全 文 ：表 5　EAEEP 对脾内抗体形成细胞的影响 ( x±s, n= 10)
组　别 剂量 ( mg/ k g) A 413 nm
NS - 0. 39±0. 06
EAEEP 8 0. 34±0. 05
16 0. 33±0. 05
3　讨论
近代研究表明, 许多扶正药物对机体免疫功能
有双向调节作用。中药之所以产生双向调节作用,与
其所含有两种或多种功效、作用相反的化学成分是
分不开的[ 6]。墨旱莲对小鼠脾细胞产生 IL-2的影响
在免疫抑制状态下呈提高作用, 而在免疫增强状态
下呈抑制作用,具有双向调节作用[ 7]。我们首次发现
墨旱莲乙酸乙酯总提物 (为皂苷类成分) 具免疫抑
制活性,能显著抑制小鼠免疫器官脾的发育,并显著
抑制巨噬细胞的吞噬功能,明显抑制 T 细胞介导的
迟发性变成反应, 降低血清溶血素水平,表明其显著
抑制机体的非特异免疫、细胞免疫及体液免疫功能,
提示墨旱莲中含有功效相反的化学成分,其对免疫
功能的双向调节作用是其各成分综合作用的结果。
同时 EAEEP 可显著提高小鼠胸腺指数,促进胸腺
的发育,揭示对不同的免疫器官有不同的作用,也为
免疫双向调节作用的原因之一。
参考文献:
[1]　中国药典[ S ] . 2000年版 . 一部
[2]　胡慧娟,杭秉茜,刘　勇 . 旱莲草对免疫系统的影响[ J ] . 中国
药科大学学报, 1992, 23( 1) : 55-57.
[ 3]　张　梅,邸晓辉,刘　梅 . 旱莲草中黄酮类成分的免疫调节作
用[ J] . 中草药, 1997, 28( 10) : 615.
[4]　李仪奎 . 中药药理实验方法学[ M ] . 上海:上海科学技术出版
社, 1991.
[5]　薛　彬 . 免疫毒理学实验技术[ M ] . 北京:北京医科大学中国
协和医科大学联合出版社, 1995.
[6]　张宏方 . 从中西医理论的异同看中药药理研究之思路 [ J] . 医
学与哲学, 1996, 17( 2) : 86-88.
[ 7]　熊晓玲,李　文 . 部分扶正固本中药对小鼠脾细胞 IL-2 产生
的双向调节作用[ J ] . 中国实验临床免疫学杂志, 1991, 3( 4) :
37-38.
葛根素对乳鼠心肌细胞缺氧-复氧时脂质过氧化损伤的保护作用
朱智彤,姚　智, 李会强,娄建石* ,卢　奕X
(天津医科大学 免疫教研室, 天津　300203)
摘　要: 目的　观察葛根素( puer ar in, Pue )对缺氧-复氧损伤造成的大鼠乳鼠心肌细胞脂质过氧化反应的作用。方
法　分别测定各个时点对照组、模型组及各给药组( 1, 0. 1, 0. 01 g / L Pue )培养上清中 SOD 活性和 M DA 含量,细
胞 MTT 代谢率的变化。结果　缺氧及复氧都可造成 SOD活性下降、MDA 含量升高及 MT T 代谢率下降, 复氧后 2
h 最为显著(P< 0. 01)。3种剂量 Pue 均能对抗这 3 个指标的异常变化,但浓度越小, 作用越弱。结论　Pue能减轻
缺氧时产生的自由基损害, 减少 SOD 的消耗, 并可能促进其合成,亦可保护心肌细胞的线粒体功能, 这些作用呈剂
量依赖趋势。
关键词: 缺氧-复氧; 心肌细胞;葛根素; 过氧化物歧化酶;丙二醛
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 04 0343 04
Protective effect of puerarin on cardiomyocytes of neonatal mice injuried by
lipid peroxidation during hypoxia-reoxygenation
ZHU Zhi-tong , YAO Zhi, LI Hui-qiang, LOU Jian-shi, LU Yi
( Depa rtment o f Immunology, T ianjin Univ ersity of M edical Science, T ianjin 300203, China)
Key words: hypoxia-reoxygenat ion; cardiomyocyte; puerarin; superox ide dismutase; melondialde-
hyde
　　缺氧及其后更为严重的复氧损伤是各种缺血-
再灌注损伤( ischemia-reperfusion injury )的共性。
文献报道脂质过氧化反应与缺氧-复氧损伤( hypox-
ia-reoxygenat ion injur y)的发生、发展密切相关。而
对葛根素是否通过增强心肌细胞的抗氧化能力来发
挥其保护作用知之甚少。本研究采用给培养的心肌
·343·中草药　Chinese T raditional and Herbal Drug s　2002 年第 33卷第 4期
X 收稿日期: 2000-10-23作者简介:朱智彤( 1971-) ,女,天津人,讲师,在读博士,研究方向:免疫药理。Tel: ( 022) 23313909　E-mail: zh uzt-hello@ yahoo. com
* 本校药理教研室
细胞换用缺氧及有氧培养基而造成缺氧-复氧损伤
来探究葛根素( puerarin,简称 Pue)抗缺氧和(或)复
氧造成的心肌细胞损伤的作用途径及量效关系。
1　材料与方法
1. 1　材料: 胰蛋白酶 ( Sigma ) ; 95% N 2-5% CO 2,
95% O 2-5% CO 2高纯混合气(天津市华北氧气厂) ;
葛根素(化学名: 4, 7-二羟基-8-B-D-葡萄糖基异黄
酮,相对分子量: 416. 4,广东燕塘生物化学药业有限
公司, 批号: 9903121, 50 mg / mL ) ; 噻唑蓝( M TT )
( Sigma) ;过氧化物歧化酶( SOD)测定试剂盒(南京
建成生物工程研究所) ;丙二醛( MDA)测定试剂盒
(南京建成生物工程研究所)。
1. 2　动物:出生后 1～4 d 的 Wistar 大鼠,雌雄不
拘,购自军事医学科学院四所。
1. 3　心肌细胞的培养:参照文献[ 1]略有改进。肝素
( 100 U/只)抗凝后无菌取心室, 剪成 0. 5～1 mm3
碎块。用终浓度含 0. 1%胰蛋白酶、0. 02%EDTA 及
0. 1%柠檬酸钠的消化液消化。用含 20%小牛血清
的 RPM I 1640培养基将心肌细胞沉淀混匀, 过 200
目钢丝网,制成细胞悬液, 并用分次静置法纯化后,
配成 5×105 / mL 的浓度, 分装于铺鼠尾胶的培养瓶
内,每瓶 2 mL。放入培养箱中培养, 24 h后换液, 48
h 后换为无血清 RPMI 1640培养基。选生长状态佳
者于 72 h 后进行实验。
1. 4　实验方法:参照文献[ 2]略有改进。( 1)对照组:
实验开始时换用有糖 RPMI 1640 培基 1. 8 mL+
PBS 0. 2 mL, 普通培养箱培养 2 h,换上述液体,继
续培养。( 2)模型组:换 N 2饱和( P O 2< 1. 1 kPa)的
无糖 RPMI 1640培基 1. 8 mL+ PBS 0. 2 mL, 置持
续通以 95% N 2-5% CO2 混合气( 4 mL/ min)的密
闭孵育器中, 37 ℃, 2 h。再换 O 2饱含( P O 2> 93. 1
kPa)的有糖 RPM I 1640 培基 1. 8 mL + PBS 0. 2
mL, 置持续通以 95% O 2-5% CO 2 混合气 ( 4 mL/
min)的密闭孵育器中, 37 ℃, 1 h。结束后, 放入普通
培养箱培养。( 3)给药组:实验开始, 及复氧开始时,
分别加入终浓度为 1, 0. 1, 0. 01 g / L Pue, 其余过程
同( 2)。分别在缺氧结束后、复氧结束后 1, 6, 12, 24
h 取上清液测 SOD 活性及 MDA 含量, 细胞用于
MT T 代谢率的测定(实验重复 6次)。
1. 5　检测方法
1. 5. 1　SOD 活性用亚硝酸盐法测定, 具体步骤遵
照试剂说明书。
1. 5. 2　MDA 用 TBA 法测定,具体步骤遵照试剂
说明书。
1. 5. 3　MTT 代谢率:每瓶加 1 mL MT T ( 0. 5 mg /
mL)孵育 4 h, 37℃,离心后弃上清。加入盐酸异丙
醇,酶标仪比色, 检测吸光度( A )值。参考波长 630
nm ,实验波长 570 nm。
MT T 代谢率( % ) = 实验组 A 值/对照组 A 值×100%
1. 6　统计方法:数值用 x±s 表示。两组间均数比较
用 t检验。多组间比较用双因素方差分析,其中均数
间两两比较用 Student-Newman-Keuls 检验。
2　结果
2. 1　SOD 活性的变化: SOD 活性从缺氧后受抑
( P< 0. 01)。1 g / L Pue 则表现出强的升高 SOD 活
性的作用, 甚至可使 SOD 活性显著高于对照组
( P< 0. 01) ,并一直保持在高水平。0. 1 g / L Pue 能
使 SOD 活性恢复并保持在对照组水平( P> 0. 05)。
0. 01 g / L Pue 在复氧后 2 h 才表现出这种作用, 但
弱于前二个剂量,见表 1。
2. 2　MDA 含量的变化: 缺氧与复氧损伤后 MDA
值升高,并在复氧后 6 h达高峰。1 g / L Pue 在缺氧
后即表现出显著降低 MDA 的作用,甚至可使复氧
后 24 h 的 MDA 含量降至对照组水平( P> 0. 05)。
0. 1 g / L Pue 在缺氧后起效, 且均未达对照组水平
( P< 0. 01)。而 0. 01 g / L Pue在复氧后 6 h 才表现
出这种作用,且较前两组作用差( P< 0. 05) ,见表 2。
2. 3　MTT 代谢率的变化:缺氧及复氧造成心肌细
胞 MTT 代谢率降低,并于复氧后 2 h 时最低( P<
0. 05)。各剂量的 Pue 都能显著地提高 MT T 代谢
率。1及 0. 1 g / L Pue的作用在缺氧时即表现出这
种作用(与模型组相比, P< 0. 01) ,见表 3。
表 1　缺氧-复氧损伤后各组 SOD活性的变化( x±s, n= 6)
组　别 剂　量
( g/ L )
SOD( NU / mL)
缺氧后即刻 复氧后 2 h 复氧后 6 h 复氧后 12 h 复氧后 24 h
对照组 - 　　29. 3±4. 9 　　31. 8±5. 5 　　31. 0±6. 3 31. 1±4. 9 　　　　29. 2±5. 9
模型组 - 16. 0±4. 0△△ 12. 2±3. 9△△ 20. 5±3. 7 33. 8±5. 0 32. 2±2. 2
Pue 0. 01 19. 1±3. 6△△ 20. 6±4. 9△△* * 21. 9±5. 1△△ 31. 7±6. 3 26. 6±4. 5
0. 1 28. 0±3. 2* * 30. 3±4. 5* * 35. 1±6. 5* * 37. 7±5. 7 30. 3±4. 9
1. 0 37. 3±3. 0△△* * 47. 1±5. 6△△* * 43. 8±5. 4△△* * 41. 1±5. 4△ 38. 0±3. 6△*
　　　　与对照组相比: △P < 0. 05　△△P < 0. 01;　与模型组相比: * P < 0. 05　* * P < 0. 01
·344· 中草药　Chinese T raditional and Herbal Drug s　2002 年第 33卷第 4期
表 2　缺氧-复氧损伤后各组MDA 含量的变化( x±s, n= 6)
组别 剂量
( g/ L)
MDA( nmol/ mL )
缺氧后即刻 复氧后 2 h 复氧后 6 h 复氧后 12 h 复氧后 24 h
对照组 - 　　1. 01±0. 45 　　1. 21±0. 50 　　1. 48±0. 57 　　1. 67±0. 66 　　1. 94±0. 66
模型组 - 3. 13±0. 65△ 5. 14±0. 79△ 8. 01±0. 51△ 5. 97±0. 80△ 5. 65±0. 91△
Pue 0. 01 2. 99±0. 55△ 4. 83±0. 41△ 6. 90±0. 89△* 5. 12±0. 52△* 4. 90±0. 49△* *
0. 1 2. 47±0. 42△ 3. 67±0. 37△* * 5. 97±0. 76△* * 4. 00±0. 43△* * 3. 43±0. 45△*
1. 0 1. 84±0. 40△* * 2. 77±0. 58△* * 3. 80±0. 63△* * 2. 94±0. 52△* * 2. 27±0. 59*
　　　　与对照组相比: △P < 0. 01;　与模型组相比: * P< 0. 05　* * P < 0. 01
表 3　缺氧-复氧损伤后各组MTT代谢率的变化( x±s, n= 6)
组别 剂量
( g/ L)
MT T 代谢率( %)
缺氧后即刻 复氧后 2 h 复氧后 6 h 复氧后 12 h 复氧后 24 h
对照组 - 　　100. 0±0. 0 　　100. 0±0. 0 　　100. 0±0. 0 　　100. 0±0. 0 　　100. 0±0. 0
模型组 - 50. 3±6. 3△ 43. 3±4. 7△ 49. 7±5. 5△ 53. 5±3. 7△ 59. 1±3. 1△
Pue 0. 01 56. 7±8. 0△ 52. 6±7. 9△ 58. 7±5. 7△* 61. 7±5. 2△* 66. 5±6. 2△*
0. 1 64. 6±5. 2△* * 62. 3±2. 8△* * 67. 7±8. 0△* * 74. 3±10. 7△* * 76. 0±7. 4△* *
1. 0 78. 2±8. 1△* * 76. 6±11. 6△* * 80. 5±7. 5△* * 85. 3±6. 7△* * 87. 0±5. 4△* *
　　　　与对照组相比: △P < 0. 01;　与模型组相比: * P< 0. 05　* * P < 0. 01
3　讨论
　　对照组培养上清中即含有少量的 MDA, 说明
正常生理过程即可内源性产生氧化产物。缺氧后首
先引起能量代谢受抑,激活蛋白水解酶, 使 AT P 分
解为黄嘌呤、次黄嘌呤。由于 O÷2 在细胞膜中的溶解
度远大于在水中的溶解度,故即使在外界缺氧的情
况下,细胞中仍有少量的氧可参与自由基反应。因而
在黄嘌呤及次黄嘌呤被进一步氧化成尿酸的同时,
也有少量 O÷2 产生,但正如本实验及其它研究[ 3, 4]所
证实的, 此时的自由基损伤是渐进性的。复氧后,
M DA 产生激增,并在其后 6 h 达峰值, 12 h 出现恢
复趋势,而稳定在一较低的水平。这说明复氧早期随
着 O÷2 的涌入,自由基大量产生,脂质过氧化反应最
为剧烈。
　　能分解 O÷2 的 SOD是体内重要的抗氧化酶之
一。SOD升高能防止氧中毒或缺血-再灌注后的组
织损伤,如减少局部缺血造成的毛细血管渗透性增
加、使受抑的心肌收缩力提前恢复等[ 4～6]。SOD活
性在缺氧时即受到抑制,这与文献报道相同[ 2, 4]。自
由基的大量产生造成内源性抗氧化系统的大量消
耗[ 2, 4, 7] , 故而在复氧早期 SOD活性亦受显著抑制。
SOD 活性在复氧后 6 h 回升, 12 h 即恢复至对照组
水平。说明缺氧及复氧损伤早期 SOD活性受抑,致
心肌细胞对 O÷2 的代谢能力下降, 可能是造成细胞
脂质过氧化损伤的主要原因之一。而在复氧后期,随
着 SOD活性的恢复及合成代偿性增加,细胞抗氧化
能力增强, 自由基产生减少, 则脂质氧化反应亦减
轻。但 MDA 含量与 SOD 活力恢复的不同步, 说明
了还可能有新的自由基产生而延长了损伤的时间和
程度。
MT T 代谢率反映了细胞线粒体代谢能力的变
化,并在一定程度上可反映细胞生存力的变化 [ 8]。复
氧后 2 h细胞线粒体功能损伤最重,但随着时间的
延长,具明显细胞毒性因子的产生较以前减少,细胞
结构和功能的损害亦减轻。而残余细胞功能的恢复,
甚至代偿性增加, 都可造成 MT T 代谢能力在复氧
后期有一定程度的增强。
Pue 具有显著增加 SOD 活性的作用,故而各个
剂量都能对抗 O÷2 造成的脂质过氧化损伤, 并呈剂
量依赖趋势。
总之,自由基损伤在缺氧时即已开始,复氧早期
最为显著,此时 SOD活性及心肌细胞的 MT T 代谢
能力亦明显受抑;复氧后期, 自由基渐被清除, SOD
活性也恢复至对照组水平, M T T 代谢能力有一定
程度的提高; Pue 能对抗自由基产生, 减少 SOD 的
消耗,大剂量还可促进其合成,并可保护心肌细胞的
线粒体功能,这些作用呈剂量依赖趋势。
参考文献:
[ 1]　徐叔云,卞如濂,陈　修 . 药理实验方法学[ M ] . 第 2版 . 北
京:人民卫生出版社, 1991.
[ 2]　Kirshenb aum L A , S ingal P K. Changes in ant ioxide enzyme
in isolated cardiac myocytes subjected to hypoxia-reox ygena-
t ion[ J] . Lab Invest , 1992, 67( 6) : 796-803.
[3]　Vanden Hoek T L, Beck er L B, S hao Z, e t al. React ive oxy-
gen species r eleas ed from mitochondria dur ing brief hypoxia in-
duced precondit ioning in cardiom yocytes [ J ] . J Biol Chem,
1998, 273( 29) : 18092-18098.
[4]　郭来敬,张志仁,陈东辉,等 . 电子顺磁共振检测心肌缺血再灌
产生的氧自由基及其保护的实验研究 [ J] . 心肺血管病杂志,
2000, 19( 1) : 58-61.
[5]　徐惠芳,王　莉,江　伟,等 . 己酮可可碱对自由基致心肌损伤
的保护作用及其机制[ J ] . 中华麻醉学杂志, 1998, 12( 8) : 730-
733.
·345·中草药　Chinese T raditional and Herbal Drug s　2002 年第 33卷第 4期
[ 6]　Wang P, Zw eier J L . M easuremen t of nit ric oxide and perox-
ynit rit e g enerat ion in the post ischemic h eart . Evidence for per-
ox ynit rit e-m ediated r eperfu sion in jury[ J] . J Biol Ch em, 1996,
271( 46) : 29223-29230.
[ 7 ]　Spark J I, Ch et ter I C, Gal lavin L, et al . Reduced total an-
t ioxidant capacity predict s isch emia-reperfus ion inju ry af ter
femorodistal bypas s[ J ] . Br J Surg, 1998, 85( 2) : 221-225.
[8]　M osmann T. Rapid colorim et ric assay for cellular g rowth and
survival : applicat ion to prol iferation and cytotoxic ass ays [ J ] .
J Immuno M ethods , 1983, 65: 55-63.
银杏内酯 A 对胆碱能神经功能
损伤引起的 SD 大鼠学习记忆的促进作用
高向东1, 2 ,陈　鹏2,刘俊彦1,谭仁祥1X
( 1. 南京大学生命科学学院,江苏 南京　210093; 　2. 中国药科大学生物制药学院, 江苏 南京　210009)
摘　要: 目的　研究银杏内酯 A 对 M eynert 基底核 ( NBM ) 损伤引起的 SD 大鼠学习记忆的改善作用。方法　通
过 N -甲基-D-天冬氨酸 ( NMDA) 单侧损伤 SD 大鼠 NBM 以破坏胆碱能神经功能,采用 Y 型迷宫法检测动物空
间辨别学习记忆能力, 利用放射化学法检测皮层胆碱乙酰转移酶 ( ChAT ) 活力, 观察银杏内酯 A 对胆碱能损伤记
忆功能的恢复, 脑内 ChAT 的变化。结果　银杏内酯 A 对胆碱能损伤记忆功能具有恢复作用, 且能防止 ChAT 活
力降低。结论　银杏内酯 A 能改善 NBM 损伤引起的大鼠学习记忆能力。
关键词: 银杏内酯 A; Meyner t 基底核; 胆碱乙酰转移酶
中图分类号: R282. 71; R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 04 0346 03
Improving effects of ginkgolide A on nucleus basalis of Meynert lesion-induced
learning and memory deficits in SD rats
GAO Xiang-dong
1, 2
, CHEN Peng
2
, L IU Jun-yan
1
, TA N Ren-xiang
1
( 1. College o f Life Science, Nanjing U niver sity , Nanjing Jiangsu 210093, China;
2. Co lleg e of Biopharmaceut ics, China Pharmaceut ical U niver sity , Nanjing Jiangsu 210009, China)
Key words : ginkgolide A; nucleus basal is o f Meynert ; choline acety ltr ansferase
　　银杏内酯是银杏有效成分之一,已从银杏的种
皮及银杏叶中分离出 5 种银杏内酯 ( A、B、C、M、
J)。近年来,国内外对银杏内酯的药理作用进行了大
量的研究,其药理作用广泛 [ 1] , 对脑缺氧、局部缺血
等有较好的改善效果, 银杏提取物用于治疗脑功能
障碍和多种类型的痴呆,使病人的反应加快,记忆改
善,症状好转。这些研究多数是以银杏内酯和银杏提
取物为研究对象。为了进一步研究该作用的活性成
分, 本研究通过 N -甲基-D-天冬氨酸 ( NMDA ) 单
侧损伤 SD大鼠 Meynert 基底核 ( NBM ) 以破坏胆
碱能神经功能,观察银杏内酯 A 对胆碱能损伤记忆
功能的恢复, 脑内乙酰胆碱转移酶 ( ChAT ) 的变
化, 探讨了银杏内酯对中枢神经系统保护作用的
机制。
1　材料与方法
1. 1　试药:银杏内酯 A, 由刘俊彦博士分离获得,
经核磁共振等光谱法分析与文献[ 2]数据一致, 其纯
度为 93%。
1. 2　动物:雄性 SD 大鼠,体重 250～300 g, 购于南
京医科大学实验动物中心。
1. 3　试剂: N -甲基-D -天冬氨酸 ( NMDA ) , Sigma
公司;水合氯醛,上海试剂一厂;牙科磷酸锌水泥, 上
海齿科材料厂;青霉素钠, 哈尔滨制药总厂;硫酸链
霉素钠,山东鲁抗; [ H 3]乙酰辅酶 A, Am-pharmacia
公司;乙酰辅酶 A, Sigma 公司;毒扁豆碱, Fluka 公
司;氯化胆碱,上海试剂三厂; 四苯硼钠,上海试剂一
厂; 2, 5-二苯基 唑(闪烁纯) ,上海试剂一厂; 1, 4-
双-( 5-苯基 唑基-2)苯(闪烁纯) ,上海试剂一厂;
其余试剂皆为国产分析纯。
1. 4　仪器:江湾Ⅰ型立体定向仪, 上海医用仪器厂;
307-6 台式牙钻车,上海齿科器械厂; MG-3 迷宫刺
激器,张家港市教学实验器械厂; LS5000TD 液体闪
·346· 中草药　Chinese T raditional and Herbal Drug s　2002 年第 33卷第 4期
X 收稿日期: 2001-09-11基金项目:江苏省自然科学基金(BK99096) ;教育部高等学校骨干教师资助计划项目资助作者简介:高向东( 1963-) ,女,现任中国药科大学生物制药学院教授,博士,主要从事衰老的分子生物学和生物新药的研究。
T el: 025-3271298　E-mail: xian gdong-gao@hotm ail . com