全 文 ：552157X - 01199, r= 01999 9, 线性范围为 0106～
2102 Λg。
214　精密度试验: 精密吸取上述对照品溶液 2 ΛL ,
连续进样 5 次, 以峰面积计算, R SD = 0192% , 表明
分析结果的精密度良好。
215　重现性试验: 取同批次狭基线纹香茶菜药材样
品 5 份, 按 212 项下方法制备供试液, 进样 5 ΛL , 测
得 2Α2羟基熊果酸的平均含量为 01915 4 m gög,
R SD = 0156% , 重现性符合要求。
216　稳定性试验: 精密吸取同一批次样品溶液 5ΛL , 分别于样品溶液配制后 0, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 h
进行测定, 以峰面积计算, R SD = 1117% , 表明样品
溶液放置 48 h 稳定。
217　回收率试验: 精密称取 5 份已知 2Α2羟基熊果
酸含量的狭基线纹香茶菜 0125 g, 分别准确加入
2Α2羟基熊果酸对照品 015 m g, 按 212 项下方法制
备供试液, 进样 5 ΛL , 测定峰面积, 结果平均加样回
收率为 9913% , R SD = 2171%。
218　样品测定: 取广东清远 GA P 基地不同批次
(以采收日期编号)狭基线纹香茶菜 015 g, 按 212 项
下方法制备供试液, 进样 10 ΛL , 进行测定, 按外标
法以峰面积积分值计算 2Α2羟基熊果酸的含量, 实
验结果见表 1。
3　讨论
311　首次建立了采用 R P2H PL C 法测定狭基线纹
香茶菜中 2Α2羟基熊果酸含量的测定方法。比较了
不同溶剂系统和比例的流动相, 如甲醇2水, 乙腈2甲
醇2水, 乙腈2011% 盐酸溶液, 乙腈20105% 三氟乙酸
溶液, 结果表明: 在波长 210 nm , 流速 018 mL öm in,
柱温 25 ℃, 乙腈20105% 三氟乙酸溶液 (7015∶
2915)为流动相的条件下, 可以对狭基线纹香茶菜中
表 1　广东清远 GAP 基地狭基线纹香茶菜中
2Α-羟基熊果酸的含量 (n= 3)
Table 1　Con ten ts of 2Α-hydroxy-ursol ic ac id in R.
lop han thoides var. gera rd ianus in GAP base
in Qingyuan of Guangdong Prov ince (n= 3)
批号 采收日期 2Α2羟基熊果酸含量ö% RSD ö%
1 07225 0. 235 1 1. 34
2 08217 1. 934 2 0. 93
3 08225 1. 372 4 2. 12
4 09201 0. 617 2 1. 16
5 10208 0. 547 9 0. 78
2Α2羟基熊果酸定量测定, 且简便、快速、无干扰, 重
现性好, 结果准确。
312　本实验以狭基线纹香茶菜中 2Α2羟基熊果酸
的含量为指标, 筛选并确定了用甲醇 30 m in 重复加
热回流提取两次的最佳提取方法。
313　不同采收期 GA P 基地狭基线纹香茶菜样品,
其 2Α2羟基熊果酸成分以 8 月份含量为高, 8 月中旬
含量最高, 即开花前枝叶繁盛期为狭基线纹香茶菜
的最佳采收期。并提示 2Α2羟基熊果酸可能在叶中
的含量较高, 有关研究另见报道。
References:
[ 1 ]　J iangsu N ew M edical Co llege. D ictionary of Ch inese M ateria
M ed ica (中药大辞典) [M ]1 Shanghai: Shanghai Scien tific
and T echn ical Pub lishers, 19971
[ 2 ]　J in R L , Cheng P Y, Xu G Y, et a l. A Study on the compo si2
t ions of rabdo serrin B [J ]1 Ch ina J Ch in M ater M ed (中国中
药杂志) , 1987, 13 (10) : 391
[ 3 ]　J in R L , Cheng P Y, Xu G Y, et a l. A study on the compo si2
t ions of rabdo serrin A [J ]1 A cta P harm S in (药学学报) ,
1985, 20 (5) : 3661
[ 4 ]　H unan Pub lic H ealth Bureau. T he S tand ard of Ch ineseM ed ic2
ina l M a teria ls H erbs in H unan (湖南省中药材标准) [M ]1
Changsha: H unan Science and T echno logy P ress, 19931
[ 5 ]　Chen J N , L ai X P, L iu N. T he investigation of o rig inal flo ra
of L inearstrip e R abd osia H erbs and the determ ination of com 2
modities of Guangdong [J ]1 J Ch in M ed M ater (中药材) ,
1996, 19 (2) : 732741
甘草的免疫学鉴定方法研究
白　钢1, 曹学琳1, 杨文博1, 唐元泰2, 芮　菁2, 梁会旭2Ξ
(11 南开大学生命科学学院, 天津　300071; 21 天津市药品检验所, 天津　300070)
摘　要: 目的　利用种属特异性蛋白建立一种生药甘草的免疫学鉴定方法。方法　选用生药甘草为实验对象, 利用
抗甘草总抗原血清并结合W estern2blo t 的结果确定甘草种属特异性蛋白 (R GP)。分离纯化该蛋白抗原并制备和生
物素标记其特异性抗体, 建立夹心式 EL ISA 法用于甘草的分析鉴定。结果　该方法灵敏度高、专属性强, 对不同产
·38·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 1 期 2004 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2003204211
基金项目: 天津市自然科学重点基金资助项目 (003805311)
作者简介: 白　钢 (1967—) , 男, 药学博士, 南开大学生命科学学院教授, 博士生导师, 主要从事现代生物技术与中药现代化的研究。
E2m ail: gangbai@eyou. com
地及品种的甘草显示了良好的特异性, 可以用于生药的鉴定和分析。结论　以甘草自身的特异性蛋白为指标的免
疫学分析方法, 将为生药甘草的品种鉴定及中药材的质量管理提供一条新的途径。
关键词: 特异性蛋白; 甘草; EL ISA
中图分类号: R 282171013　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 01 0083 04
Study on imm unoa ssay m ethod for R ad ix G lycyr rh izae iden tif ica tion
BA I Gang1, CAO Xue2lin1, YAN G W en2bo 1, TAN G Yuan2ta i2, RU I J ing2, L IAN G H u i2xu2
(1. Co llege of L ife Science, N ankaiU niversity, T ian jin 300071, Ch ina; 2. T ian jin Inst itu te
fo r D rug Contro l, T ian jin 300070, Ch ina)
Abstract: Object　To develop an imm unoassay m ethod of species2specif ic p ro tein fo r R ad ix G ly 2
cy rrh iz ae (R G) iden t if ica t ion. M ethods　T he crude drug of R G as a model w as studied in th is paper, the
an t igen of R G p ro tein (R GP) w as screened by W estern2b lo t analysis u sing an t i2R G serum. A fter species2
specif ic p ro tein, R GP w as pu rif ied, and rabb it an t iserum again st R GP w as p repared, the rabb it IgG of an2
t i2R GP w as iso la ted and b io t inyla ted, then the sandw ich enzym e2linked imm uo so rben t assay (EL ISA ) w as
developed. Results　T he m ethod w as on ly specif ic to R G, w h ich w as harvested from variou s areas o r
species, and show ed excellen t sen sit ivity and rep roducib ility. Conclusion 　T he resu lt suggests tha t the
imm unoassay m ethod u sing specif ic an t igen of R GP as a detect ion ob ject ive be a new po ten t ia l fo r the un2
equ ivocal iden t if ica t ion and quality con tro l of R G.
Key words: specif ic p ro tein; R ad ix G ly cy rrh iz ae (R G) ; EL ISA
　　生物物种的多样性基于基因的多态性, 而基因
的多态性可以体现在形态、组织、染色体、分子和化
学成分等不同的水平上。分子生物学技术的发展使
中药的鉴定从传统的形态表征、理化性质的判别扩
展到对生药生物信息大分子, 如DNA、RNA 和蛋白
质等生命信息载体的研究。作为三级信息物质, 蛋白
质能更好地反映了种属之间的关系, 是可靠的分类
学指标, 同种生药也往往含有结构相同或相似的蛋
白质组以区别于其他种属的药材, 但长期以来在中
药的鉴定中却一直被忽视。本题选用生药甘草为例,
筛选和分离其种属特异性蛋白抗原, 建立快速、灵
敏、特异的免疫学鉴定方法, 从蛋白质水平上进行中
药材鉴别, 为生药品种鉴定提供一种新的可能性。
1　材料和方法
111　材料: 内蒙、赤峰和东北 3 种不同产地的乌拉
尔甘草 G ly cy rrh iz a u ra lensis F isch. 以及黄果甘草
G. korsh insky i G. Grig、光果甘草G. g labra L. 、胀
果甘草G. inf la ta Batal, 分别由天津市药品检验所
提供, 其他生药 (桃仁、三七、人参、苦参、泽泻、天花
粉、没药)购于中国药品生物制品检定所。
112　试剂: 弗氏佐剂 (G IBCOBRL ) ; 活化生物素 (su l2
fo2N H S2L C2B io t in EZ2L inkTM , P IERCE ) ; 硝酸纤
维素膜 (M ILL IPOR E) ; 辣根过氧化物酶 (HR P) 标
记羊抗兔 IgG, 辣根过氧化物酶标记亲合素, 邻苯二
胺 (O PD ) , 3, 3′2二氨基联苯胺 (DAB ) , 牛血清白蛋
白 (BSA )购于华美生物工程公司 (国产) , 其他试剂
均为分析纯。
113　主要仪器: 酶标仪 (B io tech, EL X800) , 冷冻干
燥机 (Ch rist, AL PHA 1—4 ) , 高速冷冻离心机
(Beckm an, 20R P52D ) , 电泳及电转移系统 (国产) ,
超声波细胞粉碎仪 (国产)。
114　抗生药总抗原血清的制备: 取生药甘草的干燥
粉末 50 m g 于 5 mL PBS 中, 超声波提取。取上述提
取液 1 mL 与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后,
对家兔皮下进行多点注射。每隔两周加强注射一次,
定期测定抗血清效价, 待获得最高效价后, 收集血
清, 灭活, - 20 ℃保存备用。
115 　W estern2b lo t: 生药超声波提取液样品经
SD S2PA GE 电泳分离后, 将分离胶迅速电转移至硝
酸纤维素膜上。封闭后, 加入 1 000 倍稀释的上述抗
总抗原血清 10 mL , 室温反应 3 h。以 PBST 充分冲
洗后, 加入 1 000 倍稀释的辣根过氧化物酶标记的
羊抗兔 IgG 抗体溶液 10 mL , 室温继续反应 1 h, 充
分洗涤, 加入DAB 底物显色。
116　特异性抗体的制备及标记: 以精制的甘草特异
性蛋白 (R GP)为抗原免疫家兔制备抗血清。取上述
血清经硫铵盐析, 透析, 对D EA E2cellu lo se 52 离子
交换柱进行离子交换层析精制 IgG 抗体。取精制
IgG 抗体 30 m g, 溶于 011 mo löL N aHCO 3 (pH 815)
溶液 2 mL 中, 加入活化生物素 3 m g, 搅拌, 室温反
应 2 h, 加入甘氨酸 60 m g 终止反应。生物素标记抗
体经 50% 饱和硫铵沉淀 2 次后, 沉淀物以 2 mL
·48· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 1 期 2004 年 1 月
PBS 溶解, 透析后, - 20 ℃保存备用。
117　夹心式 EL ISA 方法的建立: 取 10 ΛgömL A n2
t i2R GP 抗体 100 ΛL 于酶标板的各孔中, 37 ℃, 放置
3 h, 包被酶标板。经 1% BSA 封闭后, 分别加入系列
稀释的 R GP (或样品) 100 ΛL , 37 ℃, 放置 1 h 后,
PBST 充分冲洗后, 分别加入 500 倍稀释的生物素
化A n ti2R GP 抗体 100 ΛL , 37 ℃, 放置 1 h。PBST
充分冲洗, 加入稀释 1 000 倍亲合素化辣根过氧化
物酶 100 ΛL , 反应 30 m in, PBST 充分冲洗后, 再加
入O PD 底物显色 4 m in, 以 2 mo löL H 2SO 4 终止反
应, 并于 490 nm 处测其吸光度。
2　结果与分析
211 　特异性抗原成分的鉴定: 分别将 R G21 (内
蒙)、R G22 (赤峰) 和 R G23 (东北) 3 种不同产地的乌
拉尔甘草及其他 7 种生药抗原样品进行 SD S2
PA GE 凝胶电泳和W estern2b lo t 分析 (图 1)。CBB
染色表明不同生药中存在多种不同蛋白成分, 而 3
种甘草样品在 32 和 28 kD a 处均呈现了两条相同的
主要蛋白带。W estern2b lo t 的结果也表明,A n t i2R G
血清与甘草的蛋白抗原均显良好的反应性, 同其他
生药不发生交叉反应。证明甘草具有特异性的种属
蛋白, 利用该蛋白可以进行甘草的免疫学鉴定。
12标准蛋白　22RG21　32RG22　42RG23　52桃仁　62三七
72人参　82苦参　92泽泻　102天花粉　112没药
　12m aker p ro tein　22RG21　32RG22　42RG23
　52peach seed　62P anax p seud og inserg　72P anax g inseng
　82S op hora f la rescens　92A lism a orien ta le
　102T h lad ian tha hookeri　112Comm ip hora my rrha
图 1　9 种生药的免疫印迹分析
F ig. 1　W estern blot analysis of n ine crude drugs
212　抗原成分的分离: 甘草粉末 2 g, 经 40 mL 蒸
馏水, 4 ℃, 3 次提取后, 合并提取液经 70% 硫铵盐
析, 离心, 沉淀用少量 PBS 溶解, 透析, 得粗提物。上
述粗提物经 Sephadex G275, D EA E2cellu lo se 52,
Sephadex G2150 分离, 分别以L ow ry 法检测蛋白含
量, 以 EL ISA 法测定抗原活性, R GP 的纯化倍数为
12标准蛋白　22天然RGP 蛋
白　32变性RGP 蛋白
12m arker p ro tein
22natu ral RGP
32denatu ration RGP p ro tein
图 2　甘草特异性蛋白的
电泳分析
F ig. 2 　 SD S-PAGE and
native PAGE
analysis of RGP
128 倍 (表 1)。电泳分析表
明R GP 的相对分子质量为
59 kD a, 由 32 和 28 kD a 亚
单位组成 (图 2)。
213　样品分析: 以未标记
的 A n ti2R GP 抗体作固相
抗体结合 R GP 抗原, 以生
物素化 A n ti2R GP 抗体结
合酶标亲合素检测其变化。
结果如图 3 所示, R GP 的
浓度在2～ 20 ngömL 范围
内与结合的HR P 酶活性呈
现良好的线性关系 ( Y =
01024 5X + 01017 4, r =
01999) , R SD < 510% (n =
6)。不同品种与产地的甘草
超声波提取液中R GP 含量
分 别 为 1718～ 8217 Λgö
mL , 而除甘草外的桃仁、三七、人参、苦参、泽泻、天
花粉、没药等多种生药均未呈现交叉反应, 证明该方
法具有良好的灵敏度和专属性 (表 2)。
表 1　特征抗原的纯化结果
Table 1　Pur if ica tion process of spec if ic an tigen
纯化步骤 蛋白含量öm g 抗原活性ö( IU ·mL - 1) 纯化倍数
Extract 　360 　 2. 52 　 1. 0
Salt ou t 72. 8 　 2. 85 1. 14
Sephadex G275 8. 71 19. 1 7. 65
D EA E2cellu lo se 6. 51 186　 74. 5
Sephadex G2150 5. 02 320　 128
图 3　RGP 的标准定量曲线
F ig. 3　Typ ica l dose respone curves of RGP
3　讨论
　　以往植物药材的鉴定及品质分析主要采用形态
学特征识别和小分子代谢产物的理化分析、色谱光
谱分析来进行药物评价[1 ]。近几年, 在《中华人民共
和国药典》中收录了中药材的 SD S2PA GE 电泳鉴定
方法并有相关报道[2 ] , 同时引入R FL P, RA PD 等分
·58·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 1 期 2004 年 1 月
子生物学检测技术[3, 4 ] , 但由于条件的限制和缺乏规
范化操作标准, 上述方法尚未能得到广泛应用。
表 2　不同生药的提取物中 RGP 含量的测定
Table 2　Con ten ts of RGP in extracts
from differen t crude drugs
　　甘草样品
含　量ö
(Λg·mL - 1) 对照药材 含　量ö(Λg·mL - 1)
GR 1 G. u ra lensis 79. 0 桃　仁 未检出
GR 2 G. u ra lensis 82. 7 三　七 未检出
GR 3 G. u ra lensis 30. 4 人　参 未检出
GR 4 G. korsh insky i 17. 8 苦　参 未检出
GR 5 G. g labra 25. 0 泽　泻 未检出
GR 6 G. inf la ta 20. 4 天花粉 未检出
没　药 未检出
　　虽然国内一些动物来源的药材的血清学研究已
有开展[5, 6 ] , 但占中药资源 87% 的植物来源的生药
材却很少通过免疫学方法进行研究。本实验及相关
研究以生药甘草为例[7～ 9 ] , 提出利用生药自身的特
异性蛋白质 (组) , 建立免疫学方法可以用于中药材
的分析, 为中药鉴定、质量标准研究提供一个新的思
路。与电泳法和核酸分析相比, 免疫学检测方法具有
灵敏度高、专属性强、简便快速、检测成本低、利于在
基层单位普及的特点。但由于特异性蛋白的稳定性的
原因, 药材的炮制以及中成药的加工也将对该方法的
适用范围产生一定的影响, 还有待于进一步研究。
References:
[ 1 ]　J iang R W , L u Y. T he modern p rogress in m ethods of iden ti2
fying tradit ional Ch inese m edicine [J ]1 Ch ina J Ch in M ater
M ed (中国中药杂志) , 1998, 23 (12) : 75727591
[ 2 ]　Chen Z J , Chen K, W ang X, et a l. Studies on gel elec2
tropho resis atlas of so lub le p ro tein in B ung arus [J ]1 Ch in
T rad it H erb D rug s (中草药) , 2000, 31 (5) : 37423771
[ 3 ]　Yang G M , CaiB C, W ang M Y, et a l. A pp lication of mo lec2
u lar b io logical techno logy in iden tification of tradit ional Ch i2
nese m edicine [J ]1 W orld S ci T ech (世界科学技术) , 2001, 3
(4) : 292341
[ 4 ]　Ren B R , H e S A , Yu H , et a l. Evaluating the relationsh ip s
betw een popu lations of swo rdlike atractylodes (A tracty lod es
lance) by random amp lified po lymo rph ic DNA techno logy [J ]1
Ch in T rad it H erb D rug s (中草药) , 2000, 31 (6) : 45824611
[ 5 ]　Guo Y Q , Chen D X, L iu F, et a l. Iden tification of deer heart
and its coun terfeit ing p roducts by imm uno2agglu tination test2
ing [J ]1 J Ch in M ed P harm acol (中医药学报) , 2000, 28 (1) :
622631
[ 6 ]　Guo Y Q , Chen D X, L i H. Iden tifictation of deer testes and
pen is and its coun terfeit ing p roducts by imm uno2agglu tination
testing [J ]1 Ch in P harm A f f (中国药事) , 2000, 14 (2) : 1032
1061
[ 7 ]　Kitagaw a T , Bai G, Fu jiw ara K. Specificit ies of five k inds of
an tisera p roduced against crude drugs, P inellia tuber, H oelen,
G ly cy rrh iz ae rad ix , T richosan thes roo t and P anax g inseng
[J ]1 B iol P harm B u ll, 1996, 19 (3) : 33523401
[ 8 ]　Bai G, Fu jiw ara K, T an imo ri H , et a l. D evelopm ent and ap2
p lication of a sandw ich enzym e imm unoassay fo r R ad ix G ly 2
cy rrh iz ae p ro tein (RGP) using monoclonal an tibodies [J ]1 B i2
ol P harm B u ll, 1977, 20 (12) : 1224212281
[ 9 ]　Bai G, Yang W B, Cao X L , et a l. U sing imm uno logical
m ethod fo r detection and quan titative m easurem en t of the con2
ten ts of R ad ix G ly cy rrh iz ae componen t compo sing tradit ional
Ch inese m edicines [J ]1 A cta S ci N a t U n iv N anka i2N at S ci
(南开大学学报·自然科学版) , 2002, 35 (3) : 872901
灯台树种子萌发特性的研究
蔡传涛, 兰芹英, 刘宏茂, 姚天全, 刀祥生Ξ
(中国科学院西双版纳热带植物园昆明分部, 云南 昆明　650223)
摘　要: 目的　研究灯台树种子萌发的最适宜条件和储藏时间, 为大量人工繁殖灯台树苗木提供借鉴。方法　不同
温度, 不同光照时间, 不同光质及不同储藏时间, 测量灯台树种子的萌发率。结果　灯台树种子萌发的适宜温度为
30 ℃～ 40 ℃, 适宜的光照时间为 8 h, 适宜的光质为黄光和日光, 储藏时间为 5 个月以内最好。结论　灯台树种子
是高温萌发型。
关键词: 灯台树种子; 萌发特性; 萌发率
中图分类号: R 282121　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 01 0086 03
Germ ina tion characters of seed of A ls ton ia schola r is
CA I Chuan2tao , LAN Q in2ying, L IU Hong2m ao, YAO T ian2quan, DAO X iang2sheng
(Kunm ing D ivision of X ishuangbanna T rop ical Bo tan ical Garden, Ch inese A cadem y of Science, Kunm ing 650223, Ch ina)
Key words: the seed of A lston ia schola ris (L. ) B. B r. ; germ inat ion characters; sp rou t ra te
·68· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 1 期 2004 年 1 月
收稿日期: 2003204209
基金项目: 云南省省院省校科技合作项目 (200YKS01) ; 中国科学院“西部之光”项目
作者简介: 蔡传涛 (1964—) , 男, 湖北人, 副研究员, 硕士, 主要研究方向为民族传统文化、资源植物开发与利用、植物生态与区域持续发
展等, 发表论文 23 余篇, 出版专著 2 部, 申请国家发明专利 8 项。
T el: (0871) 5161114　E2m ail: caict@xtbg. ac. cn o r caictao@public. km. yn. cn