( L. ) Osbeck的未成
熟或近成熟的干燥外层果皮。具散寒、燥湿、利气、消
痰作用 ,临床用于治疗风寒咳嗽、喉痒痰多、食积伤
酒、呕恶痞闷等症 [ 1]。是广东名贵特产药材。来源于
植物化州柚的又名毛橘红 ,来源于植物柚的又名光
·657·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 7期 2003年 7月
收稿日期: 2002-11-19基金项目:广东省科技计划项目 ( A301020101)作者简介:陈志霞 ( 1975- ) ,女 ,湖北省武汉市人 ,硕士 ,研究方向为中药质量标准研究。 Tel: ( 020) 81863096
橘红。黄酮类成分是化橘红的主要有效成分之一 ,是
较好的消炎、止咳、平喘活性成分 [ 2]。化橘红黄酮类
成分中含有柚皮苷 ( na ringin) 及少量野漆树苷
( rhoi fo lin)、枳属苷 ( ponci rin)及新橙皮苷 ( neohes-
peridin)
[ 3]。其中柚皮苷是化橘红的主要化学成分之
一。本实验对化橘红药材黄酮类成分进行指纹图谱
分析 ,有利于该药材的质量控制。
1　仪器、试药与材料
1. 1　仪器与材料: Agi lent-1100型高效液相色谱
仪 ,包括:四元泵 ,在线脱气机 ,柱温箱 , DAD检测器
等。 BP211D电子分析天平 (德国 Sartorius公司 ) ,
电动恒温水浴锅 (上海一恒电子仪器厂 )。
1. 2　试药:柚皮苷对照品 (中国药品生物制品检定所
提供 ,批号: 722-9004) ,野漆树苷工作参比品 (为从化
州柚中分离所得 ,并经光谱鉴定 ) ,甲醇 (色谱纯 ) ,三
蒸水 ,石油醚 ( 60℃～ 90℃ )、冰醋酸等均为分析纯。
1. 3　试验样品:化州柚样品均采自广东省化州市平
定镇化州柚 GAP种植基地 ,选取不同果龄果实进
行采集 (果龄越小 ,果实直径越小 )。柚样品为全国各
地市售商品。以上不同产地、果龄样品可较全面地代
表化橘红药材的整体特征 ,均经广州中医药大学中
药资源研究室林励教授鉴定 (表 1)。
表 1　试验用样品来源
Table 1　 Source of samples in experiment
编号 样品 直径 /cm 产地或购买地 编号 样品 直径 /cm 产地或购买地
1 化州柚 7. 0 广东省化州市平定镇 6 柚 4. 0 湖南 (市售 )
2 化州柚 4. 5 广东省化州市平定镇 7 柚 7. 0 广西 (市售 )
3 化州柚 6. 8 广东省化州市平定镇 8 柚 9. 2 海南 (市售 )
4 化州柚 5. 0 广东省化州市平定镇 9 柚 11. 3 北京 (市售 )
5 化州柚 6. 8 广东省化州市平定镇 10 柚 10. 5 河南 (市售 )
2　方法与结果
2. 1　色谱条件:流动相: A(甲醇 ) -B〔水 -乙酸 ( 61∶
4)〕,过 0. 45μm滤膜 ,梯度洗脱: 0～ 60 min A
100%→ 0%。色谱柱: LiCh ro spher○R 100( RP-18e, 5
μm, 250 mm× 4 mm , Merck)。 流速: 1. 0 mL /min;
检测波长: 283 nm;柱温: 40℃ ;分析时间: 70 min。
2. 2　样品溶液的制备: 取各药材样品 10. 00 g (另
取 15. 00 g测定水分 )置索氏提取器中 ,加石油醚
( 60℃～ 90℃ ) 65 mL,水浴回流提取 2. 5 h,弃去
石油醚液 ,待样品中残存的石油醚全部挥去后 ,加甲
醇 65 mL再置水浴中回流提取 4 h,放冷 ,滤过 ,滤
液转移至 100 mL量瓶中 ,以甲醇少量分数次洗涤
容器及滤纸 ,洗涤液并入同一量瓶中 ,甲醇定容至刻
度 ,制得样品溶液。
2. 3　对照品溶液的制备: 精密称定柚皮苷、野漆树
苷分别置 20 mL量瓶中 ,加甲醇溶解并稀释至刻
度 ,分别制成 0. 09 mg /mL的对照品溶液。
2. 4　方法学考察
2. 4. 1　线性关系:分别精密吸取柚皮苷对照品溶液 2,
4, 6, 8, 10μL注入高效液相色谱仪 ,按上述条件进行测
定 ,以柚皮苷量为横坐标 ,峰面积积分值为纵坐标 ,绘制
标准曲线。求得柚皮苷的回归方程为 Y= 1 625. 669 09
X+ 9. 369 02, r= 0. 999 9。 在 0. 09～ 0. 9μg呈良好
的线性关系。柚皮苷对照品色谱图见图 1。
2. 4. 2　稳定性试验:取同一样品溶液 ,分别在 0, 2,
图 1　柚皮苷对照品色谱图
Fig. 1　 Chromatogram of narigin ref erence substance
4, 8, 12, 16, 20, 24 h进样 ,按上述条件进行测定 ,其
相对保留时间稳定 ,主要共有峰面积 RSD= 2. 73%
(n= 8)。
2. 4. 3　精密度试验: 取同一样品溶液 ,连续进样 5
次 ,按上述条件进行测定 ,其相对保留时间稳定 ,主
要共有峰面积 RSD= 0. 38% 。
2. 4. 4　重现性试验:按样品溶液制备方法处理同一
批样品 5份 ,按上述条件进行测定 ,其相对保留时间
稳定 ,主要共有峰面积 RSD= 2. 48% 。
2. 5　样品测定及结果: 按样品制备方法处理以上
10批样品后进行测定 ,得到 30余个峰 ,其中共同峰
有 20多个 ,选择柚皮苷峰作为参比 ,采用相对保留
时间对色谱峰进行鉴别。 各峰相对保留时间为其绝
对保留时间与柚皮苷峰的绝对保留时间之比值。 各
样品分析结果见表 2, 3。样品 1(毛橘红 1)和样品 6
(光橘红 1)的色谱图分别见图 2, 3。
分离得到包括柚皮苷 ( 21)和野漆树苷 ( 23)在内
的 30多个峰 ,其中 20多个峰为毛橘红与光橘红的
·658· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 7期 2003年 7月
表 2　 5批毛橘红 HPLC指纹图谱分析结果
Table 2　 Analytical results of HPLC f ingerprint of f ive batches of C. grandis `Tomentosa’
峰号 相对保留时间
面积百分比 /%
样 1 样 2 样 3 样 4 样 5
　　 1 　　　 1. 060 0 　　　 0. 951 0 　　　 1. 417 5 　　　 0. 716 6 　　　 0. 331 7 　　　 2. 170 5
2 0. 070 5 0. 473 8 0. 312 9 0. 473 8 0. 849 2 0. 588 7
3 0. 081 2 0. 592 3 1. 280 0 0. 202 3 0. 331 2 0. 480 6
4 0. 112 8 0. 720 2 0. 758 8 0. 331 0 0. 542 3 0. 685 6
5 0. 184 1 1. 251 7 0. 256 8 0. 218 3 0. 371 1 0. 829 1
6 0. 242 9 0. 198 3 0. 245 4 0. 277 1 0. 401 4 0. 229 0
7 0. 279 0 0. 416 4 0. 266 2 0. 144 4 0. 166 1 　　　　 -
8 0. 298 2 　　　　 - 0. 370 7 　　　　 - 　　　　 - 0. 317 6
9 0. 341 8 0. 243 2 0. 242 5 0. 121 5 0. 137 5 0. 166 9
10 0. 398 9 　　　　 - 0. 279 5 0. 284 1 0. 160 5 0. 344 4
11 0. 542 9 0. 257 6 0. 400 0 0. 265 7 0. 187 7 0. 344 8
12 0. 601 2 0. 178 2 0. 410 8 1. 149 9 　　　　 - 0. 431 7
13 0. 635 7 0. 185 8 0. 343 7 0. 229 7 0. 471 4 0. 291 8
14 0. 733 6 0. 668 9 0. 308 8 0. 931 5 0. 715 7 1. 407 9
15 0. 797 7 0. 197 8 0. 995 7 1. 512 3 1. 896 9 0. 421 9
16 0. 829 4 0. 190 8 1. 017 8 0. 284 6 0. 276 2 0. 830 2
17 0. 880 0 1. 009 9 0. 835 5 0. 782 8 　　　　 - 0. 807 0
18 0. 921 7 0. 602 1 0. 746 1 0. 367 0 　　　　 - 0. 225 3
19 0. 949 8 0. 964 8 1. 583 3 0. 933 8 　　　　 - 0. 408 6
20 0. 963 9 1. 153 7 　　　　 - 　　　　 - 　　　　 - 0. 369 6
21* 1. 0000 80. 744 4 80. 005 5 83. 533 5 89. 777 7 80. 141 4
22 1. 085 3 　　　　 - 0. 469 5 0. 339 8 　　　　 - 0. 513 6
23△ 1. 125 4 4. 523 0 4. 288 4 1. 854 8 1. 606 5 4. 904 2
24 1. 221 6 1. 554 0 1. 448 7 1. 127 1 0. 788 5 0. 262 2
25 1. 256 9 1. 420 2 0. 447 4 2. 220 8 0. 452 2 1. 305 0
26 1. 289 8 0. 358 6 0. 540 8 0. 345 0 0. 172 0 0. 383 1
27 1. 310 5 0. 349 0 　　　　 - 0. 335 6 　　　　 - 　　　　 -
28 1. 354 6 0. 405 8 0. 349 8 0. 136 3 0. 144 2 0. 488 6
29 1. 382 2 0. 189 3 　　　　 - 0. 383 0 　　　　 - 0. 249 1
30 1. 416 4 0. 199 4 0. 210 2 0. 261 5 　　　　 - 0. 254 0
31 1. 553 1 　　　　 - 0. 167 7 0. 134 2 　　　　 - 0. 154 8
32 1. 603 9 　　　　 - 　　　　 - 0. 123 5 　　　　 - 　　　　 -
33 1. 623 5 　　　　 - 　　　　 - 　　　　 - 0. 221 2 　　　　 -
　　　* 柚皮苷　△野漆树苷
* naringin　△ rhoifolin
图 2　毛橘红 1 HPLC色谱指纹图谱
Fig. 2　 HPLC f ingerprint of C. grandis T`imentosa 1
共有峰 ,其主要色谱峰的 DAD光谱均显示黄酮特
征 ( 240～ 280 nm, 300～ 400 nm )。 大部分光橘红样
品在 51. 4 min有一个含量超过 10%的峰 ( 26) ,而
毛橘红则难以检测到此峰或含量极低 ,此外 ,毛橘红
中柚皮苷的含量均在 80%以上 ,而光橘红中柚皮苷
的含量均在 70%以下 ,明显低于毛橘红。市售药材
图 3　光橘红 1 HPLC色谱指纹图谱
Fig. 3　 HPLC f ingerprint of C. grandis 1
毛橘红中野漆树苷的含量均大于 4% ,而光橘红中
野漆树苷的含量均在 2%以下 ,明显低于毛橘红。故
柚皮苷和野漆树苷峰所占的百分含量也可成为区分
二者的另一个依据。
3　讨论
3. 1　由于化州柚是来源于化州市特有的树种 ,将其
·659·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 7期 2003年 7月
表 3　 5批光橘红 HPLC指纹图谱分析结果
Table 3　 Analytical results of HPLC fingerprint of f ive batches of C. grand is
峰号 相对保留时间
面积百分比 /%
样 6 样 7 样 8 样 9 样 10
　　 1 　　　 1. 060 0 　　　 0. 703 2 　　　 1. 369 1 　　　 1. 927 3 　　　 1. 985 7 　　　 1. 677 7
2 0. 070 5 0. 384 2 0. 483 9 0. 684 2 0. 704 5 0. 820 6
3 0. 081 2 0. 300 1 0. 977 9 1. 124 2 2. 021 4 2. 531 9
4 0. 112 8 0. 800 1 1. 036 2 0. 589 5 0. 535 6 3. 153 7
5 0. 184 1 0. 474 3 0. 674 2 0. 429 9 1. 138 3 　　　　 -
6 0. 242 9 0. 380 0 　　　　 - 0. 337 5 0. 495 0 0. 655 9
7 0. 279 0 0. 360 0 0. 443 1 0. 209 5 　　　　 - 　　　　 -
8 0. 298 2 0. 207 8 0. 369 2 　　　　 - 　　　　 - 　　　　 -
9 0. 341 8 0. 269 1 　　　　 - 　　　　 - 　　　　 - 1. 873 7
10 0. 398 9 0. 359 4 　　　　 - 　　　　 - 0. 115 0 0. 595 1
11 0. 542 9 0. 225 7 0. 323 7 0. 241 3 　　　　 - 0. 444 4
12 0. 601 2 　　　　 - 0. 355 7 0. 219 9 0. 273 4 　　　　 -
13 0. 635 7 0. 418 6 0. 308 7 　　　　 - 　　　　 - 　　　　 -
14 0. 733 6 0. 357 7 1. 374 3 0. 863 8 0. 446 8 1. 115 7
15 0. 797 7 0. 255 1 1. 567 2 0. 967 8 0. 897 5 3. 186 7
16 0. 829 4 　　　　 - 0. 509 2 0. 582 2 0. 268 0 0. 484 7
17 0. 880 0 1. 071 4 1. 842 2 0. 752 8 　　　　 - 3. 082 8
18 0. 921 7 　　　　 - 0. 631 5 　　　　 - 　　　　 - 3. 982 3
19 0. 949 8 1. 273 1 1. 183 3 　　　　 - 0. 701 5 　　　　 -
20 0. 963 9 　　　　 - 0. 564 4 　　　　 - 0. 906 6 　　　　 -
21* 1 63. 919 1 69. 122 7 70. 457 2 65. 374 5 54. 029 4
22 1. 085 3 0. 505 1 0. 519 2 　　　　 - 2. 479 5 0. 611 6
23△ 1. 125 4 0. 891 7 2. 683 5 1. 823 0 1. 171 1 1. 960 3
24 1. 221 6 1. 065 8 2. 449 1 1. 161 1 0. 404 3 1. 794 0
25 1. 256 9 1. 196 5 1. 261 1 　　　　 - 0. 383 8 0. 767 4
26 1. 289 8 0. 293 4 0. 460 9 　　　　 - 0. 841 9 2. 797 2
27 1. 310 5 22. 250 2 27. 608 7 11. 581 2 16. 126 2 10. 449 9
28 1. 354 6 1. 022 6 1. 225 7 2. 137 0 　　　　 - 2. 017 1
29 1. 382 2 　　　　 - 　　　　 - 0. 900 7 0. 228 7 0. 768 1
30 1. 416 4 0. 280 3 　　　　 - 1. 162 8 　　　　 - 0. 513 3
31 1. 553 1 0. 319 8 0. 510 5 0. 636 1 0. 326 5 0. 690 9
32 1. 603 9 0. 212 5 0. 144 9 0. 547 3 　　　　 - 　　　　 -
33 1. 623 5 0. 203 3 　　　　 - 0. 663 7 　　　　 - 　　　　 -
　　　* 柚皮苷　△野漆树苷
* naringin　△ rhoifolin
移栽至别处时会发生变种 ,因此本实验所选的 5批
毛橘红样品均来自广东省化州市的 GAP基地。考
虑到代表性 ,这 5批样品中考虑了市售药材、鲜果、
干果及大小果龄等因素 ;光橘红则来自不同产地或
自不同地方购买。
3. 2　在考察了多种流动相 ,以本实验提供的较为理
想。由于化橘红药材脱脂后的甲醇液中柚皮苷的含
量极高 ,波长为 283 nm时 ,可达 80%以上 ,而其他
的成分大部分含量还不到 1% ,所以必须截断柚皮
苷的峰以突出其他的峰。同时必须大大提高药材的
浓度 ,以便于一些含量更小的峰能被检测出来。经过
多次试验 ,最后将药材的浓度确定为 0. 1 g /mL。化
橘红含大量的黄酮类化合物 ,并且他们在理化性质
上很相似 ,为使各成分得到更好的分离效果 ,采取了
梯度洗脱的方式 ,分析时间定在 70 min。
3. 3　化州柚已有 1 500多年种植史 ,其未成熟外果
皮称正毛化橘红 ,曾列为皇室专用圣药 ,有“真者一
片值千金”的说法 ,足可见其功效甚著。 自古以来化
橘红均以芸香科植物化州柚的外果皮入药 ,直到
1959年胡敏寰提出柚果皮可作为化橘红入药 [4 ] ,由
于来源广泛 ,价格低廉 ,故自《中华人民共和国药典》
1977年版在化橘红项下增补柚后 ,光橘红很快便充
斥于市场。化州柚为柚的变种 ,传统的理化鉴别方法
很难区别 ,而指纹图谱研究方法尤其是 HPLC指纹
图谱的发展为困难品种的鉴别提供了先进有力的方
法手段。本文的研究结果表明 ,化州柚和柚主要有效
部位黄酮类成分的 HPLC指纹图谱有明显差别 ,应
结合药效学对其内在质量进行深入研究 ,辨别优劣 ,
区别应用 ,为进一步规范化橘红药材质量标准和安
全合理的临床用药提供依据。
·660· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 7期 2003年 7月
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葛根高效液相指纹图谱的研究
陈士林 1, 2 ,陈四保 1, 2 ,杨大坚 1 ,陈新滋 1 ,徐宏喜 3
( 1. 香港理工大学 ,香港 红 ;　 2. 中国医学科学院 中国协和医科大学药用植物研究所 ,北京　 100094;　 3. 香港赛马会中
药研究院 ,香港 九龙 )
摘　要: 目的　采取高效液相色谱法建立野葛的指纹图谱 ,为野葛药材质量控制提供依据。 方法　 Agilent高效液
相色谱仪 , Zo rbax XDB-C18 ( 4. 6 mm× 250 mm, 5μm)色谱柱 ,甲醇和水梯度洗脱 ,流速 0. 5 mL /min,检测波长 250
nm。结果　精密度和重复性试验中各共有峰相对峰面积的 R SD均小于 5% ,符合有关规定。结论　此方法可作为
控制野葛内在质量的标准。
关键词: 野葛 ; HPLC;指纹图谱 ;质量控制
中图分类号: R282. 710. 3　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 07 0661 03
HPLC f ingerprint analyses of Radix Puerar iae
CHEN Shi-lin1, 2 , CHEN Si-bao1, 2 , YAN G Da-jian1 , Albert S. C. Chan1 , XU Hong-xi3
( 1. The Hong Kong Po ly tech nic Univ er sity , Hung Hom, Hong Kong , China;　 2. Institute of M edicinal Plant
Development, CAM S& PUM C, Beijing 100094, China; 3. Hong Kong Jockey Club
Institute of Chinese Medicine Limited, Kowloon, Hong Kong , China )
Key words: Pueraria lobata (Willd. ) Ohwi; HPLC; fingerprint; quali ty contro l
　　葛根为豆科植物野葛 Pueraria lobata ( Willd. )
Ohwi或甘葛藤 P . thomsonii Benth. 的干燥根。味
甘、辛、凉 ,归脾胃二经 ,具有解肌退热、生津、透疹、
升阳止泻之功效 [1 ]。其主要有效成分为异黄酮类。由
于受产地、气候和生态环境等的影响 ,不同葛根药材
所含的有效成分差异较大 [2, 3 ]。针对中药材或中成药
的某个有效成分或指标进行定性、定量分析并不能
有效控制中药材或中成药的质量 ,目前 ,指纹图谱已
成为国际公认的控制中药和天然药物质量的最有效
的手段 ,其根据色谱指纹图谱的模糊属性 ,着眼于宏
观的规律性的特征分析。本实验通过考察安徽霍山
产的野葛 ,建立野葛高效液相指纹图谱 ,作为评价和
控制野葛原药材内在质量的标准。
1　仪器与试剂
Agi lent高效液相色谱仪 , DAD二级管阵列检
测器 , HP1100色谱工作站。甲醇为 Fisher色谱纯 ,
其他试剂为分析纯。 水为超净水。 用于指纹图谱的
10批野葛药材采自安徽霍山县葛根基地 ,其他供试
样品分别为南京、西安、沈阳、广州 (粉葛 )等地药材
市场所售商品药材。
2　方法与结果
2. 1　色谱条件: 色谱柱为 Zo rbax XDB-C18 ( 4. 6
mm× 250 mm , 5μm);流动相为甲醇 -水 ,梯度洗脱:
0～ 10 min甲醇由 25%升为 30% , 20～ 50 min甲醇
由 30%升为 80% , 50～ 60 min甲醇由 80%升为
100% ;流速为 0. 5 mL /min;检测波长为 250 nm;进
样量为 20μL。
2. 2　参照物溶液的制备:采用葛根素 (外标 )为参照
物 ,精密称定适量 ,制成 20μg /mL的参照物溶液。
2. 3　供试品溶液的制备: 精密称定葛根粉末 ( 50
目 ) 100 mg ,置圆底烧瓶中 ,精密加入 100 mL 30%
乙醇溶液 ,称定重量 ,加热回流 30 min,用 30%乙醇
·661·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　第 34卷第 7期 2003年 7月
收稿日期: 2003-01-22作者简介:陈士林 ( 1961- ) ,男 ,博士 ,湖北人 ,现任香港理工大学客座教授、中国医学科学院药用植物研究所常务副所长、香港理工大学中药研究所常务副所长 ,以中药资源与开发为研究方向。
Tel: 00852-27665606　 ( 010) 62899701　 E-mai l: scs lch en@ sohu. com