全 文 ：mmol/ L , 其标准差为0. 87,为均数的42. 03%。对照
组为( 1. 86±0. 47) mmo l/ L ,小剂量组( 0. 8 g/ kg )为
( 1. 36±0. 12) mmo l/ L。分析其原因,可能与个体差
异有关。同时也提示,大剂量未必就一定能表现出明
显的活性。这些有待于进一步研究。
荷叶大豆主要表现在促进脂类代谢方面,对其
合成的抑制作用较弱。其主要活性部位集中在黄酮
上,其次是生物碱。
参 考 文 献
1　李广勋 . 中药药理毒理与临床 . 天津:天津科技翻译出版公司,
1992: 68
2　赵水平 . 临床血脂学 . 长沙:湖南科技出版社, 1997: 417
3　许腊英,刘运苟,叶泽秀,等 . 湖北中医杂志, 1996, 18( 4) : 302
4　卫永第,陈荣杰 . 白求恩医科大学学报, 1996, 22( 4) : 350
5　莫凤奎,朱澄云,黄松鹤,等 . 中国药物化学杂志, 1997, 7( 2) : 121
( 1999-11-30收稿)
银杏内酯 B对血小板活化因子激活的大鼠中性白细胞功能的影响
中国医学科学院　
中国协和医科大学 药物研究所(北京 100050)　　周龙恩X　王文杰* * 　白金叶　程桂芳
摘　要　探讨了银杏内酯 B 对体外血小板活化因子激活的大鼠中性白细胞某些功能, 包括溶酶体酶的释放, 超氧
阴离子的产生以及细胞内游离钙浓度改变的影响。结果显示: 银杏内酯 B 在0. 5～100 Lmol/ L 终浓度下,可使 B-葡
萄糖苷酸酶释放量降低 44. 2%～73. 2% ; 在 0. 1～40 Lmol/ L 终浓度下, 可使超氧阴离子生量降低 27. 4%～
50. 0% ;在 0. 1～100 Lmo l/ L 终浓度下,使 PAF 和 fMLP 刺激引起的细胞内游离钙浓度分别降低 13. 9%～51. 4%
和 2. 2%～36. 6%。结果提示:抑制溶酶体酶的释放、超氧阴离子生成以及降低细胞内游离钙浓度的升高可能与其
抗炎作用有关。
关键词　银杏内酯 B　血小板活化因子　超氧阴离子　溶酶体酶　细胞内游离钙
Effect of Ginkgolide B on the Fuction of Rat Polymorpho-Nuclear
Leukocytes Activated by Platelet Activating Factor
　　Institute o f Mater ia M edica, Chinese Academy of M edical Sciences and Peking Union Medical Colleg e ( Beijing 100050)
　Zhou Long en, Wang Wenjie, Bai Jingye and Chen Guifang
Abstract　 　 To invest ig ate the effects of ginkgolide B on release of B-g lucuronidase and the
pr oduct ion of superox ide anion, as well as int racellular calcium change o f rat polymorphonuclear
leukocytes act ivated by platelet act ivat ing factor ( PAF) . B-glucuronidase release w as quant itated by
enzyme react ion in w hich phenophthaleinglucuronic acid w as used as the subst rate, super oxide anion
pr oduct ion was determ ined by cy to chrome C reduct ion, the change of int racellular calcium was measured
by fluorescent indicator Fura-2/ Am. In comparison w ith control, g inkgol ide B at f inal concentrat ion of 0. 5
～100 Lmo l/ L inhibited B-glucuronidase release by 44. 2%～73. 2% ; at f inal concentration of 0. 1～40
Lmol/ L decr eased superox ide anion product ion by 27. 4%～50. 0% and at f inal concentrat ion of 0. 1～100
Lmol/ L decr eased the rise of int racellular calcium level induced by PAF and fM LP by 13. 9%～51. 4% and
2. 2%～36. 6% respect ively. It is concluded that g inkgolide B can signif icant ly af fect the functions o f rat
po lymo rphonuclear leukocy tes. T herefore, it s inh ibitory ef fect s on lysos omol enzyme release, superoxide anion production and
int racellular calcium increase indu ced by PAF may be related w ith it s an tiin flammat ion act ion.
Key words　　g inkgo lide B　PAF　supero x ide anion　B-g lucuronidase　intr acellular calcium
　　银杏是我国古老树种之一,在我国已有 600多
年的药用历史。银杏叶中的主要药用成分之一银杏
内酯 B( g inkgo lide B)为强血小板活化因子( PAF)
受体拮抗剂, 具有抑制血小板聚集、拮抗血管通透性
增加、缓解支气管收缩、改善过敏症状等药理活
性[ 1, 2]。近年来研究也发现,银杏内酯 B 具有较强的
抗炎作用。中性白细胞是宿主防御系统的重要组成
部分, 又因参与炎症反应而能造成机体损伤, 在
·528· 中草药　Chinese T raditional and Herbal Drug s　2000 年第 31卷第 7期
X Address : Zhou Longen, Ins ti tu te of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Un ion M edical College, Beijin g周龙恩　男, 1989年毕业于第二军医大学药学院,获学士学位, 1997年毕业于中国医学科学院药物研究所,获硕士学位,现为在读博士生。主要从事抗肿瘤及抗炎免疫药理研究。发表科研论文数篇。
* * 联系人
PAF 刺激下, 发生一系列功能变化, 如产生超氧阴
离子和其他活性氧代谢物,脱颗粒并释放溶解体酶
及细胞内游离钙[ Ca2+ ] i 浓度的改变 [ 3]。我们采用中
性白细胞体外温孵系统, 观察银杏内酯 B 对 PAF
刺激下中性白细胞功能的影响。
1　材料
1. 1　动物: Wistar 大鼠, 体重 250～300 g ,雌雄兼
用,由中国医学科学院实验动物繁育场提供。
1. 2　药品和试剂: ginkgolide B, PAF,细胞松弛素
B( cytochalasin B) , 细胞色素 C ( cy to chrome C) ,酚
酞葡萄糖醛酸( phenolphthalein glucuronic acid) ,
M icrococcus Lysodeikt icus 购自美国 Sigma 公司,
Fura-2/ AM 由本所合成室提供。其他试剂均为国产
分析纯。
1. 3　仪器: Hitachi F-4010 型双波长荧光分析仪和
Yamato BT -25 型震荡恒温水浴为日本生产。
soniprep 150超声细胞破碎仪为英国生产。Bio-Rad
500型酶标仪为美国生产。LDZ4-0. 8自动平衡微型
离心机为北京医用离心机厂生产。
2　方法
2. 1　中性白细胞悬液的制备 [ 4] : 大鼠在乙醚麻醉
下,于右胸肋间注射 1%角叉菜胶 0. 2 mL, 4 h 后断
头处死, 吸取胸腔渗出液, 冰浴保存, 加含 0. 75%
NH4Cl 的 17 mmol / L T ris-HCl 缓冲液( pH 7. 2)除
去混入的红细胞, 2 000 r / min 离心 5 min, 沉淀的中
性白细胞以适当的 Dubecco′s 缓冲液洗涤并制成悬
液。涂片以 Giemsa 染色,分类计数, 中性白细胞数
大于 95%。以苔盼蓝排斥法检测, 活细胞数大于
98%。
2. 2　中性白细胞释放酶液的制备 [ 5, 6] : 中性白细胞
以 Dulbecco′s 液悬浮, 调节为 2. 5×106个细胞/
mL, 采用 10 mL 试管,加药物或等体积溶媒,细胞
悬液 250 LL,均设 4 个复管。置 37℃ 水浴震荡温
孵 15 min, 加 1×10- 3 mol/ L 细胞松弛素 B 2. 5
LL,继续温孵 5 m in, 再加 2×10- 5 mol/ L PA F 2. 5
LL, 继续温孵 5 m in 将试管移入冰浴, 终止反应。
4 000 r/ m in 离心 5 min,取上清作为释放酶液。
2. 3　中性白细胞总酶液及释放酶液的制备:取细胞
悬液 3 mL,在冰浴中用 soniprep 150细胞破碎仪超
声 1 m in (强度为 20 Am) , 4 000 r / min 离心 15
min,取上清液作为总酶液。取总酶液 1 mL, 于 80
℃ 水浴中灭活 15 min,作为灭活酶液。
2. 4　B-葡萄糖苷酸酶的检测[ 5, 6] :依文献原理改为
微量法。采用 96 孔酶标板,每孔加释放酶液或总酶
液、灭活酶液 25 LL, 2. 5 mmo l/ L 酚酞葡萄糖醛酸
25 LL, 0. 1 mo l/ L 醋酸缓冲液( pH4. 6) 100 LL。置
37℃、CO 2温孵箱内 18 h。每孔加 0. 3 mol / L NaOH
150 LL 终止反应并显色。在 550 nm 滤光片酶标仪
上读数,计算酶释放量占总酶量的百分数。
2. 5　中性白细胞生成超氧阴离子( O÷2 )的检测[ 7] :
中性白细胞以 BSS 溶液( N aCl 8 g / L , KCl 0. 4 g /
L , CaCl2 0. 14 g / L , M gCl2·6H2O 0. 2 g / L , Glucose
1 g/ L, HEPES 2. 388 g / L , pH 7. 4)悬浮, 调节为
2×107 个细胞/ mL。采用 96 孔酶标板,每孔加细胞
悬液 50 LL, 药物或等体积溶剂 1 LL, BSS 液 125
LL。对照或药物均设 4 个复孔, 置 37 ℃、CO 2温孵
箱内 20 min 后加 1×10- 4 mo l/ L 细胞色素 C 25
LL,加1×10- 3 mol/ L 细胞松弛素 B 25 LL, 2×10- 4
mol/ L PAF 2. 5 LL, 37 ℃温孵 10 min。在 550 nm
滤光片酶标仪上读数, 以消光系数 21×103 mol/ L
计算 O÷2的生成量。
2. 6　中性白细胞负载 Fura-2/ A m: 中性白细胞以
HBSS-BSA 缓冲液( NaCl 8. 0 g/ L , KCl 0. 44 g / L ,
CaCl2 0. 134 g / L , M gCl2·6H2O 0. 18 g/ L , HEPES
2. 2 g / L , BSA 1. 0 g/ L , pH 7. 4)悬浮, 调至 1×107
细胞/ mL。取细胞悬液 1 mL, 加入适量的药物
( DM SO< 0. 5% ) ,再加入 1 mmol/ L Fura-2/ Am 3
LL, 37 ℃ 水浴震荡 45 m in 后, 室温放置 15 min,
3 000 r/ min 离心 5 min。用 HBSS-BSA 液 5 mL 洗
去残存于细胞外的 Fura-2/ Am ,共洗 2 次, 再将洗
好的白细胞悬浮于 2 mL HBSS-BSA 液中, 37℃ 继
续温孵 10 m in。
2. 7　中性白细胞内游离钙浓度的测定[ 8] :取上述负
载 Fura-2/ Am 的白细胞悬液 2 mL, 加入 Hitachi
F-4010 型荧光分光光度仪的吸收池中, 保持在 37
℃ 恒温及悬浮状态下,采用激发波长 340 nm (光栅
5 nm ) , 发射波长 500 nm (光栅 10 nm ) , 扫描速度
120 nm/ m in, 先测定静息状态时的荧光强度(即静
息时中性白细胞内游离钙浓度)。再分别于加入刺激
剂 0. 1 mmol/ L PAF 或 fMLP 20 LL, 10% Tr iton
Ⅹ-100 20 LL, 500 mmol / L EGTA (用 3 mol/ L T ris
液调至 pH 8. 7) 100 LL 后进行测定。用计算机程度
“pr ogram for Ca2+ measurement ( F-4010 ) Quin2
Fura2 Indol处理实验数据。计算出静息状态和加
刺激物后细胞内游离钙的浓度。
3　结果
3. 1　银杏内酯 B 对中性白细胞释放 B-葡萄糖苷
酸酶的影响: 中性白细胞分别与终浓度为 0. 5, 1,
·529·中草药　Chinese T raditional and Herbal Drug s　2000 年第 31卷第 7期
10, 20, 100 Lmol/ L 的银杏内酯 B 或对照溶剂温孵
后,给药组 B-葡萄糖苷酸酶的释放量分别比对照组
降低 44. 2% , 48. 4%, 56. 5%, 63. 6% , 73. 2%(图
1)。
与 PAF 刺激组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 01　* * * P< 0. 001
图 1　银杏内酯 B对 PAF 刺激大鼠中性粒细胞 B-葡萄
糖苷酸酶释放量的影响( n= 3, x±s)
3. 2　银杏内酯 B 对中性白细胞产生 O÷2的影响:中
性白细胞分别与终浓度为 0. 1, 1, 10, 40 Lmol/ L 的
银杏内酯 B 或对照溶剂温孵后,给药组 O÷2 生成量
分别比对照组降低 27. 4%, 31. 1% , 43. 7% , 50. 0%
(图 2)。
与 PAF 刺激组比较: * P< 0. 05　* * P < 0. 01
　图 2　银杏内酯 B对 PAF 刺激大鼠中性粒细胞
超氧阴离子生成量的影响( n= 3, x±s)
3. 3　银杏内酯 B 对 PAF 刺激的中性白细胞内游
离钙浓度的影响:中性白细胞悬液分别与终浓度为
0. 1, 1, 10, 100 Lmo l/ L 的银杏内酯 B 或对照溶剂
温孵后,在 1. 0 Lmol/ L PAF 的刺激下, 给药组中性
白细胞内游离钙的浓度分别比对照组降低 13. 9%,
25. 3% , 43. 2% 及 51. 4%。表明银杏内酯 B 能显著
降低 PAF 刺激所致的中性白细胞内游离钙水平的
升高(图 3)。
与对照组比较: * P < 0. 05　* * P< 0. 01
图 3　银杏内酯 B对 PAF 刺激引起的大鼠中性粒细胞
内游离钙浓度的影响( n= 3, x±s)
3. 4　银杏内酯 B 对 fMLP 刺激的中性白细胞内游
离钙浓度的影响: 中性白细胞悬液分别与终浓度为
0. 1, 1, 10, 100 Lmol/ L 的银杏内酯 B 或对照溶剂
温孵后, 在 1. 0 Lmol/ L fM LP 刺激下, 给药组中性
白细胞内游离钙的浓度分别比对照组降低 2. 2% ,
13. 2%, 29. 0% 及 36. 6%。结果表明, 银杏内酯 B
也可降低 fM LP 刺激所致的中性白细胞内游离钙
水平的升高(图 4)。
与对照组比较: * P< 0. 05
　图 4　银杏内酯 B对 fMLP 诱导的大鼠中性白细胞
内钙水平的影响( n= 3, x±s)
4　讨论
中性白细胞脱颗粒、溶酶体酶的释放是炎症过
程的一种反应, 又是加剧炎性反应的次级原因。B-葡
萄糖苷酸酶存在于溶酶体的嗜苯胺蓝颗粒,通常以
测定该酶在反应液中的活性反映溶酶体酶的释放情
况。PAF 在 0. 1～1 Lmol/ L 即可诱导中性白细胞溶
酶体酶的释放。银杏内酯 B 是从银杏中提取的特异
性 PAF 受体拮抗剂。本研究结果显示,银杏内酯 B
在 0. 5～100 Lmol/ L 对 0. 2 Lmol/ L PAF 刺激的中
性白细胞 B-葡萄糖苷酸酶的释放有明显的抑制作
用。提示抑制溶酶体酶的释放可能是其抗炎作用机
·530· 中草药　Chinese T raditional and Herbal Drug s　2000 年第 31卷第 7期
制之一。
中性白细胞活性氧生成系统是一种 NADPH
氧化酶, PAF 与其受体结合可激活此酶, 从而促进
中性白细胞释放 O÷2 [ 9]。银杏内酯 B 在 0. 1～40
Lmol/ L 对 2 Lmol/ L PAF 刺激的中性白细胞 O÷2
的产生有明显的抑制作用,可能是其抗炎作用机制
之一。进一步地证实银杏内酯 B 可拮抗 PAF 的生
物学活性。
Hoike 曾报道, 浓度为 0. 1 Lmol/ L PAF 即可
增加中性白细胞[ Ca2+ ]至峰值, 随后细胞内钙水平
下降。fM LP 也可诱导快速的中性白细胞[ Ca2+ ]升
高,且能使[ Ca2+ ]维持在较高的水平。一般认为,在
中性白细胞, 细胞内钙水平升高首先是内钙储库的
释放,然后是外钙的内流,从而导致细胞内[ Ca2+ ]的
进一步提高。选择性 PAF 受体拮抗剂 WEB2086抑
制 PAF 刺激引起的 IP3产生及内钙储库的钙释放;
而在 fM LP 诱导的细胞反应中, WEB2086 不抑制
IP3的产生及内钙储库的钙释放, 但抑制外钙的内
流[ 8]。本研究结果表明, 银杏内酯 B 明显抑制 1
Lmol/ L PAF 刺激引起的 [ Ca2+ ] 升高, 而对 1
Lmol/ L fM LP 诱导的[ Ca2+ ]升高抑制作用较弱, 这
一结果与上述文献报道相一致。
综上所述,银杏内酯 B 的抗炎作用可能与其抑
制中性白细胞溶酶体酶的释放、超氧阴离子的产生
以及细胞内钙水平的升高有关。
参 考 文 献
1　Smith P F, Maclennan K, Darlington C L. J Ethn ophar macol,
1996, 50( 3) : 131
2　Braquet P, Hosford D. J Ethnopharmacol , 1991, 32( 1-3) : 135
3　Shukla S D.FASEB J , 1992, 6: 2296
4　Yue T L, Varm a D R, Powell W S. Bioch im Biophys Acta, 1983,
751: 332
5　Feinmark S J, Lindgt rn J A, Claess on H E, et al . FEBS Let ter s,
1881, 136: 141
6　王文杰,白金叶,程桂芳,等 . 中国医学科学院学报, 1997, 19( 3) :
220
7　Stewart A G, Dubbin P N, Harris T , et al . Proc Nat l Acad S ci
USA, 1990, 87: 3215
8　Koik e H, Imanishi N, Natsume Y, et al . Eu r J Phar macol, 1994,
269: 299
9　Shaw J O, Pinck ard R N, Ferrigni K S, et al. J Immunol, 1981,
1279( 3) : 1250
( 2000-01-21收稿)
板蓝根二酮 B体外抗癌活性研究△
广西医科大学(南宁 530021)　　梁永红X　侯华新　黎丹戎* *　秦　箐　邱　莉　吴华慧
摘　要　目的: 板蓝根二酮 B 抗人肝癌 BEL-7402细胞、卵巢癌 A2780 细胞体外活性研究。方法: M TT 法测定板
蓝根二酮 B 对肝癌 BEL-7402 细胞和卵巢癌 A2780 细胞的抑制作用, 集落形成实验观察药物的诱导分化作用,
PCR-ELISA 试剂盒测定细胞的端粒酶活性。结果: 板蓝根二酮 B 具有抑制肝癌 BEL-7402 细胞、卵巢癌 A2780 细
胞增殖的能力, 其 IC50分别为 8. 2 Lg/ m L 和 7. 8 Lg / mL ; 且具有诱导分化作用,可降低端粒酶活性的表达。结论:研
究结果提示板蓝根二酮 B 具有体外抗肿瘤活性。
关键词　板蓝根二酮 B　抗肿瘤活性　肝癌　卵巢癌
Studies on in vitro Anticancer Activity of Tryptanthrin B
　　Guangxi Univ ersity of Medical Sciences ( Nanning 530021)　Liang Yonghong , Hou Huaxin, Li Danrong , Q in Jing , Q iu
L i and Wu Huahui
Abstrast　　To study the in vit ro ant icancer act ivity of tr yptanthrin B, one of the act ive const ituent of
the root o f I satis tinctoria L. on BEL-7402 human hepatocellular carcinoma cell and A2780 human ovarian
cancer cell. Cytotox icity assay w as tested by MT T method. Signs of induction dif ferentiat ion w as obser ved
by colony fo rming units assay . T elomerase activity in cell w as determ ined by PCR-ELISA method. IC50 of
t ryptanthrin B on BEL-7402 and A2780 cell lines w ere 8. 2 Lg / mL and 7. 8 Lg/ mL respect iv ely .
Telomer ase act ivity w as dramat ically decl ined and def ferent iat ion o f both cancer cell lines w as observ ed.
Tr yptanthrin B possesed ant itumor act iv ity in vit ro.
·531·中草药　Chinese T raditional and Herbal Drug s　2000 年第 31卷第 7期
X Address : Lian g Yonghon g, Guangx i Un ivers ity of M edical Scien ces , Nanning梁永红　大学本科毕业,理学学士,高校讲师,现从事天然药物化学方面研究工作。
* * 广西肿瘤防治研究所
△本课题为广西教育科研资助项目,桂 1999[ 383] -5