全 文 ：·药剂与工艺·
一种判定多糖中有无糖醛酸残基的简易新方法
刘翠平 ,董　群 ,方积年
(中国科学院上海生命科学研究院上海药物研究所 ,上海　 200031)
摘　要: 目的　建立一种判定多糖中有无糖醛酸残基的简便可靠的方法。方法　采用 TLC分析了含糖醛酸的多糖
还原前后的样品以及标准葡聚糖分别酸水解 2和 4 h的产物 ,以探讨传统 TLC方法是否可靠。并将含糖醛酸的多
糖及中性多糖完全酸水解产物进行 TLC检测 ,糖醛酸标准品为对照 ,以苯胺 -邻苯二甲酸显色检测糖醛酸 ,此外 ,
考察了其灵敏度 ,并与已有的方法比较。结果　传统方法中的荧光斑点系由 CF3 COOCH3以及反应过程中其他副产
物产生的 ,并非糖醛酸产生。 新法可检测出 0. 5μg的糖醛酸 ,无假阳性结果。 结论　传统方法缺乏必要的理论依
据 ,容易误导结构研究。以糖醛酸标准品为对照 ,对多糖样品完全酸水解产物进行薄层层析后 ,采用苯胺 -邻苯二甲
酸显色能可靠地判定糖醛酸的有无。
关键词: 糖醛酸 ;多糖 ;方法学研究
中图分类号: R927. 2　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 05 0404 04
New simple method to detect uronic acids in polysaccharides
LIU Cui-ping , DONG Qun, FANG Ji-nian
　　 ( Shanghai Institute o f Mate ria M edica, Chinese Academ y of Sciences, Shanghai 200031, China)
Abstract: Object　 To develop a simple and reliable method to detect the presence o f uronic acids in
poly saccha rides. Methods　 Uronic acid containing polysaccharides and standard g lucons w ere subjected to
acid hydrosis fo r 2 h and 4 h respectiv ely. Samples o f the products, before and af ter hydrolysis were ana-
ly zed by TLC using standard uronic acid as the contro l and aminobenzen-alizaric acid as the chromogenic a-
gent , to compa re the sensi tivi ties in the detection o f uronic acid used in the present conventional analy sis.
Results　 The f luorescent spo ts used as criterion in t raditional TLC method w ere no t show n by uronic
acids, but by CF3COO CH3 and o ther by-products in reaction. 0. 5μg of uronic acid could be detected w ith
our method, wi thout false posi tiv e reaction . Conclusion　 The tradi tional T LC method seemed to lack the-
o rectical backg round and may mislead structural study. The present method in mo re reliable to detect
uronic acids in poly saccha rides by analy zing the complete hydro lytic products of po lysaccharides using T LC
w ith standard uronic acids as contro l and aminobenzene-aliza ric acid as ch romogenic agent.
Key words: uronic acid; poly saccha rides; methodolog y studies
　　对从天然植物中得到的多糖 ,在结构研究中尤
其对糖组成分析 ,确定其中是否含有糖醛酸残基具
有极为重要的意义。过去许多实验室沿袭的判定方
法是: 将多糖样品以 2 mo l /L CF3 COOH溶液于
110℃水解 2 h后 ,减压浓缩蒸干 ,加 MeOH处理 ,
减 压蒸 干 , 重复 以 上操 作 4～ 5 次 以除 尽
CF3 COOH,加入适量 H2O使溶解 ,再将该溶液进行
薄层层析后置紫外灯下观察 ,以有无荧光滞后
( Rf < RfGlc )斑点来确定是否含有糖醛酸。该法应用
广泛 ,不仅在多糖组成分析中 ,而且在糖醛酸还原后
确定是否将糖醛酸还原完全时也要用到。我们在实
验过程中发现该法缺乏必要的理论依据 ,容易误导
结构研究。为此 ,我们对此法进行了深入探讨 ,并提
出了一种简便的判定多糖中有无糖醛酸的新方法。
1　仪器与试剂
Sarto rius分析天平 , ZD-2型自动电位滴定计 ,
三用紫外分析仪 , 722光栅分光光度计 ,纤维素板为
Merck出品 ;葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、阿
拉伯糖为 Fluka产品 ; Dex tran T-71及 T-700为
Pharmacia 产品 ; CF3 COOH与 N -cyclohexyl-N′-
·404· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 5期
收稿日期: 2000-09-30作者简介:刘翠平 ( 1973-) ,女 ,湖北天门市人。 1995年毕业于湖北中医学院药学系 ,学士 ; 1998年毕业于河南中医学院中药系 ,硕士 ;现为中科院上海药物研究所博士生 ,师从方积年教授从事天然活性多糖的研究。
* 通讯联系人:方积年研究员　 Tel: ( 021) 64311833601　　 Fax: ( 021) 64370269　 E-mai l: jnfang@ mai l. shcnc. ac. cn
[ 2-( N -methy lmo rpholino ) -ethyl ] carbodiimid-4
(以下简称 CMC) ,均为 Merck-Schuchardt产品 ;间
羟基联苯为 Aldrich产品 ;含糖醛酸的多糖样品
CPB-0. 5、 E55及 J4为本实验室制备。其他试剂均为
国产 AR级。
2　实验方法
2. 1　样品处理: 将含有糖醛酸的多糖样品 CPB-
0. 5及 E55各 15 mg ,按文献 [1 ]方法以 CMC还原 3
次后 ,对水透析 ,冷冻干燥。 取冷冻干燥后的样品各
2 mg ,加入 2 mol /L CF3 COOH溶液 3 mL,封管后 ,
110℃ 水解 2 h。水解液于 40℃ 减压浓缩蒸干 ,加
入 MeOH处理 ,减压蒸干 ,重复 4～ 5次以除尽
CF3 COOH。再加入 0. 2 mL H2O使溶解 ,所得产物
分别依次命名为 RCPB-2和 RE55-2,供试。
另取 3次还原糖醛酸后的多糖样品 CPB-0. 5
及 E55各 2 mg ,按上述条件水解 4 h,其余操作同
上 ,所得水解产物的水溶液分别依次命名为 RCPB-
4和 RE55-4,供试。
取葡萄糖、 Dex tran T-71、 T-700各两份 ,每份 2
mg,另取两只洁净的试管 ,不加任何样品 ,向以上 8
只试管中加入 2 mo l /L CF3 COOH溶液 3 mL,封管
后 ,一份于 100℃ 水解 2 h,另一份水解 4 h,其余操
作同上 ,所得产物分别依次命名为 Glc-2, Glc-4,
T71-2, T71-4, T700-2, T700-4, Contr-2和 Contr-
4,供试。
取 CPB-0. 5、 E55及 J4各 2 mg ,按上述条件水
解 4 h,其余操作同上 ,所得水解产物的水溶液分别
依次命名为 CPB-4、 E55-4和 J4 -4h,供试。
2. 2　薄层检测: 取以上样品 RE55-2、 RE55-4、
RCPB-2和 RCPB-4各 5μL,点样于同一张纤维板
上 ,以葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸为对照进行薄层层
析 ,展开剂为乙酸乙酯 -吡啶 -醋酸 -水 ( 5∶ 5∶ 1∶
3 )。 展开后 ,挥干溶剂 ,置紫外灯下 ( 254 nm+ 365
nm)观察 (图 1-1) ,然后用苯胺 -邻苯二甲酸显色 [2 ]
(图 1-2)。
另取 CPB-4、 E55-4各 5μL,点样于纤维素板
上 ,以 CMC和 CF3 COOH为对照 ,按上述条件层
析 ,展开后 ,挥干溶剂 ,置紫外灯下观察。
另 取 Glc-2、 Glc-4、 T71-2、 T71-4、 T700-2、
T700-4各 5μL, Contr-2和 Contr-4各 10μL,以标
准葡萄糖为对照进行薄层层析 ,条件同上。展开后 ,
挥干溶剂 ,置紫外灯下观察 (图 1-3)。
另取 T700-4、 CPB-4、 E55-4和 J4-4各 5μL,点
样于纤维素板上 ,以葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸为对照
进行薄层层析。层析条件同上。展开后 ,挥干溶剂后
用苯胺-邻苯二甲酸显色 (图 1-4)。
2. 3　糖醛酸薄层检测限的考察:称取干燥至恒重的
葡萄糖醛酸 5. 432 mg及半乳糖醛酸 6. 664 mg ,加
入少量 H2O使溶解 ,定容至 5 mL。 分别取该溶液
2, 1和 0. 5μL点样于纤维素板上 ,按上述条件薄层
层析后 ,挥干溶剂 ,用苯胺 -邻苯二甲酸显色 (图
1-5)。
　水解产物紫外灯下
1-RE55-2
2-RE55-4
3-RCPB-2
4-RCPB-4
5-GlcAc
6-Gal Ac
水解物苯胺 -邻苯二甲
酸显色
1-RE55-2
2-RE55-4
3-RCPB-2
4-RCPB-4
5-GlcAc
6-GalAc
葡萄糖及葡聚糖标准
品处理前、后紫外灯下
1-Glc-2　 2-Glc-4
3-T71-2　 4-T71-4
5-T700-2
6-T700-4
7-Con t r-2
8-Con t r-4
9-Glc
含糖醛酸的多糖和葡
聚糖水解 4 h产物苯
胺 -邻苯二甲酸显色
1-T700-4
2-CPB-4
3-Glc Ac
4-GalAc
5-E55-4
6-J4-4
苯胺 -邻苯二甲酸对葡
萄糖醛酸与半乳糖醛
酸检测限
1-Glc Ac-2
2-Glc Ac-1
3-Glc Ac-0. 5
4-GalAc-2
5-GalAc-1
6-GalAc-0. 5
图 1　样品薄层检测结果
·405·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 5期
2. 4　对间羟基联苯法检测糖醛酸检测限的考察:参
照文献 [3 ]方法 ,以 0. 5, 1, 2, 3, 4μg对以上葡萄糖醛
酸、半乳糖醛酸溶液考察。为考察该法是否受中性糖
残基的干扰 ,每个样品中加入等体积的葡萄糖和阿
拉伯糖的混合溶液 (称取 4. 3 mg葡萄糖和 6. 6 mg
阿拉伯糖 ,加入少量水使溶解 ,定容至 5 mL) ,并以
相应体积的葡萄糖和阿拉伯糖的混合溶液为空白对
照 ,加水稀释至 0. 2 mL,加入 1. 2 m L硫酸 /硼砂溶
液 ,冰浴冷却 ,再于沸水加热 5 min,然后冰浴冷却 ,
加入 20μL间羟基联苯溶液 ,肉眼观察溶液的颜色
变化 ,每个梯度及相应空白样品平行操作两次 ,结果
见表 1。
表 1　间羟基联苯法检测灵敏度
加样量 (μL) 0. 5 0. 5 1 1 2 2 3 3 4 4
Glc+ Ara 无色 无色 无色 无色 无色 无色 无色 无色 无色 无色
Glc+ Ara+ GlcAc 无色 无色 淡红 淡红 品红 品红 品红 品红 品红 品红
Glc+ Ara+ GalAc 无色 无色 淡红 淡红 品红 品红 品红 品红 品红
3　结果与讨论
从图 1-1, -2可以看出 ,葡萄糖醛酸及半乳糖醛
酸这两种糖醛酸无论在紫外灯下还是苯胺 -邻苯二
甲酸显色后的行为均与图中所示的荧光斑点大相径
庭。如果传统 TLC检测方法是正确的 ,那么 ,经过
糖醛酸还原 3次的 CPB-0. 5及 E55酸水解 4 h后
的样品显色后 ,在 Rf值相应于荧光斑点处应显示
出糖醛酸应有的红棕色斑点 ,而由图可看出并非如
此 ,说明该荧光斑点并不是由糖醛酸产生的。理论上
讲 ,糖醛酸结构中并没有共轭系统 ,在其羰基附近也
没有什么发色团或助色团 ,因此是不可能产生荧光
的 ,这可以由紫外灯下观测的结果 (图 1-1)得到证
实。因此 ,传统的检测方法以 Rf值小于葡萄糖处出
现荧光滞后斑点来确认多糖样品中含有糖醛酸 ,这
缺乏足够的理论依据。因为即便是在水解 2 h条件
下 ,糖醛酸与相连的中性或酸性糖残基也未被水解 ,
那么该寡糖片段也不可能产生荧光。
为进一步阐明该荧光斑点为何物 ,将 E55-4和
CPB-4点样于同一张纤维素板上 ,并以 CMC和
CF3 COOH为对照 ,层析结果表明 CMC在紫外灯
下无荧光 ,而 CF3 COOH虽有荧光 ,但在该层析条
件下位于原点 ,说明该荧光斑点并非 CMC和
CF3 COOH产生。将葡萄糖、 Dex tran T-71、 T-700分
别水解 2, 4 h,并制备空白样品各 1份 ,层析后紫外
灯下观察 ,发现 8个样品均在 Rf值小于葡萄糖处
出现相同的荧光斑点 ,唯有未经以上水解及 MeOH
处理的葡萄糖水溶液层析后未出现荧光斑点 (图 1-
3) ,由此说明该荧光斑点系减压浓缩过程中加
MeOH处理时产生的 CF3 COOCH3及其他反应副产
物产生的。因此 ,如果按传统方法判定糖醛酸的存在
与否 ,那么在点样量较大时 CF3 COOCH3及其他反
应副产物产生的荧光斑点很容易干扰结果 ,误导结
构研究。
本实验研究发现含糖醛酸的多糖样品在 2
mo l /L CF3 COOH溶液中于 110℃水解 4 h后薄层
层析 ,采用苯胺 -邻苯二甲酸显色可检测糖醛酸是否
存在 ,不受其中中性糖残基的干扰 ,对不含糖醛酸的
多糖样品不会出现假阳性结果 (图 1-4) ,其检测灵
敏度 0. 5μg (图 1-5)。
　　间羟基联苯法是一种常用的多糖中糖醛酸含量
测定方法 ,该法较咔唑法 [ 5]受中性糖残基的干扰更
小。我们发现该法在 1μg /0. 2 mL时对两种糖醛酸
都有响应 ,呈现肉眼可观察到的品红色 (表 1)。
通过 IR或 13 CNM R测定 ,也可判定糖醛酸的
存在与否。含糖醛酸的多糖样品 IR谱中 1 700～
1 750 cm
- 1范围内会产生吸收 , 13 CNMR谱中在低
场 176附近会有羰基碳的特征吸收。 但是 ,若多糖
中糖醛酸残基含量较少时 ,在 IR谱中 1 700～ 1 750
cm
- 1范围内的吸收峰往往会被掩盖 ,而 13 CNM R光
谱测定需要消耗大量纯度较高的样品 ,花费也很高。
相比之下 ,薄层检测不失为一种简便易行的方法。
综上所述 ,我们推荐的判定方法如下:取多糖样
品 4 mg ,加入 2 mol /L CF3 COOH溶液 3～ 5 mL,
于 110℃ 封管水解 4 h后 , 40℃ 减压浓缩蒸干 ,加
入 MeOH处理 ,减压蒸干 ,重复以上操作 4～ 5次以
除尽 CF3COOH,加入 0. 2 mL H2O使溶解 ,取 5μL
点样进行薄层层析 ,以糖醛酸标准品为对照。展开剂
为乙酸乙酯-吡啶-醋酸-水 ( 5∶ 5∶ 1∶ 3) ,显色剂为
苯胺 -邻苯二甲酸 , 105℃ 加热 5～ 10 min,若含有
糖醛酸残基 ,则在 Rf值相近于糖醛酸标准品处应
显示红棕色斑点。如果为确保检测出含量很少的糖
醛酸 ,可以适当增加点样量。
参考文献:
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·406· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 5期
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HPLC法测定不同干燥方法的贯叶连翘中黄酮类化合物的含量
钱秋霞 1 ,丛晓东 2
( 1. 中国药科大学中药学院 ,江苏 南京　 210038;　 2. 山东省天然药物工程技术研究中心 ,山东 烟台　 264003)
摘　要: 目的　研究 HPLC测定条件 ,并测定不同干燥方法贯叶连翘中黄酮类化合物芦丁、金丝桃苷的含量。 方法
　色谱柱: Discovery C18 ( 5μm, 25 cm× 4. 6 mm) ;流动相:水 -乙腈 -磷酸 ( 825∶ 175∶ 1) ;流速: 1. 0 mL /min;检测波
长: 365 nm。 结果　 60℃ 烘干 4 h贯叶连翘中芦丁和金丝桃苷的含量最高 ,总含量可达到 1. 677%。芦丁的线性
范围为 0. 107～ 2. 675μg ,平均回收率为 99. 32% , RSD= 1. 007% ,金丝桃苷的线性范围为 0. 107～ 2. 675μg ,平均
回收率为 99. 54% , RSD= 3. 591%。 结论　该方法分析简便、灵敏、迅速、准确。
关键词: HPLC;贯叶连翘 ;芦丁 ;金丝桃苷
中图分类号: R927. 2　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 05 0407 03
Determination of flavonoids inHypericum perforatum processed by
different methods of drying by HPLC
QIAN Qiu-xia1 , CONG Xiao-dong2
　　 ( 1. Co lleg e o f Chinese Mate ria M edica, China Pha rmaceutical Univ e rsity , Nanjing Jiang su 210038, China; 2. Shandong
Enginee ring Resea rch Center o f Na tural Drug s, Yantai Shandong 264003, China )
Abstract: Object　 To develop a method fo r th e determination of f lav onoids in Hypericum perforatum
L. processed by dif ferent drying methods to provide a basis for the pro cessing of the natural herbs.
Methods　 The ch romatog raphic conditions were Discovery C18 co lumn ( 5μm, 4. 6 mm× 25 cm ) . detec-
tion w aveleng th 365 nm; mobi le phrase: w ater : acetoni trile : phospho ric acid ( 825∶ 175∶ 1) ; flow rate
1. 0 mL /min. Results　 The contents o f rutin and hyperin w ere a t their max imum when dried a t 60℃ for 4
h. Rutin had a good linea ri ty in the range o f 0. 107～ 2. 675μg, av erage recovery rate 99. 32% , RSD
1. 007% , and hyperin in the range o f 0. 107～ 2. 675μg, average recovery rate 99. 54% , RSD 3. 591% .
Conclusion　 Temperature is the main factor inf luencing the content of f lav onoids. The HPLC determina-
tion w as show n to be rapid, reliable and simple, and may be used for the quali ty cont rol o f H. perfora-
tum .
Key words: HPLC; Hypericum perforatum L; rutin; h yperin
　　贯叶连翘 Hypericum perforatum L. 是藤黄科
金丝桃属植物 ,含有多种具生物活性的化学成分 ,其
中主要是苯并二蒽酮类化合物、金丝桃素和伪金丝
桃素 ;多种黄酮类化合物 ,如芦丁、槲皮素和金丝桃
苷 ;间苯三酚类化合物如贯叶金丝桃素和加贯叶金
丝桃素 (拟 )以及挥发油和 xanthone类化合物等。
对贯叶连翘的质量分析多有报道 ,大多以金丝
桃素为质量指标 ,而金丝桃素含量很低 ,尚不能反映
药材质量。本文以黄酮类化合物芦丁 ( rutin)、金丝
桃苷 (hyperin)为质量指标 ,建立了同时测定芦丁、
金丝桃苷的 HPLC含量测定方法 ,该方法快速简
便 ,稳定性和重现性好 ,可用于药材的质量控制。 并
测定了不同干燥方法贯叶连翘中黄酮类化合物的含
量 ,探讨了温度对贯叶连翘中黄酮类化合物的影响 ,
为药材的加工、炮制提供一定的理论依据。
1　仪器与试药
色谱仪: Spect ra SYSTEM P1000高效液相色
谱仪 , Spect ra 100紫外可见光检测器 ;色谱工作站:
·407·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 5期
收稿日期: 2000-11-29作者简介:钱秋霞 ,女 , 1996年毕业于南京中医药大学 ,现为中国药科大学 98级研究生 ,专业生药学 ,研究方向为天然药物分析及质量标准化研究。