全 文 ：紫草组织培养中细胞发育时期与紫草宁形成关系的研究
严海燕　曹日强
(南京大学生命科学院生物系 ,江苏 南京　 210093)
摘　要: 目的　植物细胞初生代谢是次生代谢的基础 ,与细胞的发育状态有关。从几个方面探讨细胞发育状态与色
素形成能力的关系。 方法　研究了接种量对营养生长期间细胞生长的影响 ,比较了营养生长阶段不同生长时期细
胞的色素形成能力 ,并检查了各发育时期细胞的分裂指数 ,同时测定了紫草宁合成阶段色素合成的时间进程。结果
接种量约每毫升培养基 0. 083～ 0. 117 g愈伤组织时 ,细胞生长良好。营养生长阶段细胞的发育时期和生理生化状
态与色素合成的能力密切相关。细胞分裂高峰期以后 ,细胞合成紫草宁的能力开始增加 ,细胞营养生长静止期色素
合成能力达到饱和。色素形成时期色素合成曲线同细胞生长曲线一样呈 S型。以上结果揭示 ,细胞首先满足自身基
本的生命活动 ,在此基础上才能积累中间或次生代谢物 ,因而细胞的发育时期与色素的形成能力密切相关。结论　
本研究为紫草组织培养工业化生产紫草宁提供了基本数据。
关键词: 紫草 ;紫草宁 ;细胞培养 ;细胞发育
中图分类号: S567　文献标识码: A　文章编号 : 0253 2670( 2001) 03 0264 03
Relationship between cell developmental stage and shikonin formation in
cell culture of Lithospermum erythrorhizon
YAN Hai-yan, CAO Ri-qiang
　　 ( Depa rtment o f Bio log y, Co lleg e of Life Sciences, Nanjing Univ ersity , Nanjing Jiangsu 210093, China)
Key words: Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc. ; shikonin; cell cul ture; cell development
　　紫草宁是多年生中草药紫草根中形成的次生代
谢产物。植物的次生代谢产物在植物发育到一定程
度才形成。在紫草组织培养生产紫草宁时 ,细胞的发
育、分化状态对色素的形成及产量有很大影响。虽然
对紫草组织培养的研究已有多年历史 ,但迄今在细
胞发育方面的研究未见报道。我们在这里探讨了紫
草细胞的发育状态对色素形成的影响 ,为优化生产
工艺提供基础。
1　材料和方法
1. 1　材料: 紫草 Lithospermum erythrorhizon Sieb.
et Zucc. 采自山东 ,取茎尖诱导愈伤组织。
1. 2　方法: 愈伤组织诱导培养基为 LS+ IAA 0. 5
mg /L+ 2, 4-D 0. 35 mg /L。 色素生产采用两步法:
营养生长阶段和色素形成阶段。 营养生长阶段采用
改良 B5培养基 ,色素形成阶段采用改良 M9培养
基 Ca ( NO3 ) 2· 4H2O 减半 , CuSO4· 5H2O 为 3
倍 ) [1 ]。 M9培养基见 Fuji ta等人 [2 ]。所有培养物都
在含有 30 mL培养基的 100 m L三角瓶中 , 25℃
下培养。接种量均为 2 g。营养生长在光下进行 ,继
代周期为 21 d。色素形成在暗中进行。所有处理为
3个重复。
色素含量测定:材料在 60℃ 下烘干 ,研磨 ,用
石油醚反复提取至无色。 提取液在 520 nm下测光
吸收。之后在标准曲线上查出浓度 ,求出材料的色素
含量 ( g% 材料干重 g )。
有丝分裂指数的测定: 有丝分裂指数为有丝分
裂相细胞数 /细胞总数× 100% ,细胞用碱性品红法
染色。
2　结果
2. 1　营养生长阶段 ,愈伤组织接种量与生长的关
系:图 1的结果表明 ,愈伤组织生物产量 ( 21 d)随接
种量的增加而增加 ,但接种量在 3. 5 g以上时 ,由于
培养基量与空间有限 ,愈伤组织很早就出现褐色 ,即
老化。
鲜重的绝对增加量最高点在接种量为 3. 5 g
处。接种量小于 3. 5 g时 ,鲜重的绝对增加量随接种
量的增加而增加。接种量大于 3. 5 g时 ,绝对增加量
有所下降。鲜重的相对增加量在接种量小于 2. 0 g
·264· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 3期
收稿日期: 2000-03-17作者简介:严海燕 , 1983年获武汉大学生物系遗传专业学士学位。 1983～ 1986,河南师范大学生物系遗传教研室助教。 1986～ 1989,南京大学生物系植物专业硕士研究生 ,从事国家七· 五攻关项目紫草组织培养形成色素的研究 , 1989年获硕士学位。 1989～ 1992年 ,中国科学院植物研究所助理研究员 ,继续从事紫草组织培养的工作 ,及芦苇抗盐、芹菜体细胞胚发生和人工种子的研究。
1992～ 1997,美国阿肯色大学园艺系攻读博士学位 ,从事淀粉合成及淀粉合酶的研究。 1997～ 1999,中国农业大学园艺系博士后。 1998～ 2000,北京大学生物技术系讲师。 发表文章 4篇。
图 1　营养生长培养基上愈伤组织接种量与生长
量的关系
时呈急剧下降的趋势 ,而在接种量 2. 0～ 4. 0 g间呈
十分缓慢的下降。 结果表明 ,接种量小于 2. 0 g时 ,
由于营养供给充分 ,愈伤组织能充分的生长 ,但绝对
鲜重的增加未达到高峰 ,养料未能充分利用。接种量
在 2. 5～ 4. 0 g范围内 ,营养利用较为充分 ,同时生
物量也有较大增加 ,此时平均每毫升培养基供应
0. 083～ 0. 117 g愈伤组织生长。接种量在 4. 0 g以
上时 ,养料供给不足 ,生物量的绝对增加量下降。
2. 2　愈伤组织营养生长阶段的生长时间与色素产
量的关系:愈伤组织形成色素能力与其所处的营养
生长阶段有关。图 2中的生长曲线表明 ,营养生长期
间 ,接种后 0～ 3 d中 ,愈伤组织鲜重没有增加 ,细胞
处于延迟期 ; 3～ 21 d,鲜重近似直线地增加 ,处于对
数生长期: 21 d后 ,鲜重增加缓慢 ,细胞进入稳定
期。因此 ,在我们的培养条件下 , 21 d为继代周期较
为合适。图 2中与生长曲线相对应的色素形成曲线
表明 ,营养生长阶段第 12～ 21天的细胞色素合成
能力随着在营养培养基上生长时间的延长而增加 ;
在营养培养基上培养 21 d以上的细胞 ,其色素合成
能力随时间的延长而下降。
2. 3　愈伤组织营养生长过程中有丝分裂指数的变
化:营养生长期间愈伤组织在转入生长培养基后的
0～ 8 d处于活跃分裂状态 (图 3) , 8～ 10 d细胞分裂
急剧下降 , 10 d以后愈伤组织的细胞分裂维持在少
量水平。
2. 4　色素形成培养基上色素形成的时间进程: 在色
素形成培养基上 ,在营养培养基上生长了 21 d的细
胞移入后的 24 d内 ,色素的产量随时间的增加而增
加 , 24 d以后 ,产量趋于稳定 (图 4)。因而愈伤组织
收获时间在 24 d较为合适。
3　讨论
愈伤组织对培养基的充分利用及生长状态与接
　　* 所有用于色素测定的愈伤组织都是在色素形成
培养基上培养 33 d后收取测定的 , 0 d时生长量为 0。
图 2　营养生长阶段愈伤组织所处的阶段与其色
素形成能力的关系*
图 3　营养生长期间有丝分裂指数变化
的时间进程
图 4　色素形成培养基上色素形成的时间进程
种量有关。在本文的结果中 ,接种量不足 ,虽然生长
充分 ,但生物产量也不足。接种量过大 ,养料供给不
足 ,生物量的绝对增加量下降 ,同时愈伤组织的生理
·265·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 3期
生化状态趋于老化 ,形成的次生代谢物对营养生长
和色素的形成均不利。
愈伤组织在色素形成培养基上形成色素的能力
与转入色素形成培养基时细胞的分化状态有密切关
系。综合图 2～ 4的结果 ,在营养培养基上生长了 12
d以前的愈伤组织 ,处于活跃的分裂和细胞增殖状
态 ,转入色素形成培养基后 ,色素形成很少。表明这
些细胞的能量及代谢集中于新细胞的建成活动 ,形
成色素的生理生化条件尚未成熟。在营养培养基上
生长 12～ 21 d的细胞 ,其色素形成的能力与其在生
长培养基上的生长曲线类似 ,随着在生长培养基上
生长的时间而提高。这意味着细胞分裂高峰期后的
一段时间里 ,细胞在生长的同时 ,为色素的形成准备
着必要的生理生化条件。而在营养生长阶段处于生
长静止期的细胞 ,其色素形成能力也处于稳定。表明
静止期的细胞形成色素的能力达到饱和。由此 ,在生
产工艺上 ,营养生长阶段为 21 d较为合适。
细胞在色素形成培养基上形成色素 ,也有类似
于生长曲线的时间过程。 色素形成达到饱和的起始
时间是 21 d ,因而愈伤组织的收获时间选为 21 d。
在工艺上营养生长和色素形成的时间均为 21 d,整
个周期共计 42 d。
虽然我们对固体培养基中紫草宁的生产工艺进
行了研究 ,但液体培养基中细胞的生长和色素形成
条件又有不同 ,因而细胞生长和色素形成的规律也
会有区别。另外 ,营养生长期间 ,在不同时期长期继
代培养的细胞 ,如果再进入色素生产周期 ,是否对色
素形成有影响? 营养生长阶段对形成色素有利的生
理生化因子是那些? 都有待于进一步探讨。
致谢:王纯波同志在有丝分裂指数方面所做的
工作。
参考文献:
[ 1 ]　严海燕 . 紫草愈伤组织形成色素初探 [D ]. 南京: 南京大学生
物系 , 1989.
[ 2 ]　 Fujita Y, Hara Y, Suga C, et al . Production of shik onin
derivativ es by cel l s uspension cultures of Lithospermum ery -
th rorh izon [ J ]. Plant Cell Reports , 1981( 1): 61-63.
豆蔻内掺杂物的鉴别
包　霞
(内蒙赤峰天奇制药有限责任公司 ,内蒙古 赤峰　 024000)
中图分类号: 282. 5　　　文献标识码: B　　　文献编号: 0253 2670( 2001) 03 0266 01
　　豆蔻为 2000年版《中国药典》一部收载的原豆
蔻 Amomum kravanh Pierre ex Gagnep的干燥或熟
果实。 我们发现有不法商贩利用白矾水浸泡后干燥
而成的豆蔻。 鉴别如下 ,应引起注意。
1　性状
具有原豆蔻的性状特征 ,只是光照药材表面有
闪烁的亮点 ,剥开果实 ,有的种子表面有明显的白
霜 ,口尝均有白矾的酸、微甘及涩味。
2　鉴别
剥开果皮 ,选种子附着白霜多者 ,一部分用适量
水浸泡 ,浸泡液作为供试液 ;另一部分刮取种子附着
的白霜粉末 ,作为供试品 ,进行铝盐、钾盐与硫酸盐
的鉴别反应。
2. 1　钾盐的鉴别反应:①取铂丝 ,用盐酸湿润后 ,蘸
取供试品 ,在无色火焰中燃烧 ,火焰即显紫色。②供
试品 ,加热炽灼除去铵盐 ,放冷后 ,加热溶解 ,再加
0. 1% 四苯硼钠溶液与醋酸 ,即生成白色沉淀。
2. 2　铝盐的鉴别:①供试液加氢氧化钠试液 ,即生
成白色胶状沉淀 ;沉淀能在过量的氢氧化钠试液中
溶解。②供试液加氨试液至生成白色胶状沉淀 ,滴加
茜素磺酸钠指示液数滴 ,沉淀即显樱红色。
2. 3　硫酸盐的鉴别: ①供试液加氯化钡试液 ,即生
成白色沉淀 ;沉淀在盐酸或硝酸中不溶解。②供试液
加醋酸铅试液 ,即生成白色沉淀 ;沉淀在醋酸铵试液
或氢氧化钠试液中溶解。③供试液加盐酸 ,不生成白
色沉淀。
·266· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 3期
收稿日期: 2000 11 15作者简介:包　霞 ( 1967-) ,女 ,执业药师、主管药师 ,内蒙古锡林浩特人 , 1989年毕业于沈阳药科大学中药系 ,获药学学士学位。现在内蒙赤峰天奇制药有限责任公司工作 ,主要从事质量监督管理及技术管理工作。