全 文 ：RAPD技术在葛属药用植物分类和鉴定中的应用
第二军医大学药学院 (上海 200433)　　曾　明 　严继舟* * 　张汉明　郑水庆　苏中武
摘　要　为探讨葛属植物间的亲缘关系 ,并为分类和鉴定提供依据 ,采用 RAPD技术对葛属 6种植物进行分析 ,
利用 RAPD( Ver sion 4. 0)及 PHYLIP( Ve rsion 3. 5 C)软件包进行数据处理 , UPGM A法聚类分析得到系统树。结
果发现 ,峨嵋葛与野葛间的遗传距离小 ,应归并为野葛 ,野葛与粉葛、山葛间的遗传距离大 ,粉葛、山葛应独立成种。
DN A指纹图谱可用于葛属植物间的鉴别。
关键词　葛属　分类　鉴定　 RAPD
Classification and Authentication of PlantPueraria DC in China Using RAPD
　　 Co llege o f Pharmacy, Second M ilitar y Medical Unive rsity ( Shanghai 200433)　 Zeng M ing , Yan Jizhou,
Zhang Hanming , Zheng Sh uiqing and Su Zhongwu
Abstract　　 To explo re the af fini ty rela tion of Pueraria DC plants and to prov ide evidence
fo r thei r classification and authentica tion, RAPD analy sis w as perfo rmed on 6 species of Pueraria
DC found in China. The DN A fingerprints w as analy sed w ith the aid o f RAPD ( Version 4. 0) and
PHYLIP ( Version 3. 5 C) . The results show ed that the genetic distance of P .omeiesis was close to
P. lobata , while that betw een P. lobata and P. thomsonii and P. montana were longer in evolution.
Therefore, i t could be concluded that P. thomsonii and P. montana were not the variants of P. lo-
bata , but wa s another independent species. RAPD amplification fing erprinting can also be used to
identi fy Pruearia DC plants.
Key words　　Pueraria DC.　 classi fication　 authentication　 RAPD
　　葛根是一种常用的中药 ,来源于豆科植物野葛
Pueraria lobata ( w illd. ) Ohwi、粉葛 P . thomsonii
Benth. 的干燥的根。 葛属植物中野葛 P. lobata
( Willd. ) Ohw i、粉葛 P. thomsonii Benth.、山葛 P.
montana ( Lour. ) M err. 及 峨嵋 葛 P. omeiensis
Wang et Tang ,由于植物形态的相近 ,在其分种的界
限及亲缘关系上一直存在争议。 90年代以来 , RAPD
标记广泛应用于动植物遗传育种 ,基因诊断 ,居群遗
传学 ,生物系统与进化研究。就传统方法而言 ,植物体
内个体之间的遗传鉴定以及亲缘关系是综合考虑其
形态学特征或是通过生物化学方法检测 (如同工酶分
析 )来确定的。但这些方法容易受到环境的影响 ,而且
人们对其评估遗传亲缘关系的总体可靠性也存在一
些争议 ( Got lieb [1 ] , Brow n[2 ] ) ,因此目前人们普遍认
为 DNA水平上的多态性信息对于评判遗传多样性
来说是可靠而可行的。为此 ,我们试用 RAPD技术对
以上 4种植物以及分种明确的葛属的其它 2种植物
进行了对比研究 ,以确定它们之间的分类位置 ,并为
中药葛根的鉴别提供一种新的方法。
1　材料
取葛属 6种植物的干燥成熟叶 ,拉丁学名经作
者鉴定 ,见表 1。
2　实验方法
2. 1　 DNA的提取
2. 1. 1　试剂: 2× CTAB提取缓冲液: 100 mmol /L
Tris-HCl ( pH8. 0) ; 1. 4 mol /L NaCl; 20 mmol /L
EDT A; 2% 十六烷基三甲基溴化铵 ; 0. 5% 2-巯基
乙醇 ; 1. 5% PV P ( MW 40 000)。 3 mol /L NaAc
( pH5. 2) ,异丙醇。 T E缓冲液: 10 mmo l /L Tris-
HCl, 1 mmo l /L EDTA。5× TBE缓冲液: 54 g Tris;
碱: 27. 5 g 硼酸 , 20 mL 0. 5 mo l /L EDTA ( pH
8. 0) ;加蒸馏水至 1 000 mL。
引物由上海 Sangon有限公司合成 ,见表 2。
2. 1. 2　方法:参考文献 [3 ]加以改进。 硅胶干燥后的
干叶 ,置研钵中 ,用液氮冷却碾碎。取 100 mg加入 6
倍预热至 56℃ 的 CT AB提取缓冲液 , 10μL Pro-
teinase K, 4μL RNaseA及 10μL 2-ME水浴中温
育 30 min。加等体积 Cl( 24∶ 1)抽提 , 1 500 g离心
10 min。取上清液加 2 /3体积的异丙醇及 1 /10体积
的 3 mol /L NaAc,倒置完全混匀 , 0℃ 放置 20
min,以 1 000 g离心 10 min,倾去上清液 ,用 80%
和 70% 乙醇洗 DNA两次 ,室温干燥 30 min,加适
·620· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2000年第 31卷第 8期
Address: Zeng Ming , College of Pharmacy, Second Mili t ary Medical University, Shangh ai现在华东师范大学生命科学院博士后流动站
* * 第一军医大学热带病研究所
表 1　基因组 DNA的纯度和浓度
基　原 产地 采收期
(年 -月 -日 ) 凭证标本号 纯度
浓度
(ng /μL)
野葛 Puerar ia lobata 四川峨嵋 1998-10-06 1301 1. 33 500
峨嵋葛 P.omeinsi s 四川峨嵋 1998-10-06 3104 1. 19 1262
粉葛 P. thomsonii 广西平南 1998-09-06 6302 1. 65 810
山葛 P. montana 福建福州 1998-07-27 2103 1. 02 850
苦葛 P. peduncu lari s 四川峨嵋 1998-08-21 5103 1. 90 1031
三裂叶葛 P. phaseoloides 广东广州 1998-09-06 4301 1. 23 579
表 2　 RAPD扩增中使用的引物
名称 DN A系列 名称 DNA系列
OPA-02 T GCCGAGCTG O PH-12 ACGCGCA TGT
OPA-03 AGTCAGCCAC O PH-13 GACGCCACAC
OPB-18 CCACAGCAGT O PH-14 ACCAGGT TGG
OPC-06 GAACGGACTC O PL-07 AGGCGGGAAC
OPD-02 GGACCCAACC O PL-09 TGCGAG AGTC
OPF-08 GGGAT ATCGG O PL-11 ACGA TGAGCC
OPH-01 GGTCGGAGAA O PO-05 CCCAGTCACT
OPH-02 TCGGACGT GA O PR-02 CACAGCTGCC
OPH-03 AGACGTCCAC S632 AACCGGGACT
OPH-04 GGAAG TCGCC S680 GT TGCCTT GA
OPH-05 AGTCG TCCCC S726 GAGGACAAAG
OPH-11 CT TCCGCAG T
量 T E缓冲液溶解 DNA,存于 4℃ 备用。
2. 2　 DNA定性定量检测
2. 2. 1　 DNA分子长度:取 5μL提取的 DNA溶液
于 1%琼脂糖凝胶上 ,用 0. 5× TBE电泳缓冲液在
10 V /cm电泳 1 h后 ,琼脂胶上 DNA谱带通过 EB
染色后 ,在紫外光 ( 254 nm )下观察并照相。 DNA分
子长度与 λHindⅢ标记物 (华美生物工程公司 )比
较 (图 1)。
2. 2. 2　 DNA溶液纯度及得率:取一定量 DNA溶
液稀释后于 UV-265 FW上测定 A260及 A280值。
DNA纯度按 A260 / A280之比值判断 ,得率按浓度
A260× 50μg /mL值计算 (表 1)。
2. 3　 DNA扩增 :取约 10 ng样品 DNA,加入 0. 2
mmol /L dN T Ps 0. 2μmol /L引物 , 1. 5 mmo l Mg-
Cl2 , 1 U Tag DN A聚合酶及 10× Tag缓冲液 ,双蒸
馏水使最终反应体积为 20μL,置于 480型 PCR扩
增仪 ( Perkin Elmers) ,按下述参数进行 1个 PCR
循环: 94℃ , 1 min 30 s; 40个循环: 94℃ , 1 min ; 36
℃ , 1 min; 72℃ , 1 min。 1个循环: 72℃ , 7 min。从
近 50个随机引物中挑选出 22个扩增出的 DNA谱
带能表现丰富的多态性的引物进行扩增。
2. 4　 PCR扩增产物检测:取 PCR反应 10μL于
1. 5% 琼脂糖凝胶上用 0. 5× TBE电泳缓冲液电
泳 , PCR扩增产物长度与 100 bp DN A ladder( Fer-
mentas Ltd. # SM 0321- 10 )标记物比较 (图 2)。
　　　　 M 1301 3104 6302 2103 4301 5103　　　　　　　 N 1 2 3 4 5 6　M　　 1 2 3 4 5 6　　 1 2 3 4 5 6　 　 1 2 3 4 5 6
　　　 M-λHindⅢ DN A分子标记物　　　　 　　　 1-1301　 2-3104　 3-6302　 4-2103　 5-4301　 6-5103　 N-阴性对照
　　　　　　 M-100 bp DN A ladder分子标记物
图 1　基因组 DNA琼脂糖凝胶电泳图谱　　　　　　图 2　野葛和其它 5种植物的 RAPD指纹图谱
2. 5　数据分析: 统计能产生多态位点的引物 ,在
DNA样品中扩增的 RAPD标记数与多态性 RAPD
标记数记录原始数据 ,利用 RAPD( V ersion 4. 0)及
PHY LIP( V ersion 3. 5C)软件包进行数据处理 ,采
用 U PGM A法聚类分析得到系统树。
3　结果
3. 1　 DIST 分析按 Cavalli-Sfov za Arc Disteance
( AD)
[ 4]计算得到的种群间的遗传距离 ( AD上三
角 )和遗传一致 (下三角 )矩阵及 U PGM A系统树。
见表 3和图 3。
3. 2 DIST FF分析按 Manhat tan Distance ( MD) [5 ]
计算得到的矩阵及 U PGMA树。 见表 4和图 4。
图 3　 6种葛属植物 RAPD　图 4　 6种葛属植物 RAPD
聚类树系图 (AD) 聚类树系图 (MD)
·621·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2000年第 31卷第 8期
表 3　葛 6个种群间的遗传距离和遗传一致性 (AD)
1301 3104 6302 2103 4301 5103
1301 0. 0000 0. 6256 0. 4208 0. 5534 0. 4732 0. 5113
3104 0. 4690 0. 0000 0. 5191 0. 5630 0. 4796 0. 5191
6302 0. 6856 0. 6557 0. 0000 0. 5002 0. 4639 0. 4669
2103 0. 5916 0. 5745 0. 6928 0. 0000 0. 4966 0. 5582
4301 0. 7483 0. 7348 0. 7681 0. 7000 0. 0000 0. 5113
5103 0. 6708 0. 6557 0. 7616 0. 5831 0. 6708 0. 0000
表 4　 6种葛间的遗传距离 (MD)和遗传一致性 (MD)
1301 3104 6302 2103 4301 5103
1301 0. 0000 0. 8025 0. 6250 0. 7047 0. 5712 0. 6376
3104 0. 2200 0. 0000 0. 6505 0. 7189 0. 5827 0. 6505
6302 0. 4700 0. 4300 0. 0000 0. 6188 0. 5543 0. 5599
2103 0. 3500 0. 3300 0. 4800 0. 0000 0. 6127 0. 7118
4301 0. 5600 0. 5400 0. 5800 0. 4900 0. 0000 0. 6376
5103 0. 4500 0. 4300 0. 5800 0. 3400 0. 4500 0. 0000
3. 3　 Bootstrapped计算 100次后得到的 consen-
sus树
4　讨论
4. 1　 DIST 分析分别按 Cavalli-Sfov za Arc Dis-
tance( AD)
[ 4]和 Manha ttan Distance( MD) [5 ]两种方
法计算得出遗传距离矩阵 ,并由此矩阵得到系统树
(图 3和图 4) ,两种方法得出的结果是一致的。DIST
分析的可信度可用 Boo tst rap一致性分析 [6 ]检验 ,
若 Bootst rap分数> 90% ,则支持 DIST所做出的
推论 ,可信限大。
4. 2　峨嵋葛与野葛之间的遗传距离小 ,相似一致性
大: Boo tst rap分析计算 100次 ,二者有 97次聚在一
起 ,未达到种间的差别 ,根据这一结果 ,峨嵋葛独立
成种显然不合适 ,应归并为野葛。野葛与其它种间遗
传距离远近顺序依次为三裂叶葛、粉葛、苦葛和山
葛 ,相似一致性则相反 ,说明野葛与它们的亲缘关系
远近依次为三裂叶葛、粉葛、苦葛和山葛。野葛与粉
葛间的遗传距离大 ,野葛与山葛间的遗传距离虽较
其它种间小 ,但不足以说明是种内差异: Bootst rap
运算的结果也支持这一结论 ,即粉葛、山葛应分别独
立成种。 综上所述 ,我们支持陈忠毅 [7 ]的观点 ,即粉
葛不应作为野葛的变种 ,而应独立成种 ;峨嵋葛作为
一个独立的种 ,不能成立 ,但我们认为峨嵋葛应归属
于野葛 ,而不是山葛。 我们认为陈忠毅和 Van Der
Maesen
[8 ]将山葛作为野葛变种的处理值得商榷 ,山
葛以独立成种较为合理。
4. 3　从 DN A指纹图谱上可看出 ,各植物间有明显
的差异 , RAPD扩增反应产生 DNA指纹图谱可作
为中药葛根及同属原植物鉴别的依据。
致谢:中国科学院植物研究所邹喻苹教授、谢中
稳博士及复旦大学遗传研究所盛小禹老师在本实验
中给予热心指导和帮助 ,在此致以诚挚的谢意。
参 考 文 献
1　 Got llied L D. Ann Mo Bo t Gard, 1977, 64: 161
2　 Brow n A H D. Theor Appl Genet, 1979, 15: 1
3　 M urray M G, Th ompson W F. Nucleic Acids Res, 1980, 8: 4321
4　 Gavalli-Sforza. Ev olution, 1967, 21: 550
5　Wrigh t S. Evolution and Genet ics of Populations. V ol. 4. Chica-
go: Univ ersi ty of Chicago Press , 1978: 16
6　 Wes t D W. Heredity, 1996, 4: 25
7　陈忠毅 ,张奠湘 . 热带亚热带植物学报 , 1995, ( 1): 35
8　 Maesen L J G,V an Der. Ag r Univ Wagen Pap, 1985, ( 1): 37
( 1999-11-23收稿 )
黄瓜香的形态组织鉴定
湖北省襄樊市药品检验所 ( 441021)　　张　勤
摘　要　对黄瓜香 Tricyrits maculata ( D. Don) Mach ride药材性状、组织、粉末进行鉴定。 黄瓜香茎横切面结构、叶
上下表面特征及非腺毛为其鉴定特征。
关键词　黄瓜香　药材性状　显微特征
Pharmacognostical Identification of the Stem and Leaf of Tricyrt is maculata
　　Xiang fan Institute fo r Drug Contro l in Hubei ( Xiang fan 441021)　 Zhang Qin
Abstract　　 Pha rmacogno stical identification of Tricyrtis maculata ( D. Don) Machride, including i ts
·622· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2000年第 31卷第 8期
Address: Zhang Qin, Xiangfan Ins ti tute fo r Drug Cont rol , Xiangfan张　勤　 1982年 8月毕业于湖北中医学院中药系 ,获中药专业学士学位。 旋即就职于湖北省襄樊市药品检验所中药室工作至今 ,现任副主任药师。 先后有“ 草的形态组织鉴定”等 5篇文章刊登在国家级自然科学核心期刊《中药材》上 ,有“三七片的掺伪鉴定”等 3篇文章刊登在省级刊物《时珍国医国药》上。