全 文 ：中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第8期2005年8月·1225·
0．236％，但未见后续报道。本实验体系中喜树碱量
仍低于野生植株，因此有必要从改进培养方式和代
谢调控等诸多方面对喜树细胞悬浮培养体系进行深
人研究以期提高其喜树碱量，为喜树细胞体外培养
生产的工业化提供技术支持。
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罗汉果脱毒苗的快速繁殖研究
付长亮1，马小军¨，白隆华2，缪剑华2，宋经元1
(1．中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所，北京100094；2．中国医学科学院中国协和医科大学药用
植物研究所广西分所广西药用植物园，广西南宁 530023)
摘要：目的筛选适宜的罗汉果脱毒苗茎段增殖培养基，研究培养温度与光照对茎段增殖培养的影响。方法采
用正交试验设计和完全随机实验设计筛选罗汉果脱毒苗茎段增殖培养基。正交L。(34)实验以在MS+BA0．1mg／
L+NAA0．1mg／L上培养30d的罗汉果脱毒苗单芽姊妹系的单节茎段为外植体，以培养基中BA，NAA，IBA及
蔗糖为试验因子，各因子设3个水平，以在不同处理得到的增殖系数为测定指标；在此基础上进一步研究了培养基
中BA和蔗糖质量浓度对增殖效果的影响；采用完全随机实验设计研究温度，光照对茎段增殖培养生成试管苗的
影响。结果 通过对正交实验结果的极差分析及方差分析表明，在4个因子中，对罗汉果茎段增殖系数影响最大的
是BA，其次是蔗糖的NAA，IBA的影响最小；BA，NAA，IBA及蔗糖对增殖系数的影响都达到极显著。根据新复极
差检验的结果，当前研究得到的罗汉果离体茎段的最佳增殖培养基为MS+BA0．5mg／L+NAA0．01mg／L+
IBA0．1mg／L+蔗糖40g／L，罗汉果茎段在此培养基上培养30d后增殖系数为13．13；不同浓度BA与蔗糖对茎
段培养的研究结果表明，BA在1．0mg／L增殖系数最大。考虑为保持试管苗的遗传稳定性，BA为0．5mg／L为宜。
增殖培养基中的蔗糖适宜质量浓度为4．o％；罗汉果茎段培养适宜条件为培养温度25．c，培养光强10003000
lx。结论 增殖培养基的成功筛选及培养温度与光强的选择，有助于实现罗汉果脱毒苗的工厂化生产。
关键词：罗汉果；脱毒苗；茎段培养；快速繁殖
中图分类号：R282．21 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)08—1225一05
RapidpropagationofMomordicagrosvenorivirus-freeplantlets
FUChang—lian91，MAXiao—junl，BAILong—hua2，MIAOJian—hua2，SONGJing—yuanl
(1．InstituteofMedicinalPl ntDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，
收稿日期：2004—1l—02
*通讯作者马小军Tel：(010)62890692E—mail：xjma@public．bta．net．cn
万方数据
·1226· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第8期2005年8月
Beijing100094，China；2·GuangxiBranch，InstituteofMedicinalPl nt，GuangxiBotan calGr rden
ofMedicinalPl nts，ChineseAcad myofMedicinalSciences，Nanning530023，China)
Abstract：ObjectiveTosift h fittingshootsegmentmultiplyingculturemediaofMomordica
grosvenorivirus——freeplantletsandtostudytheffectof emperaturendlightontheshootsegmentmulti．．
plyingculture．MethodsTheselectionofthefittingshootsegmentmultiplyingculturemediaw studied
byorthogonaltestdesignandcompletelyrandomexperimentaldesign．Singlenodesofvirus—freeplantlets
fromsingle—budsibling—lineculturedonMS+BA0．1mg／L+NAA0．1mg／Lforonemonthwereusedas
explants，multiplyingcoeffic entofdifferenttreatmentasi dexofthe xperiment，andtheffectsoffour
factors，namelyBA，NAA，IBA，andsucrosewereevaluatedbyL9(34)orthogonaldesign．Onthebasisof
theresultoforthogonaltestthedifferentco centrationBAandsucroseaffectingonthegrowthofregener—
atedplantletsw retudied，thentheffectof emperaturendlightonthegrowthofregeneratedplantlets
werestudied．ResultsThextremedeviationanalysisandthevarianceanalysisoftheorthogonaltestre—
sultsshowedthatBA，NAA，IBA，andsucrosewereveryconsiderable．BAhadthegreatesteffect，fol—
Iowedbysucrose，NAA，andIBA．ThefurtheranalysisofSSRtestappearedthbestmediumwasthe
combinationofA381C3D3(MSsupplementedwith0．5mg／LBA，0．01mg／LNAA，O．1mg／LIBA，40g／
Lsucrose。onwhichM．grosvenoricouldmultiply13．13timesofter30d．Ther sultsofBAaffectingon
thegrowthofregeneratedplantletshowedthat1．0mg／Listhemost，followedby0．5mg／L．Tokeepthe
hereditaryst bilityinregeneratedplantlets，theop imizedconcentrationofBAshouldbe0．5mg／L．The
optimizedconcentrationofsucrosewas4％．Theoptimizedtemperaturendlightare25℃，lOOO一3000
lx．ConclusionTheselectionofshootsegmentmultiplyingculturemedia，temperature，andlightelpsto
producelarge—scalevirus—freese dlingsofM．grosvenori．
Keywords：MomordicagrosvenoriSwingle；virus-freeplantl ts；shootsegmentculture；rapidpro a—
gation
罗汉果MomordicagrosvenoriSwingle是我国
特有的葫芦科多年生草质藤本植物，以果实人药，具
有止咳祛痰，润肠通便等功效。罗汉果是异花授粉植
物，在生产中以种植雌株为主。由于种子繁殖后代中
雄株比例偏高，因此实际生产中主要采取压蔓等营
养繁殖的方式生产种苗，繁殖系数低，且易患病毒
病。病毒在植物体内世代累积，导致品种退化，质量
下降，产量锐减。离体脱毒培养既能生产大量优质种
苗，同时也是解决罗汉果病毒病的根本途径。
前人曾就罗汉果的组织培养进行了多方面的探
索[1~5]，并进行了茎尖脱毒培养及病毒检测研
究[6‘7]，但对于脱毒苗的快速繁殖未见有系统研究报
道。因此，本实验在培养得到罗汉果脱毒苗的基础
上，对罗汉果离体茎段增殖培养的影响因素进行了
研究，以期从多个因素中找出影响实验结果的各因
素的主次顺序，筛选适宜的罗汉果脱毒苗茎段增殖
培养基，并在此基础上，进行了不同培养温度，不同
培养光强的实验。以期快速生产高质量的罗汉果试
管苗，为实现脱毒苗的工厂化生产奠定基础。
1材料与方法
1．1 实验材料：研究所用材料采自罗汉果主产区广
西永福县龙江乡，经马小军研究员鉴定。罗汉果脱毒
培养参照相关文献[6’7]，经病毒检测筛选得到脱
毒苗。
1．2 单芽姊妹系的建立；参照HaoE83等建立单芽姊
妹系的方法，选取生长健壮的罗汉果脱毒苗的单节
茎段培养在MS+BA0．1mg／L+NAA0．1mg／L
培养基上，对得到试管苗进行2次茎段增殖培养，最
终所得试管苗为罗汉果脱毒苗单芽姊妹系。
1．3增殖培养基的筛选
1．3．1正交实验：选用L。(34)正交设计(表1)，以
BA(A)、NAA(B)、IBA(C)与蔗糖(D)为试验因子，
各因子设3个浓度，以培养30d后的增殖系数为考
察指标。截取在MS+BA0．1mg／L+NAA0．1
mg／L培养30d的罗汉果单芽姊妹系的单节茎段，接
种至含30mL增殖培养基的100mL锥形瓶中。
1．3．2BA及蔗糖质量浓度对茎段培养的影响：在
正交实验得到的最佳培养基础上对培养基的BA和
蔗糖对茎段培养生成试管苗生长的影响进行了进一
步分析。
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第8期2005年8月·1227·
表1 罗汉果茎段增殖正交试验L，(34)设计
Table1 DesignofLq(34)orthogonaltestofshoot
segmentmultiplificationofM．grosvenori
1．4培养温度和光强对再生试管苗的影响：在获得
适宜的茎段增殖培养基基础上，进行了不同培养温
度实验，设4个温度处理，分别是15、20、25、30℃；
根据不同温度实验结果选择适宜培养温度，进行不
同培养光强实验，设4个处理，分别是500、1000、
2000、3000lx。
1．5培养基及培养条件：本实验以MS为基本培养
基，附加不同浓度的蔗糖和激素(BA、NAA、IBA)及
8g／L琼脂，pH在加入琼脂及灭菌前调节至5．9，
121。C灭菌18rain。除特别注明外，培养温度为
(25±2)℃，光强为1500lx，12h／d光照。
1．6数据分析：上述实验各处理接种25个茎段，重
复3次；在培养30d后记录外植体的增殖系数(以
一个单节茎段(茎尖)为一个增殖单位)以及生成试
管苗的生长情况；使用SPSS11．0软件对所得数据
进行处理：对正交实验结果进行极差分析，多因素方
差分析及多重比较(新复极差检验)；对其它实验结
果的增殖系数进行单因素方差分析及多重比较(新
复极差检验)。
2实验结果
2．1增殖培养基的筛选
2．1．1不同因子对增殖系数影响的分析：增殖培养
的正交实验结果如表2所示。极差分析结果为ReA一
3．767；RNAA一2．554；RIBA一0．717；R蔗糖一3．612，对
罗汉果茎段增殖率影响最大的因素是BA，其次是
蔗糖和NAA，IBA的影响最小。
2．1．2最佳激素组合的选择：为分析各因素水平间
差异及选出最优组合，进行了方差分析(表3)及新
复极差检验(表4、5)。方差分析结果表明，BA、
NAA、IBA及蔗糖对罗汉果茎段培养增殖系数的影
响达到极显著(P<0．01)。新复极差检验的结果表
明，BA的水平3极显著优于水平1、2；NAA的水平
l极显著优于水平2、3；IBA的水平3极显著优于水
平1、2；蔗糖的水平3极显著优于水平1、2。基于上
述分析，当前研究得到的罗汉果茎段快速繁殖的最
优组合为A。B。C。D。(不在实验出现的处理中)，即
MS+BA0．5mg／L+NAA0．01mg／L+IBA0．1
mg／L+蔗糖40g／L。
表2 罗汉果茎段增殖的正交试验L，(34)结果
Table2 Resultofshootsegmentmultiplication0f
M．grosvenoriinL9(34)orthogonaltest
试验
处理
因素／(mg·L．1) 增殖系数’
A B C D I Ⅱ Ⅲ
3．64
5．24
5．66
0．12
6．12
7．08
0．64
0．44
5．00
*增殖系数=增殖节数／接种茎段
*Multiplyingcoefficient—totalnumberofmultiplyingminicut—
tings／totalnumberofinoculationmini—cuttings
表3不同因素对罗汉果增殖研究的方差分析
Table3 Varianceanalysisofdifferentfac ors
inmultiplicationofM．grosvenori
*士’0．01(2，18)一6．01*Pd0·01
2．1．3最佳组合增殖效果的验证：以筛选出的最佳
组合配制培养基，对同上述实验所用相同培养条件
的材料进行增殖培养，共接种15瓶，每瓶接5株。30
d后观察，生成苗植株健壮，统计其增殖系数为
13．13。这一结果表明利用正交设计筛选罗汉果增殖
培养基的工作是成功的。
表4培养基中BA和NAA对罗汉果脱毒苗增殖系数影响的新复极差检验
Table4 Effectofdifferentco centrationofBAandNAAonmultiplyingcoefficientbySSRest
差异显著性 差异显著性
水平 BA／(mg·L一1)增殖系数 水平NAA／(mg·L_1)增殖系数
a一0．05a一0．01 a一0．05 a一0．01
3 0．5 8．704 a A 1 0．01 8．161 a A
2 0．3 7．666 b B 2 0．05 7．539 b B
1 0．1 4．937 C C 3 0．10 5．607 C C
万方数据
·1228· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第8期2005年8月
表5培养基中IBA和蔗糖对罗汉果脱毒苗增殖系数影响的新复极差检验
Table5 Effectofdifferentco centrationofIBAa dsucrosenmultiplyingcoefficientbySSRest
差异显著性
水平 蔗糖／(mg．L一·)增殖系数
差异显著性
水平 IBA／(rag·L一1)增殖系数
Ⅱ一0．05 Q=0．01a一0．05n一0．01
3 0．10 7．548 a A 3 40 8．736 a A
2 0．05 6．928 b B 2 30 7．447 b B
1 O．01 6．831 b B 1 20 5．124 c C
2．2不同质量浓度BA对茎段培养的影响：正交试
验结果表明增殖系数随着培养基中BA的提高而增
加，为此以正交实验得到的最佳增殖培养基为对照，
研究了较高质量浓度BA对茎段培养生成试管苗生
长的影响。不同BA对茎段培养生成的试管苗的影
响见表6，结果表明当增殖培养中BA达到1．0mg／
L时增殖系数达到最大，随着BA进一步增加对试
管苗的增殖系数和生长都产生了不利影响，特别是
BA较高时，产生大量的畸形苗，不利于生产，更会
影响试管苗的遗传稳定性。基于此考虑，同时因为
BA为1．0mg／L与0。5mg／L时增殖系数差异不
大，罗汉果茎段增殖培养时所用BA以0．5mg／L
为宜。
表6不同BA浓度对罗汉果茎段培养生成
试管苗生长的影响
Table6 Effectofdifferentco centrationofBAon
growthof-regeneratedplantletsfromhoot
segmentcultureofM·grosvenori ’
2．3不同蔗糖浓度对茎段培养再生试管苗的影响：
正交实验结果表明随着培养基中蔗糖质量浓度的提
高增殖系数亦增加，为了研究继续提高蔗糖质量浓
度能否有利于提高试管苗的增殖系数，在正交实验
得到最佳培养基基础上研究了不同蔗糖质量浓度对
罗汉果茎段培养的影响。实验结果见表7，随着蔗糖
质量浓度的提高，生成试管苗的增殖系数先增加达
到13．67±0．64，随后较显著降低；当蔗糖较高时，
生成较多的畸形苗，试管苗颜色淡黄。当培养两个月
时观察，高质量浓度蔗糖处理试管苗死亡率明显高
于较低质量浓度处理。综合分析各指标，蔗糖为
4．0％最适于罗汉果试管苗的增殖繁殖。
2．4不同培养温度对茎段培养的影响：不同培养温
度对罗汉果茎段生成试管苗生长的影响见表8。温
表7不同蔗糖浓度对罗汉果茎段培养生成
试管苗生长的影响
Table7 Effectofdifferentco centrationofsucrosen
growthofregeneratedplantletsfromhoot
segmentcultureofM．grosvenori
表8不同培养温度对罗汉果茎段培养生成
试管苗生长的影响
Table8 Effectofdifferentt mperatureongrowth
ofregeneratedplantletsfromhoot
segmentcultureofM．grosvenori
度对茎段培养影响很大，不同温度培养条件下得到
的增殖系数差异达到极显著(P
步继代培养，且生成畸形苗较多；较高温度(30‘C)
生成试管苗生长较好，特别是叶片较大，但是此温度
培养试管苗增殖系数低于25℃培养试管苗增殖系
数。综合分析，25℃左右是较适宜的培养温度。
2．5不同光强对茎段培养的影响：不同光强对罗汉
果茎段生成试管苗生长的影响见表9。培养光强较
低时，生成试管苗较高，叶片较小，节间距明显大于
其他处理(P<0．05)，造成这一现象的原因应是由
于培养光强低，造成试管苗的徒长。光强的增加有力
于茎段生成试管苗的生长，3000lx培养条件下的
试管苗生长最健壮。考虑到3000lx时试管苗生长
为1000、2000lx增殖系数差异较小，在实际工作
中根据最大限度降低成本以获得最大收益的原则，
可依具体培养条件在1000～3000lx范围选择适
当的光强。
3讨论
3．1 建立罗汉果单芽姊妹系的意义：本研究在获得
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第8期2005年8月·1229·
表9不同培养光强对罗汉果茎段培养生成
试管苗生长的影响
Table9 Effectofdifferentlightintensityongrowth
ofregeneratedplantletsfromhootsegment
cultureofM．grosvenori
罗汉果脱毒苗基础上，建立了脱毒苗的单芽姊妹系，
以保证实验材料的遗传一致性，减少对实验结果的
干扰，并有利于进一步开展试管苗遗传稳定性研究。
3．2正交试验的优点：本研究表明正交试验是一种
理想的优化试验设计方案，采用正交试验，能够以较
少的次数，从多个因素中找出影响试验结果的各因
素的主次和最优结果。本实验得到的最优结果不在
所设计的9种培养基中，进一步证明了采用正交试
验，有利于以较少试验次数从较多组合中筛选罗汉
果茎段最优增殖培养基。
3．3适宜浓度的细胞分裂素的选择：带节茎段的离
体快繁一般采用两种方法，一种是采用较高浓度的细
胞分裂素诱导从生芽，一种是利用低浓度细胞分裂素
诱导腋芽生成单苗。前者繁殖系数较高，但高浓度的
细胞分裂素导致生成芽易于畸变，发生变异可能性较
大，且对芽的生长有一定抑制作用[9]，特别是有些培
养物生成的丛生芽生长缓慢，需要转移至“芽生长培
养基”才能成苗[10’11]；后者采用较低浓度的细胞分裂
素，试管苗生长较高，更适合工厂化生产。本研究在对
这两种方法进行了研究，结果表明较低质量浓度BA
对增殖效果有利，培养的试管苗生长也很好，而高质
量浓度BA不利于茎段增殖培养，生成畸形苗较多，
对生成的试管苗生长不利。因此，为保证遗传稳定性
及利于工厂化生产高质量的种苗，罗汉果脱毒苗的快
速繁殖应使用较低浓度细胞分裂素。
3．4蔗糖在离体培养中的作用：过去一般认为，蔗
糖在培养基中的作用是提供营养成分及调节渗透
压。已有研究证明，培养基中蔗糖质量浓度可调节试
管内源激素的水平和比例，从而影响器官的分化和
生长[12I。Liao等D3]在研究中国芦荟的离体增殖培养
时发现，蔗糖是BA、NAA及蔗糖3因素中对增殖
系数影响最大的因素。笔者的研究结果也证明蔗糖
对罗汉果茎段增殖培养具有非常重要的作用，建议
在组织培养研究中应重视蔗糖的作用。
3．5畸形苗问题：在此提出的畸形苗是指茎段增殖
培养生成的植株矮小(培养一个月苗高度小于o．5
cm)，茎膨大，节间距极短，不适于继代培养的试管
苗(相关研究另文报道)。为保证试管苗的遗传稳定
性，以得到优质的罗汉果种苗，在培养中应采取适宜
的条件，尽可能降低畸形苗的发生率，同时对生成的
畸形苗及时发现、清除。
罗汉果脱毒快繁的系统研究为脱毒苗的快速繁
殖，特别是为优良单株的快速繁殖提供了有效的技
术手段。其在生产上的应用和推广，以及简化培养基
从而降低生产成本，有待于进一步研究。
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万方数据
罗汉果脱毒苗的快速繁殖研究
作者： 付长亮， 马小军， 白隆华， 缪剑华， 宋经元， FU Chang-liang， MA Xiao-jun， BAI
Long-hua， MIAO Jian-hua， SONG Jing-yuan
作者单位： 付长亮,马小军,宋经元,FU Chang-liang,MA Xiao-jun,SONG Jing-yuan(中国医学科学院,中
国协和医科大学药用植物研究所,北京,100094)， 白隆华,缪剑华,BAI Long-hua,MIAO
Jian-hua(中国医学科学院,中国协和医科大学药用植物研究所广西分所,广西药用植物园,广
西,南宁,530023)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(8)
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本文读者也读过(10条)
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