全 文 ：· 综述与专论 ·
Ri质粒转化植物生产天然活性成分的研究进展 ( l)△
北京医科大学生物化 学及分 子生物学系 ( 1。。。 83)常振战 .果德安 “ ’ 郑俊华 ’ `
摘 要 综 述了影响发根生长 和次生代谢产物合成的因朴 用生物反 应器培养植物发根 的方 法 ,
提高发根次生代谢物含量 的措施 , 以及发根培养物 的次生代谢产物 。
关键词 iR 质粒 转化 发根 ( ha ir y or ot ) 次生代谢物
1 影响发根生长和次生代谢物合成的因家
1
.
1 光因子的影响 : 光能使一些在原植物 叶
中大量表达的产物在绿色发根中得到表达 ,
或是光激活了合成途径中的某些酶 ,从而促
进 了次生代谢物的合成 。 有些植物的发根暴
露在光下一段时间之后便开始变绿 , 生长速
度和终产量都 比暗培养高 。 M al d o an d o 一 M e n -
d o az 〔
`〕用光照诱使无刺曼陀罗发根变绿 , 并
用于生产直若烷生物碱 。 有些植物只有在光
培养下才合成次生代谢物 , 如青篙 A咐 e m行ia
a n n u a L
. 发 根 中青 篙 素 的合成 便 依 赖 于
光 〔 2〕 。 而 H 。 。 k 观察到在缺光 的条件下培养
高山火绒草 L eo nt oP od iu m a lP in u m C as s . 发
根能够增加发根挥发油的得率 。
1
.
2 培养基种类 、 组成的影响 : 基本培养基
的种类和组成 、 碳源等因素对发根及次生代
谢物 的产物均有影响 。 V a n h al a 等 ` 3 ,用不同
致病 性的农 杆菌感染钝天仙子 了乃,。 s .c y a m us
m u tz’ c u 、 的实 验 , 在 L B。 培养基上得 到的发
根 比 B S 培养基上的多 。 研究表明 , N ict h 、 SH
培养基对龙胆 G e n t i a n a m a n s h u ir c a K i t a g 发
根生长优于 M S 培养基 , 而 Whi et 、 H E 不利
于龙胆发根生长 。 2 0 9 / L ~ 30 9 / L 蔗糖作碳
源时龙胆发根生长最好 ,高于 60 9 / L 时不利
于发根生长 ; 可溶性淀粉与蔗糖效果类似 ,而
葡 萄糖 对 龙胆发 根生 长不 利 。 S ih m o m ur a
等 以〕发现紫草发根在 M S 固体培养基上培养
,
A d d r e s s
:
C h a n g Z h e n z h a n
,
C o l le g e o f P h a r m a e y
,
B e ijin g
二 * 北京 医科大学药学院△ ( I )刊于 《中草药 》杂志 1 9 9 8 年第 10 期
《中草药 》 1 9 9 8 年第 2 9 卷第 n 期
时 , 不能产生任何色素 , 然而在用专 门的培养
根的固体或液体培养基上培养时 , 却产生大
量的色素并释放到培养基中 。 U oz u m i 等 〔 5〕研
究 表 明 , 在 补 料 分 批 培 养 ( f e e d 一 b a t e h
c
ul t
u
er ) 中 ,果糖作碳源可以大量提高反应器
中胡萝 卜发根的密度 。 K in 。 一O k a 等观察到 ,
在果糖和硝酸盐作唯一碳源和氮源的 M S 改
良培养基 上培 养西 洋茜 草 R ub l’a t icn t or u m
L
. 发根能极大增强发根的生长和色素形成 。
浓度为 6 0 m m ol / L 的氮及用蔗糖作碳源对
人参发根培养物的生长和花色素昔的产生具
有显著的影响 〔的 。 T ay a 等发现 ,磷是甜菜发
根 中色素积累的关键营养元素 。 磷浓度较低
时 ,发根中色素的含量较高 。在不含磷的培养
基上批量 培养 18 d , 生成的色素总量是正常
M S 培养基上产生色素的 4 . 8 倍 。
.1 3 p H 值 的影 响 : 培养基起始 p H 值对在
发根生长和代谢均有 影响 , 原 因在于 p H 值
对发根生长和代谢 中起关键作用的酶的活性
有影响 。
1
.
4 激素的影响 : 生长素和细胞分裂素常用
来调控发根 的生长和次生产物合成 , 但它们
对不同植物发根的作用不同 。 实验证 明 : 1 . 0
m g / d m
3
N A A 与 o · 5 m g / dm 3 B A P 配 合使
用引起辣 根发根 向细胞团的巨大变化 ;单独
加人 N A A , 在从细胞团再生发根 的过程 中 ,
发根形成和生长都增强 。 S ia ot u 等发现 N A A
U n i v e r s i t y o f M e d i e a l cS i
e n e e s , B e i ji n g
.
7 7 5
.
和 5, 6一 C 12 一 I A A 等生 长素 (I A A 例 外 ) 在 光
下 抑 制 辣 根 发 根 产 生 不 定 芽 ; B A 、 K i几
i6 A d e
、
i6 A d o 等细胞分裂素在暗处诱导发根
芽的形成 , 在光下增加发根上芽形成的数量 。
A r o o 等 〔 7〕用 同位素 [ 3 5 5 〕掺人 实验证明 : 在
培 养 万 寿 菊 T a g et es P at ul a 发 根 时 加 人
IA A
, 发根产生 了大量侧根 ,唾 吩的合成受到
抑制 ; 不 加 IA A 时 , 发根分枝与 唾吩积累之
间却未表现出明显的相关性 。
除 了上述影 响 因素 外 , Y u 等研 究 了颠
茄发根对氧气的需求 。 K at o 等观察 了不 同磁
场强度 对胡萝 卜和颠茄发根 生长速度 的影
响 。 J u n g 等 〔 8〕研 究 了无机盐成 分对长春 花
aC ht
a ar nt h us or se us 发根生长与长春花碱积
累 的影 响 ,发 现硝酸盐对发根生长和 c at h a -
ar n t hi n e 生成均有利 ; 钱和磷酸盐则 产生相
反 的作 用 ; 硼 酸盐 和钥 酸盐 对 发根 生长 和
e a t h a r a n t h i n e 生成均有抑制作用 ; 碘化钾硫
酸盐和铁盐没有太大的影响 。
2 发根培养技术
2
.
1 生物反 应器 ( b i o r e a e t o r ) 培养 发根 : 发
根可 以 用一般的组织培养方式在固体或液体
培养基上培养 。 商业价值 昂贵的化合物还可
以用生物反应器批量培养 。
发根是生长迅速 、 高度分支的器官 , 培养
容器中发根 的密度往往很高 , 因此保持低的
流体压力 和高的容量 氧气 转移系数 十分必
要 , 开发这种特性的生物反应器很有意义 〔9 〕 。
K o 等 〔` 0 〕用气升式 ( a i r 一 l i f t t y p e ) 反应器培养
胡萝 卜发根 , 发根快 速生长 , 25 d 后发根终
产量比起始质量高 1 1 倍 。 N u u t i l a 等 〔“ 〕比较
了 3 种类 型 的生 物反 应器 , 在 喷气 式 ( al r -
s p ar g e d )反应 器中 , 长春花发根生长 和引噪
生物碱合成均最好 , 在搅拌反应器和基质环
流 ( m e d iu m e i r e u l a t i o n ) 反应器 中 , 发根则不
能生长 。 U oz u m i 等 〔 5〕的研究表明 : 用单糖作
碳 源能极大提 高反应器 中胡 萝 卜发根 的密
度 , 同时可 以避免用蔗糖作碳 源时果糖和葡
萄糖在培养基中的大量积累 。 从以上研究报
道可 以看 出 ,通气性能 良好 的气升式或喷气
.
7 7 6
.
式反应器是培养发根的理想装置 。 单糖作碳
源适 合于批量培养发根 的反 应器的具体情
况 ,可以避免反应器中糖的积累 。
2
.
2 提高次生代谢物含量的措施
2
·
2
·
1 二步培养法 ( t w o 一 s t a g e e u l t u r e p r o -
c e s s )
: 发根起初在可获得最大生长速率的生
长培养基上培养 , 然后转移到可诱导产生 目
的次生代谢物的生产培养基上培养 。 这种培
养基通常是改 良的 M S 或 B S 培养基 ,其中蔗
糖和磷酸盐水平已做 了调整 。 J u n g 等 〔` 2 ,通过
优化无机盐建立的两 阶段培养法使长春花发
根 培 养 中 e a t h a r a n t h i n e 的 得 率 高 达 6 0 . 5
m g / L
, 比原先的 S H 培养基一步培养法的得
率高 5 . 4 倍 。
2
.
2
.
2 引发子 e( h ic t or ) 的应用 : 绝大部分报
道 的引发技术应用 了从酵母 或真菌 〔 l3, ` 4〕 中
提取的蛋白或多糖物质 。 青霉菌 尸 en i ic il u m
s p p
. 、 大丽花轮枝抱 V e rt i c i l l i u m d a h l i a 和串
珠镰抱 F u as ir u m m on il iof mr ` l5t 〕 、 黑曲霉 A -s
P e
r g i l l u : n i g e r 〔, 6
, ` , 〕 、 瓜 果 腐 霉 yP t h i u m
aP h
a in d e mr at
u m 〔` 8〕的细胞壁粗提物 , 以及一
些特殊的化合物 ,如杆菌肤 、 粘菌素以及多粘
菌素 B 都可作引发子运用 。
2
.
2
.
3 前体 ( p r e e u r s o r ) 追加法 : 通过饲喂
目的次生代谢物的前体对发根代谢途径进行
调节 ,进而提高次生代谢物的合成 〔 , 9〕 。
实际研究 中 , 根据具体植物发根培养物
的特点和影 响因素 , 优化组合运用这些培养
技术 ,必将取得 良好的效果 。
3 发根培养物的次生代谢产物
随着发根培养技术 的逐步完善 , 许多有
开发价值的次生代谢物 已从不同植物的发根
培养物 中提取出来 , 有的化合物已通过发根
培养法得以工业化生产或 中试生产 。 其中药
用价值较高的是 有生物活性的喳琳生物碱 、
呀}噪生物碱 、 托 品烷 生物碱 、 喳嚓烷生物碱
等 , 此外 , 唾吩 、 多炔 、 葱醒 、 糖昔等次生代谢
物也是重要的药用化合物 。
3
.
1 生物碱类次生代谢物 : 以提高组织培养
系统中次生代谢物产量为 目的 , 利用发根培
养 技术进 行了广泛 的研究 。 H a m il 研 究小
组 〔 2幻发现 , C i n c h二 a le d g e r i a n a 发根 培养物
产生的甲氧基哇琳 、 奎宁和奎尼定的含量是
他们早期工作中得到的最高产的深绿色冠痰
瘤细胞 中生物 碱含量 的 2 倍一 3 倍 。 P ar r
等山 ”转化长春花得到 的发根培养物在 28 d
的生长期内 ,发根质量增加 了 2 0 倍 , 并合成
了高产量的叫噪生物碱 , 包括阿吗碱 、 ca ht a -
r a nt h i n e
、长春花朵宁 。 hC r i s t e n 等 ` , 2〕报道 :
白花曼 陀罗 工玩ut ar ca n d i d a 的发根培养物
在 1个月的生长期内细胞质量增加 20 倍 ,生
物 碱 含量 达 到细 胞 干重 的 0 . 68 % 。 W in k
等 〔23) 用鹰爪豆 SP a汀 iu m uj cn eu m 的发根培
养物产生了在正常情况下 由茎和叶组织合成
的喳嗓烷类生物碱 ,含量与完整植株茎组织
中相 当甚至更 高 , 每克鲜重发根含数微克咬
嗓烷生物碱 。
3
.
2 其它次生代谢物 : 多炔类和唆吩类等次
生代谢物 ,可 以用作真菌 、 细菌和线虫的抗生
素 , 已 能 在 发 根组 织 中诱 导 出来 。 lF or es
等 〔24j 发现万寿菊属 aT g et es 和鬼针属 B ide sn
的发根培养物产生了在完整植物根中合成的
相 同类型 的多炔类和唆吩类 。 甜叶菊 S et ir a
er b
a u d i a n a 的发根培养物能合成甜菊昔的前
体化 合物 s t e r i o b i o s id e , 从而可 以生产 甜菊
昔 〔 2 5〕 。 人参发根培养物比未转化的根培养物
生长快 2 倍一 3倍 , 经过 3 周培养 ,干重即可
增高 2 . 4 倍〔川 。 大批量培养人参发根进而生
产人参皂昔可 以获得很高的利润 。 除了培养
发根生产天然次生代谢物外 ,用 iR 质粒作为
载体通过发根农杆菌向植物基因组插人外源
基 因可以生产外源基因产品 。 S ot u g a dr 〔 27j 等
将嵌合大豆血红蛋 白基因通过 iR 质粒 中间
载体法导人牛角花植物 中 ,外源基因在牛角
花 中得到 了表达 。 此外 , R i 质粒 T 一 D N A 随
机插人植物基 因组可能引起宿主基因组发生
突变 ,从而导致新化合物的产生 , 这对于发现
新的药用化合物很有意义 。
综上所述 , iR 质粒转化系统为利用植物
组织培养生产次生代谢物带来 了新的契机 。
iR 质粒转化系统在植物组织培养上 的应用
将会在通过生物技术手段工业化生产植物次
生代谢物方面发挥出越来越大的作用 。
参 考 文 献
1 M a ld o n a d o
-
M e n d o z a I E T
,
et a l
.
P la n t C e ll
,
T 认s u e
a n d o r g a n uC l t
u r e , 1 9 9 5 ; 4 0 ( 3 )
:
1 9 7
2 蔡国琴 ,等 . 生物工程学报 , 1 9 9 5 ; 11 ( 4 ) : 3 1 5
3 V a n h a la L
, ` a l . P la nt eC ll R e P , 19 9 5 ; 1 4 ( 4 ) : 2 3 6
4 hS imo m
u r a K
,
et a l
.
P la n t eC ll eR p
,
1 9 9 1 ; 1 0 ( 6 / 7 )
:
2 8 2
5 U oz u m i N
,
ct a l
.
J F e r m e n t B io e n g
,
1 9 9 1 ; 7 2 ( 6 )
:
4 5 7
6 K o K M
,
et a l
.
J P la n t iB o lo g y
,
1 9 9 4 ; 3 7 ( 1 )
:
8 5
7 A r r o R R J
,
et a l
.
P h y s i o l P h a n t a
,
1 9 9 5 ; 9 3 ( 2 )
:
2 3 3
8 J
u n g K H
,
et a l
·
J F
e r m e n t B i o e gn
,
1 9 9 4 书7 7 ( 1 ) : 5 7
9 K i m Y H
,
et a l
.
B io t e c h T e e h
,
19 93 ; 7 ( 1 7 )
:
8 59
1 0 K o K M
,
et al
.
K o r e a n J l如 t , 19 9 2 ; 3 5 ( 4 ) : 3 6 5
1 1 N u u t i la A M
,
et a l
.
iB o t e e h T e e h
,
1 9 9 4 ; 8 ( l )
:
6 1
1 2 J
u n g K H
,
et a l
.
J F
e r m e n t B i o e n g
, 1 9 9 4 ; 7 7 ( l )
:
5 7
1 3 S im S J
, ,
et a l
·
J F e r m e n t B i o e n g
, 1 9 9 4 ; 7 8 ( 3 )
:
2 2 9
1 4 K im C H
, e t a l
.
A g r i C h e m B io t e e h
,
1 9 9 4 ; 3 7 ( 4 )
:
2 3 7
1 5 0
`
k e e fe B
,
et a l
.
Bi o t e e h n o l o g y a n d P h a r m a e y
.
N e w
Y o r k L o n d o n
:
C h a p m a n a n d H a l l
,
1 9 9 3
:
2 90
1 6 B u i t e l a a r R M
, e t a l
.
E n z y m e M i e r o b T e e h n o l
,
1 9 9 2 ; 1 4
( 1 )
:
2
1 7 B u i t e l a a r R M
, e t a l
.
E n z y m e M i e r o b T e e h n o l
,
19 9 3 ; 15
( 8 )
:
67 0
18 M e k in l e y T
, e z a l
.
P la n t P h y s i o l B i o e h e m
, 1 9 9 3 , 3 1
( 6 )
:
8 3 5
1 9 A r r o o R R J
, 。 t a l
.
P h y t o e h e m i s t r y
, 1 9 9 5 ; 3 8 ( 5 )
:
1 1 9 3
2 0 H a m i l l J D
, e t a l
.
P la n t a M e d
,
1 9 8 9 ; 5 5
:
3 5 4
2 1 P a r r A J
, e t a l
.
P la n t C e l l R e P
,
1 9 8 8 ; 7
:
3 0 9
2 2 C h r i s t
e n P
, e t a l
.
P l a n t C e l l R e p
,
1 9 8 9 ; 8
:
3 0 9
2 3 W in k M
, e t a l
.
2 N a t u r f o r s e h
,
19 8 7 ; 4 2 C
:
6 9
2 4 F l o r e
s
H E
, ￡ t a l
.
T r e n d s B i o t e e h
,
1 98 7 ; 5
: 6 4
2 5 Y a m a z a k i T
, ` t a l
.
P l a n t P h y s i o l
, 19 8 9 ; 8 9
:
10
2 6 Y o s h ik a w a T
, ` t a l
.
P ] a n t C e l l R e p
,
1 9 8 7 ; 6
: 4 4 9
2 7 S t o u g a a r d J J
, e t a l
.
M o l G e n e t
, 1 9 8 7 ; 2 0 7
:
2 5 1
( 1 9 9 8
一
0 4
一
1 3 收稿 )
《中草药 》 1 99 8 年第 29 卷第 H 期 . 7 7 7 .