全 文 ：表 2 　当归药材指纹图谱共有峰的相对峰面积
Table 2 　Relative peak areas of common peak for f ingerprint of A1 sinensis
批号
相　　对　　峰　　面　　积
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 S 17 18
　1 01439 01324 01113 01556 01064 01416 01096 01115 01052 01058 01057 01090 01436 31558 01286 01077 11000 01063 01089
2 01648 01320 01152 01832 01090 01513 01147 01190 01092 01076 01097 01175 01526 41411 01358 01116 11000 01092 01120
3 01591 01212 01128 01713 01075 01482 01100 01132 01050 01053 01065 01115 01443 31874 01377 01076 11000 01075 01100
4 01692 01229 01055 01534 01038 01293 01073 01063 01081 01021 01032 01216 01425 51635 01194 01174 11000 01392 01197
5 01453 01330 01125 01631 01059 01412 01099 01132 01053 01060 01043 01075 01412 31123 01271 01084 11000 01071 01068
6 01509 01145 01123 01575 01081 01371 01100 01096 01040 01064 01053 01018 01331 11084 11199 01093 11000 01062 01098
7 01572 01241 01097 01502 01067 01528 01129 01124 01059 01077 01078 01271 01365 31083 01292 01173 11000 01393 01205
8 01463 01259 01150 01862 01062 01555 01119 01151 01070 01065 01074 01025 01421 41932 01411 01081 11000 01177 01083
9 01300 01266 01205 01438 01118 01720 01154 01147 01136 01115 01110 01737 01518 31497 01448 01128 11000 01075 01106
10 01474 01101 01125 01114 01734 01049 01461 01109 01093 01057 01071 01063 01417 51381 01349 01077 11000 01180 01082
表 3 　不同产地当归相似度比较
Table 3 　Comparison of similarity of A1 sinensis
collected from ten habitats
批　号 夹角余弦 相关系数
1 01995 4 01994 4
2 01998 5 01998 5
3 01999 0 01998 9
4 01992 6 01994 1
5 01997 7 01997 4
6 01986 0 01985 1
7 01987 5 01987 9
8 01997 7 01997 9
9 01985 0 01984 0
10 　 01994 7 01997 0
的指纹性。虽然不同产地的当归共有指纹峰面积是
有差异的 ,有的相差还很大。但三地当归相似性很
好 ,说明三地当归总体上是没有差异的。有关当归
质量控制与评价方面的进一步研究工作将另文报
道。
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黄花乌头体细胞胚胎发生及其植株再生
于荣敏1 ,3 ,徐秀泉2 ,赵 　昱3 Ξ
(11 暨南大学药学院 ,广东 广州 　510632 ; 　21 江苏大学生物与环境工程学院 ,江苏 镇江 　212013 ;
31 浙江大学药学院 ,浙江 杭州 　310031)
摘　要 :目的 　对不同植物激素及其配比对黄花乌头体细胞胚胎诱导及植株再生进行研究 ,为药用植物黄花乌头
的资源开发提供理论依据。方法 　以黄花乌头的茎、叶、胚轴、胚根和子叶为外植体考察不同植物激素对黄花乌头
愈伤组织诱导、体细胞胚胎发生及植株再生的影响。结果 　外植体接种于 MS + 2 ,42D 1 mg/ L + 62BA 015 mg/ L的
培养基上愈伤组织诱导率最高 ,愈伤组织在 MS + 2 ,42D 012 mg/ L + 62BA 015 mg/ L
·239· 中草药 　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 35 卷第 8 期 2004 年 8 月
Ξ 收稿日期 :2004202207
作者简介 :于荣敏 (1955 - ) ,男 ,教授 ,博士 ,研究方向为中药生物技术、创新药物的研制开发。
的培养基上连续继代几次后 ,分化出淡绿色具有圆锥状或原球状突起的胚性愈伤组织。胚性愈伤组织能够在 MS
+ 62BA 2 mg/ L 的培养基上形成不定芽 ,该芽能够在 MS + IBA 015 mg/ L 的培养基上生根 ,形成完整的再生植株。
结论 　利用体细胞胚胎发生技术可以成功地得到再生植株 ,从而为濒危植物黄花乌头的资源开发和保护提供新途
径。
关键词 :黄花乌头 ;体细胞胚胎发生 ;植株再生
中图分类号 :R282113 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 2670 (2004) 08 0932 04
Somatic embryogenesis and plantlet regeneration of Aconitum coreanum
YU Rong2min1 ,3 , XU Xiu2quan2 , ZHAO Yu3
(11 College of Pharmacy , Jinan University , Guangzhou 510632 , China ; 21 College of Biological and Environmental
Sciences , Jiangsu University , Zhenjiang 212013 , China ; 31 College of Pharmaceutical Sciences ,
Zhejiang University , Hangzhou 310031 , China)
Abstract : Object 　To develop new resources of medicinal plant of A conit um coreanum (Lévl. ) Rapaics by
the method of plant cell biotechnology1 Methods 　The segments of stems , leaves , embryonal axises , radicles ,
and cotyledon of A 1 coreanum were used as the explants1 The MS medium supplied with different auxin and
cytokinin was examined1 Results 　The calli were induced from explants on the MS medium supplied with 2 , 42
D 1 mg/ L and 62BA 015 mg/ L in the period of 30 d1 And the calli were differentiated into green conus or globe
embryo after several subcultures period on medium MS supplied with 2 , 42D 012 mg/ L and 62BA 015 mg/ L1
The adventitious buds differentiated could be developed from the somatic embryo callus into roots on medium MS
supplied with IBA 015 mg/ L , and then the intact plantlets were obtained1 Conclusion 　The plantlets of A 1
coreanum can be obtained by the techniques of somatic embryogenesis and it is indicated that this may be a new
way in developing new resource and protecting of A 1 coreanum1
Key words : A conit um coreanum (Lévl1) Rapaics ; somatic embryogenesis ; plantlet regeneration
　　黄花乌头 A conit um coreanum (Lévl1) Rapaics
俗称山喇叭花 ,为毛莨科乌头属多年生草本药用植
物。其块根关白附入药 ,具有祛风、燥湿、化痰止痛
之功效。中医临床主治中风、口眼歪斜、头痛、癫痫、
风寒失痹等[1 ] 。多年研究表明关白附中生物碱类
成分具有较好的抗心律失常、镇痛、抗炎、抗血小板
凝聚等药理作用。其中关附甲素由于具有明显的抗
心律失常作用而被称为“特异性减慢心率药”( spe2
cific bradycardic agent ) [2 ] ,有望成为我国具有独立
知识产权的国家一类新药。但是近年来由于人为恶
性采伐 ,天然资源遭到严重破坏 ,加之其天然无性繁
殖力低下 ,易受真菌、病毒感染 ,少根、腐根情况日益
严重 ,产量急剧下降 ,故新药开发面临着原材料供应
上的短缺局面。
本实验在前文[3 ]工作的基础上 ,研究了以黄花
乌头的茎、叶、幼苗为外植体 ,经组织培养筛选出胚
性愈伤组织 ,进而获得完整的小植株 ,建立了一套高
效的胚状体再生体系 ,为黄花乌头的快速繁殖和细
胞工程奠定了基础。
1 　材料与方法
黄花乌头块根采自沈阳药科大学药用植物园 ,
在培养室中用含有 GA (gibberellic acid ,100 mg/ L )
和 MS(Murashige and Skoog ,1962)培养基大量元素
的溶液连续浇灌 30 d ,块根解除休眠 ,获得新生成的
嫩茎和叶片。
黄花乌头种子用含有 GA (100 mg/ L ) 的温水
(24 ℃) 浸泡 72 h ,用 215 % NaClO4 溶液消毒 20
min ,接种到 MS 培养基上 ,30 d 后长出约 2～3 cm
的无菌苗。
111 　愈伤组织的诱导与筛选 :本实验用正交设计综
合考察了植物激素对黄花乌头嫩茎愈伤组织诱导的
影响 ,在 MS 培养基中添加 4 种不同浓度的植物激
素 ,实验设计[L9 (34) ]见表 1。
表 1 　正交设计表中的激素水平
Table 1 　Hormone level in orthogonal design
水平
因　　素
2142D
/ (mg·L - 1)
62BA
/ (mg·L - 1)
NAA
/ (mg·L - 1)
KT
/ (mg·L - 1)
1 0 　　　0 0 　　　1
2 1 015 2 012
3 2 1 4 015
　　将黄花乌头的嫩茎、叶片、侧根 ,无菌苗的胚根、
胚轴、子叶 ,接种于附加 2 , 42D 1 mg/ L , 62BA 015
·339·中草药 　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 35 卷第 8 期 2004 年 8 月
mg/ L 的 MS 固体培养基上培养。将获得的愈伤组
织转移至 MS + 2 ,42D 012 mg/ L + 62BA 015 mg/ L
的培养基上连续继代 ,获得胚性愈伤组织。除另有
说明外 ,本实验培养条件均为 23～25 ℃,暗培养 30
d 后统计其愈伤组织诱导率。
112 　体细胞胚的分化及其植株再生 :将胚性愈伤组
织转移到 MS + 62BA 2 mg/ L 培养基上诱导不定芽。
不定芽在 MS + IBA 015 mg/ L 的培养基上生根。
2 　结果与分析
211 　愈伤组织的诱导及培养 :正交设计直观分析 ,以
愈伤组织诱导率为指标 ,4 种植物激素对黄花乌头嫩
茎脱分化影响力大小依次是 :62BA > 2 ,42D > NAA >
KT ,较好的组合为 62BA 和 2 ,42D (表 2) 。在细胞分
裂素质量浓度一定的情况下 ,如培养基中生长素的质
量浓度过高 ,愈伤组织诱导率显著下降 ,如 7 号实验
组 2 , 42D 2 mg/ L , NAA 4 mg/ L 时 ,诱导率仅为
2816 %。在一定质量浓度的生长素存在下 ,62BA 具
有较显著的促进愈伤组织生成的作用。本研究选择
愈伤组织诱导时的激素质量浓度为 2 ,42D 1 mg/ L ,62
BA 015 mg/ L ,继代培养、胚性愈伤组织筛选时的激素
质量浓度为 2 ,42D 012 mg/ L ,62BA 015 mg/ L。
表 2 　正交设计中植物激素对愈伤组织诱导的影响
Table 2 　Effect of phytohormones on callus induction
of A1 coreanum in orthogonal design
编号
2 ,42D
/ (mg·L - 1)
62BA
/ (mg·L - 1)
NAA
/ (mg·L - 1)
KT
/ (mg·L - 1)
诱导率
/ %
1 　　0 　　0 　　0 　　0 　0
2 0 015 210 012 4414
3 0 110 410 015 7313
4 1 0 210 015 5817
5 1 015 410 0 7718
6 1 110 0 012 8416
7 2 0 410 012 2816
8 2 015 0 015 4416
9 2 110 210 0 5412
Ⅰj 11717 8619 12910 132
Ⅱj 22017 16616 15619 15716
Ⅲj 12712 21211 17917 178
Rj 103 12512 5017 46
　　将黄花乌头的嫩茎、叶片、侧根 ,无菌苗的胚根、
胚轴、子叶 ,接种于附加 2 , 42D 1 mg/ L , 62BA 015
mg/ L 的 MS 固体培养基上 ,在 (2315 ±1) ℃培养 28
d ,获得白色、表面光滑、向四周扩散生长的愈伤组
织。但不同外植体愈伤组织的诱导率有显著差异 :
胚轴诱导率最高 (100 %) ,侧根诱导率为 0 ,结果见
图 1。
将获得的愈伤组织转移至 MS + 2 ,42D 012 mg/
L + 62BA 015 mg/ L 的培养基上连续继代两次后形
成淡黄色或淡绿色、生长紧密、分散性较差、表面有
圆锥状或球状突起的愈伤组织 ,这些圆锥状或球状
的突起较容易从愈伤组织表面脱落 ,在 MS 基本培
养基上单独培养这些颗粒 ,可部分获得再生植株 ,因
此可认定这些愈伤为胚性愈伤组织 (图 2) 。
图 1 　不同外植体对愈伤组织诱导的影响
Fig11 　Effect of different explants on callus
induction of A1 coreanum
图 2 　胚性愈伤组织
Fig12 　Callus from embryoid of A1 coreanum
212 　体细胞胚胎分化及其植株再生 :将上述胚性愈伤
组织转接到附加 62BA、NAA 的 MS 培养基中 ,在
1 000～1 500 lx 光照强度下培养 10 d 左右 ,上面的突
起膨大 ,变为绿色 ,且在其基部又有突起生成 ,30 d 后 ,
形成丛生的不定芽。在不同 62BA、NAA 配比的培养基
上胚性愈伤组织的分化情况有所不同 :62BA 质量浓度
为 2 mg/ L 时分化率较高 ( > 70 %) ,附加 012 mg/ L 的
NAA 能获得较多完整的再生植株 ;仅加 NAA 时 ,只形
成短粗的圆锥根状物 ,结果见表 3。　　
表 3 　不同植物激素对胚性愈伤组织分化的影响
Table 3 　Effect of phytohormones on differentiation
of embryonal callus
激素质量浓度/ (mg·L - 1) 接种个数 分化个数 小植株生成数
62BA210 24 18 4
62BA210 + NAA015 22 16 6
62BA210 + NAA012 25 18 8
62BA110 + NAA015 20 12 2
62BA015 + NAA015 22 10 2
NAA210 24 16 0
　　将未形成完整植株 ,但形成不定芽的胚性愈伤
·439· 中草药 　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 35 卷第 8 期 2004 年 8 月
组织切割其不定芽转移至 MS + IBA (indole232acetic
acid) 015 mg/ L 培养基上培养 ,30 d 后能够长出数
条 3～5 cm 的根 ,形成再生植株 (图 3) 。
图 3 　胚性愈伤组织发育的芽
Fig13 　Adventitious shoots from embryoid
callus of A1 coreanum
3 　讨论
由植物的器官、组织、外植体以及悬浮培养细胞
和原生质体形成的胚 ,统称为体细胞胚或胚状体 ,以
区别于精子和卵子通过受精作用而形成的合子胚。
植物通过体细胞胚胎发生途径形成再生植株已是极
其普遍的现象 ,这一发育途径为研究植物细胞的分
化、发育、全能性表达和作物品种改良 ,突变体筛选
等提供了良好的实验体系 ,在理论上和应用上都具
有重大意义[4 ] 。利用体细胞胚胎发生技术获得药
用植物的再生植株 ,已引起众多的中医药学家和药
用植物学家们的高度关注 ,近年来也取得了很多成
功的实例。杨金玲[5 ]等通过筛选水母雪莲的愈伤
组织 ,获得胚性愈伤组织 ,将其转移到分化培养基上
获得大量的体细胞胚 ,进而得到大量的再生植株。
李建民[6 ]等以龙芽的幼芽为外植体 ,诱导出胚性愈
伤组织 ,并以体细胞胚胎发生途径再生出新的植株。
植物组织、器官的脱分化是一个极其复杂的过
程 ,其中植物激素对脱分化过程起着重要的调节
作用。目前对于生长素与细胞分裂素对愈伤组织诱
导和体细胞胚胎发育调节机制的研究已上升到分子
水平。研究结果表明 :适量的生长素可激活某些特
定基因表达产生特异蛋白 ,促进组织的脱分化和体
细胞胚胎的发育 ,浓度过高则抑制这些基因的表达
且可能刺激另一些基因的表达 ,从而抑制组织的脱
分化和体细胞胚胎的发育 ,表现出对基因表达的时
空特异性[7 ,8 ] 。
本实验对黄花乌头外植体脱分化形成胚性愈伤
组织及胚性愈伤组织分化过程进行了研究 ,从胚性
愈伤组织可直接获得再生植株 ,也可获得不定芽进
而获得再生植株。从而为今后进行黄花乌头的快速
繁殖、细胞工程育种、体细胞胚胎发育与调控机制的
研究提供了有价值的研究资料 ,也为该具有重要新
药开发价值的药用植物的资源利用和保护开辟了新
的途径。
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