全 文 ：磨香糖蛋白成分对血小板活化因子
激活的大鼠中性白细胞功能的影响△
中 国 医学 科 学院
中国协和 医科大学药物研究所 (北京 20 0 0 50 )王文杰
带 白金叶 周龙恩 程桂芳 朱秀媛
摘 要 采用体外温孵系统 ,观察察香糖蛋白成分察香一 1 对体外血小板活化因子激活的大鼠中性
白细胞某些功能 ,包括超氧阴离子产生和溶酶体酶释放的影响 。 结果表明 :寮香一 1 在 1 阴 / m L ~
10 拜g /m L 终浓度下 ,可使中性白细胞超氧阴离子生成量增加 109 % ~ 2 91 % ,在 10 拌g / m L 一 10
拌g / m L 终浓度下 ,可使 件葡糖昔酸酶释放量降低 6% ~ 51 % ,使溶菌酶释放量降低 7% ~ 21 % 。 抑
制溶酶体酶释放可能是寮香抗炎作用机制之一 。
关键词 察香 中性白细胞 超氧阴离子 件葡糖昔酸酶 溶菌酶
察香 ( n lu sk )是一珍贵中药 , 由雄性赓香
囊中分泌物干燥而得 。 实验证明 :廖香水溶性
成分在多种动物模型上有抗炎作用川 , 中性
白细胞是宿主防御系统的重要组成部分 , 又
是主要的炎性细胞 , 在炎症部位释放有害物
质 造成周 围组织 损伤 , 血小板 活 化 因 子
( p l a t e l e t
一 a e t i v a t i n g
一
f a e t e r
,
p A F ) 为可 由 多
种细胞释放的一种磷脂 ,是重要的炎性介质
之一 ,可刺激中性白细胞 , 使其发生一系列功
能变化 ,如产生超氧阴离子和其它活性氧代
谢物 , 脱颗粒并释放溶酶体酶等 。本研究采用
中性白细胞 体外温孵系 统 , 观察嚼香一 1 对
P A F 刺激下白细胞功能的影响 。
1 材料和方法
1
.
1 材料
1
.
2
.
1 动物 : W i s t a r 大鼠 ,体重 2 5 0 9 一 3 0 0
g
,雌雄兼用 , 由中国医学科学院动物所繁育
场提供 。
1
.
1
.
2 药物和试剂 : 爵香由中国药材公司 、
四川省中药材公司提供 。 经我所宋万志教授
鉴 定 , 为林康 几么〕 s c 人u : b e er z o v k i i F l e r o w
香囊分泌物 。研磨成粉 , 经乙醚 , 乙醇提取后 ,
以水冷渗 , 提取液冷冻干燥 , 冻干粉以水复
溶 , 上 se p h a d e x G 一 25 柱 , 蒸馏水洗脱 , 收集
第 1 色带 , 冷干备用 , 称赓香一 1川 。 在小鼠巴
豆油耳炎症模型 I D S。约为 30 m g k/ g ,故体外
用相应 1 拌g / m L ~ 1 0 拌g /m L 浓度 。 细胞色
素 C ,超氧化物歧化酶 , P A F , 细胞松驰素 B ,
M i e r o e o e e u s L y s o d e ik t i e u s
, 酚酞葡糖醛酸购
自美国 iS g m a 公司 。 其它试剂均为国产分析
纯 。
1
.
1
.
3 仪器 : Y a m at o B T 一 25 型震荡恒温水
浴为 日本生产 。 S o in p r印 1 5G 超声细胞破碎
仪为英国生产 。 F o r m a S e i e n t i f i e 3 1 64 C O Z温
孵 箱 , iB o R a d 4 50 酶 标 仪 为 美 国 生 产 。
L D z 4
一
0
.
8 自动平衡微型离心机为北京医用
离心机厂生产 。
1
.
2 方法
1
·
.2 1 中性白细胞悬液的制备 : 按文献 3j[ 方
法进行 。
1
.
2
.
2 中性白细胞释放超氧阴离子 ( O 子)的
检测川 : 中性 白细胞以 B S S 溶液悬浮 , 调节
为 2 又 2 0 , 细胞 /m L 用 9 6 孔酶标板 ,每孔加
4 x 10 一
`
m ol / L 细胞色素 C 25 拌L 药物或等
体积溶剂 , 以 B S S 补至 150 拼L ,加细 胞悬液
25 拜L ,对照与给药均设 5 个复孔 。 置 37 ℃
`
A d d r e s s
:
W
a n g W
e n ji e
,
In s t i t u t e o f M a t e r i a M e d i e a
,
C h in e s e A e a d e m y o f M e d i e a l S e i e n e e s
,
C h in e s e X i e h e M e d i e a l U
-
n i v e r s i t y
,
eB iji
n g
△ 国家 自然科学基金资助项目 , 编号 39 3 7 0 8 4 2
·
3 2 2
·
酶的影响 : 中性 白细胞分别与终浓度为 1 0、
3
、
1 0拼g /m L的赓香一 1 或对照溶剂 温孵
后 ,给药组 件葡糖昔酸酶的释放量分别比对
照组降低 6% 、 16 %和 51 % (见图 2) 。 表明察
香一 1 可 明显抑制中性白细胞 件葡糖昔酸酶
的释放 。
ǎ留石界叫x之一层巴侣州小崔盔璐脚
C O
: 温孵箱内 , 3 0 m i n 后 加 8 X 1 0一 6 m o , / L
P A F 2 5 拌L , 继续温孵 2 0 m i n 。 在 5 5 0 n m 滤
光片酶标仪上读数 。 以消光系数 21 X I O3 / M
· c m 计算 O 子的生成量 。
1
.
2
.
3 中性白细胞酶液的制备圈 : 中性白细
胞以 D u lb e e e o ` s 液悬浮 ,调节为 2 . 5只 1 0 4 细
胞 / m L ,用 10 m L 试管 , 加药物或等体积溶
剂 , 细胞悬液 250 拌L ,均设 4 个复管 ,置 37 ℃
水浴 ,震荡温孵 1 5 m i n , 加 1又 1 0一 “ m o l / L 细
胞松驰素 B 2 . 5 拜L ,温孵 5 m i n 再加 i 火 1 0 一 3
m ol L/ P A F 2
.
5 拼L 温孵 5 m in , 将试管移入
冰浴 ,终止反应 。 4 o o o r / m i n 离心 5 m i n ,取
上清作为释放酶液 , 另取细胞悬液 3 m L 在
冰浴下 用 S o n i p r e p l s o 细胞破碎仪 超声 1
m i n (强度 2 0 A m ) , 4 o o o r /m i n 离心 1 5 m i n ,
上清作为总酶液 。 取总酶液 1 m L ,于 80 ℃水
浴中灭活 15 m in ,作为灭活酶液 。
1
.
2
.
4 各葡糖昔酸酶的检测阁 : 依文献原理
改为微量法 。 采用 96 孔酶标板 ,每孔加释放
酶液 , 或 总 酶液 . 灭活 酶 液 25 拜L , .2 5 m
m ol / L 酚酞葡糖醛酸 25 拜L , 0 . 1 m ol / L 醋酸
缓冲液 ( p H 4 . 6 ) 1 0 0 “ L 。 置 3 7 C e o 。 温孵箱
内 l s h 。 每孔加 0 . 2 m o l / x J N a O H 乙0 0 拼L , 终
止反应并显色 。 在 5 50 n m 滤光片的酶标仪
上读数 。 计算酶释放量占总酶的百分数 。
1
.
2
.
5 溶菌酶的检测川 : 采用 96 孔酶材板 ,
每孔加 释放酶液 , 或总酶液 , 灭 活酶液 50
拼L , 0 . 2 4 m g /m L m i e r o e o e e u s L y s o d e ik t i e u s
(悬 浮于 0 . 1 m o l / I二 N a H : P O 4 , p H 6 . 5 ) 2 0 0
拜L ,置 3 7 C C O : 温孵箱内 1 5 m i n 。在 4 5 0 n m
滤光片酶标仪上读数 。 计算酶释放量占总酶
的百分数 。
2 实验和结果
2
.
1 赓香 一 1 对中性 白细胞产生 O 于的影响 :
中性 白细胞分别与终浓度为 1 、 10 、 1 0 拼g /
m L 的廉香 一 1 或对照溶剂温孵后 ,给药组 O 犷
生成 量分别 比对照组增 加 1 0 9% 、 2 1 0月和
2 91 % (见图 1 ) 。 表明房香 一 1 可 明显增加中性
白细胞 O子的产生 。
2
.
2 赓香一 1 对中性白细胞释放 价葡糖昔酸
《中草药》 1 9 9 8 年第 29 卷第 5 期
脚香 一 z (阳了m L )
图 1 磨香一 1对 P A F 激活的大鼠中性白细胞超氧
阴离子生成的影响临士 、 , 、 ~ 5)
二
P < 0
.
Q S
“ “
P < 0
.
0 1
` “ “
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.
0 0 1 (下同 )
重ǎ冲à粗睡盆枷拼资牌l公
度香 一 l( 阳 / m )L
图 2 磨香 1 对 P A F 激活的大鼠中性白细胞
p
一葡糖昔酸酶释放的影响任士 、 , n 一 5)
2 3 雳香一 1 对中性白细胞释放溶菌酶的影
响 : 中性 白细胞分别与终浓度为 10 、 3 、 1 0
拌g /m L 的赓香 一 1 或对照溶剂温孵后 , 给药组
溶菌酶的释放量分别 比对照组 降低 7% 、
1 4%和 21 % (见 图 3 ) 。 表明察香一 1可明显抑
制中性白细胞溶菌酶的释放 。
3 讨论
.3 1 中性 白细胞 活性氧生成 系 统是一种
N A D P H 氧化酶 ,为 4一 5 种胞内成分组成的
复合物 。氧化酶在正常情况下是无活性的 ,在
某些刺激剂作用下可被激活 。 激活的信号转
导途径被认为由受体 、 鸟昔酸结合蛋白 、磷脂
.
3 2 3
-
酶 C组成 。 磷脂酶 C可使磷脂酞肌醇解离成
肌醇三磷酸和甘油二酷 。 前者引起细胞内游
离钙增加 ,与甘油二醋协同导致蛋 白激酶 C
的激活 。 蛋白激酶 C 再激活氧化酶 。 在细胞
释放 O 子期间 , 氧化酶系统某些 蛋白的连续
磷酸化维持着氧化酶的安装和活性 状态 。 不
同的刺激均可引起 0 子的释放 , 只是氧化酶
系统的变化及与细胞骨架变化间的联系不尽
相同 。 本研究结果显示赓香 一 1 不抑制 P A F
引起的 O犷生成 ,而 明显增加 O 子生成 ,并与
剂量 呈 正 相关 , 表 明赓香一 1 本 身可 增 强
N A D P H 氧化酶的活性 。
:
庸香 一 1 (尸. /m L )
图 3 磨香一 1 对 P A F 激活的大鼠中性白细胞
溶菌酶释放的影响临士 、 , n 一 5)
.3 2 一般来说 ,抗氧化剂或氧 自由基清除剂
具有抗炎作用 。 察香 一 1 明显增加中性白细胞
0 子生成似乎与其抗炎作用相悖 , 但另一方
面却有利于宿主的防御机能 , 可能更适用于
有感染的炎症 。 有研究者专门合成抑制 5一脂
氧酶同时增加产生 O 子的化合物 , 以求在抗
炎的同时兼有抗微生物的作用 7j[ 。
3
.
3 中性 白细胞脱颗粒是炎症过程的一种
反应 ,释放一些杀灭微生物的酶类 ,这些产物
又会造成 自身组织损伤 ,是加剧炎症的次级
原因 。 日一葡糖普酸酶存在于嗜苯胺蓝颗粒 ,溶
菌酶存在于嗜苯胺蓝颗粒和特殊颗粒 。 实验
证明察香 一 1 对 件葡糖昔酸酶和溶菌酶的释
放均有抑制作用 ,可能是其抗炎作用的机制
之一 。 在 1 0 拜g /m L 浓度下 , 对前者释放的
抑制率明显高于后者 , 可能是对 2 种颗粒的
抑制作用不完全平行 。
参 考 文 献
l 朱秀媛 ,等 . 药学学报 , 1 9 5 5 , 2 5 ( 6 ) : 4 0 6
2 柳雪枚 ,等 . 动物学报 , 1 9 9 2 , 3 5 ( 3 ) : 3 0 2
3 Y u e T L
, e t a l
.
B i o e h im B i o P h y s A e t a
,
1 9 8 3
,
7 5 1
:
3 3 2
4 D a n i e l s R H
, e t a l
.
Im m u n o l o g y
,
19 92
,
7 5
:
1 57
5 F e in m a r k S J
, e t a l
.
F E B S L e t t e r s
,
1 9 8 1
,
1 3 6
:
1 4 1
6 J
a e o b s o n P B
, e t a l
.
J Im m u n o l
,
1 9 9 3
,
1 5 1
:
5 6 3 9
7 K o e a n G P
, e t a l
.
B i o e h e m P h a r m a e o l
,
1 9 9 4
, 4 7 ( 6 )
:
1 0 92
( 1 9 9 6
一
0 8
一
1 3 收稿
1 9 9 7
一
0 6
一
1 2 修 回 )
ǎ承à樱愈谧扭稗
E f f e c t o f M u s k G l u e o P r o t e i n o n C e r t a i n F u n e t i o n s o f R a t
N e u t r o P h i l A e t i v a t e d b y P A F i n v i t or
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Z h o u L o n g e n
, e t a l ( I n s t i t u t e o f M
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,
B e ij i
n g 1 0 0 0 5 0 )
A b s t r a e t E f f e e t o f m u s k
一
1
, a g l u e o p r o t e in e o m p o n e n t i s o l a t e d f r o m t h e w a t e r e x t r a e t o f m u s k
, o n e e r -
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a s s t u d i e d
.
Y i
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1 0 0 拌g /m IJ e a n in e r e a s e t h e y i e ld o f s u p e r o x id e a n i o n b y 2 0 9 %一 2 9 2% a n d a t d o s e s o f 1 0一 1 0 0拌g /m L e a n d e -
e r e a s e t h e r e le a s e o f 卜g l u e u r o n id a s e a n d ly s o z y m e b y 7% 一 5 1% a n d 7 % ~ 2 1 % , r e s p e e t iv e l y . I t 15 e o n e lu d e d
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一
3 2 4
.