全 文 ：黄芪毛状根多糖与黄芪多糖化学组成及免疫活性的比较
单俊杰1 ,王　易2 ,翁颖琦1 ,谢长宜 2 ,刘　涤 1 ,胡之璧 1
( 1. 上海中医药大学中药研究所 ,上海　 200032; 2. 上海第二医科大学免疫研究所 ,上海　 200025)
摘　要: 目的　比较生物技术培养的黄芪毛状根中多糖与栽培黄芪中多糖的化学组成和免疫活性。 方法　采用乙
醇分级沉淀和凝胶渗透柱层析分离纯化多糖 ;硫酸 -苯酚法测定多糖含量 ;完全酸水解、乙酰化、气相色谱测定单糖
组成 ;采用免疫器官重量 ,腹腔巨噬细胞吞噬功能 ,溶血素生成 ,〔3H〕-TdR掺入 ,诱生 IFN-γ的含量测定等方法研
究免疫活性。结果　黄芪毛状根中多糖为 1. 85% ,黄芪中多糖为 2. 61%。 黄芪毛状根多糖 ( HAPS) 由鼠李糖、阿
拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成 ,摩尔比为 1∶ 2. 26∶ 0. 21∶ 0. 74∶ 2. 49∶ 19. 47。 黄芪多糖 ( APS)组
成与 HAPS相同 ,摩尔比为 1∶ 4. 34∶ 3. 92∶ 1. 95∶ 11. 41∶ 20. 52。采用乙醇分级沉淀各自获得 3个部分多糖 ,经
DEAE-Sepha ro se FF柱层析表明: HAPSI和 APSI, HAPSII和 APSII图谱相似 , HAPSIII与 APSIII有一定的差
异。 HAPS和 APS均能显著增加小鼠脾脏重量 , HAPS能提高小鼠胸腺重量 ;二者均增加小鼠腹腔巨噬细胞数量 ,
APS显著促进小鼠腹腔巨噬细胞巨噬功能 ; HAPS和 APS均抑制小鼠溶血素生成 ;促进小鼠脾淋巴细胞增殖 ;
APS使脾淋巴细胞诱生 IFN-γ的作用高于 HAPS。 结论　 HAPS和 APS化学组成相似 ,二者具有相同的免疫活
性 ,只是强度略有差异。
关键词: 黄芪毛状根 ;黄芪 ;多糖 ;免疫活性 ; IFN-γ
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 12 1096 04
Comparing compositions and immunoactivities of polysaccharide in hair root of
Astragalus membranaceus and cultivated A. membranaceus
SHAN Jun-jie1 , WANG Yi2 , WEN G Ying-qi1 , X IE Chang-yi2 , LIU Di1 , HU Zhi-bi1
( 1. Institute o f Chinese Ma teria Medica, Shanghai Unive rsity of TCM , Shanghai 200032, China; 2. Institute
o f Immunology, Shanghai Second Univ e rsity of Medical Science , Shanghai 200025, China )
Abstract: Object　 To compare the composi tions and the immunoactivi ties o f polysaccharide in hai r
root of Astragalus membranaceus ( Fisch. ) Bge. ( HAPS) , w hich w as cultiva ted by biotechno logy , wi th the
poly saccha ride in A. membranaceus ( APS) , to prove the similar properties bo th of them. Methods　 Sul-
phuric acid— phenol method was used to ana lyze the poly saccha ride contents; completely acid hydroly sis,
adi to l acetate deriv ativ e and GC were used to determine the poly saccharides; the w eigh t o f spleen and thy-
mus; phagocytosis function o f macrophage; hemo lysin production and〔3H〕-TdR inco rperation ELISA ki t
assays were used to evalua te the immunoactivi ties in mice. Results　 The po lysaccharides of the hair roo t
w ere 1. 85% , that o f A. membranaceus were 2. 61% . Bo th of HAPS and APS had the same mono saccha-
ride composition, but the molar ratio of them was di fferent. HAPS and APS w ere divided into three par ts
by di fferent ethanol concentration. The homogenei ty w as verified by DEAE-Sepha ro se FF chromatog ra-
phy. HAPS I and APS I w ere similar , HAPS II and APS II w ere also simila r, HAPS III and APS III w ere
di fferent. HAPS and APS increased the w eight of mouse spleen, APS increased the w eight of thymus.
Both o f them increased phagcytosis function o f macrophage and inhibi ted the hemo lysin production in mice.
HAPS and APS significantly stimulated lymphocy te prolifera tion of spleen and secreted IFN-γ. Conclusion
The resul ts confi rmed tha t HAPS and APS had similar chemical composi tions and immunoactivi ties, but
the intensi ty show ed slight ly di fference
Key words: hair roo t o f Astragalus membranaceus ( Fisch. ) Bge. ( HAPS) ; Astragalus membranaceus
( Fisch. ) Bge. ( APS) ; poly saccha ride; immunoactivi ty; IFN-γ
　　黄芪 Astragalus membranaceus ( Fisch. ) Bge. 是我国传统的中药 ,具有补气升阳 ,固表止汗 ,利水
·1096· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2002年第 33卷第 12期
收稿日期: 2002-03-21基金项目:攀登计划和“九五”攻关项目经费支持 ( 96-02-03-06)作者简介:单俊杰 ( 1966-) ,女 ,博士 ,主要从事多糖化学及药理学研究 ,现在中国科学院上海有机化学研究所生命有机化学国家重点实验室做博士后。 Tel: ( 021) 64163300-1300
消肿和生肌等功效。近年来研究表明黄芪中多糖是
黄芪主要有效成分之一 ,具有较强的免疫调节活
性 [1 ]。黄芪市场需求量很大 ,但由于野生资源日趋减
少 ,栽培品质下降 ,严重影响了黄芪的临床应用。本
研究所采用生物技术培养黄芪毛状根 ,其生长迅速、
不需要外源激素 ,拥有亲本植株的次级代谢途径 ,而
且可以对有效成分合成路线进行操作 ,提高有效成
分的产量 [2 ]。 本实验主要研究黄芪毛状根与黄芪中
多糖的化学组成及免疫活性 ,并进行比较。
1　材料
1. 1　药材:黄芪毛状根:本所生物工程实验室培养 ;
膜荚黄芪:购于上海药材有限公司 ,由上海中医药大
学周秀佳教授鉴定。
1. 2　试剂: DEAE-Sepharo se FF ( Pharmacia 公
司 ) ;重蒸苯酚 (华美生物工程公司 ) ;刀豆素 ( ConA,
Sigma公司 ) ; [3 H ]-甲基胸腺嘧啶核苷 ( [3 H]-
TdR,上海科学院核技术公司 ) ; RPM I1640培养基
( Gibco公司 ) ;溶血素 (卫生部上海生物制品研究
所 ) ; IFN-γ试剂盒 ( Endogen公司 )。
1. 3　仪器: 高效液相色谱仪 ( Water公司 , 600泵 , 410
检测器 ) ;液体闪烁计数仪 ( W ALLAC-1209, Phar-
macia公司 ) ;酶标仪 ( 960-Meerteh, Sigma公司 )。
1. 4　动物: Balb /c纯系小鼠 , 8～ 10周 , ( 20± 2) g ,
购于中国科学院上海实验动物中心。
1. 5　细胞株: L929细胞株、Wish细胞株、V SV病
毒均由上海第二医科大学免疫研究所王易副教授
惠赠。
2　方法
2. 1　黄芪毛状根多糖 ( HAPS)和黄芪多糖 ( APS)
的提取:黄芪毛状根 (或黄芪 )经 95% 乙醇脱脂 2
次 ,空气吹干。 12倍蒸馏水分 2次分别浸泡 1 h、煎
煮 1 h,合并水煎液 ,浓缩 ,离心。上清液加入 4倍
95% 乙醇醇沉 24 h ,离心 ,沉淀用适量蒸馏水溶解 ,
30% 三氯乙酸加入使之浓度至 15% ,搅拌 30 min,
离心。 上清液用 2 mol /L NaOH中和 ,蒸馏水透析
72 h,减压浓缩 ,冷冻干燥 ,即获得总多糖 HAPS
(或 APS)。
2. 2　黄芪毛状根和黄芪部分多糖的分离: HAPS
(或 APS) 1 g加入 1 L蒸馏水溶解 ,然后加入 1 L
95% 乙醇醇沉 24 h,离心。沉淀用适量蒸馏水溶解 ,
离心 ,冷冻干燥 ,即获得 HAPSI (或 APSI)。上清液
加入 1 L 95% 乙醇醇沉 24 h ,沉淀同样溶解 ,离心 ,
冷冻干燥 ,即获得 HAPSII (或 APSII)。上清液再加
入 1 L 95% 乙醇醇沉 24 h,同样获得 HAPSIII (或
APSIII)。
2. 3　多糖的含量测定:硫酸 -苯酚法 [3 ]。
2. 4　单糖组成测定:按文献 [4 ]。取 5 mg多糖样品 ,
加入 1 mL 2 mo l /L 三氟乙酸 ( TFA ) ,封管后
120℃ 水解 2 h,减压蒸干。然后滴加甲醇再浓缩至
干 ,重复几次 ,直至无酸味为止 ,加入 1 mL蒸馏水
使之溶解。 加入 NaBH4还原后 ,用冰醋酸调溶液
pH= 5,减压蒸干。还原后的产物加入醋酸酐中 ,
120℃ 乙酰化 2 h,不断振荡使之反应完全。加入甲
苯减压蒸干 ,重复几次 ,然后 GC分析。
2. 5　免疫器官重量测定:按文献 [ 5]。
2. 6　腹腔巨噬细胞吞噬功能测定:按文献 [ 6]。
2. 7　溶血素测定:按文献 [7 ]。
2. 8　脾淋巴细胞增殖:无菌取出 Ba lb /c小鼠脾脏 ,
用 RPM I1640培养液制成一定浓度的脾细胞悬液。
向 96孔培养板每孔中分别加入脾细胞悬液、 ConA
及不同浓度黄芪多糖 ,使每孔总体积为 200μL,脾
细胞终浓度为 2× 106 /mL, ConA终浓度为 1μg /m L。
37℃ , 5% CO2饱和湿度培养箱培养 72 h ,在培养结
束前 16 h于培养板各孔内加入 1. 0× 104 Bq 3 H-
TdR。培养结束后收集细胞 ,用液体闪烁仪测定
[
3
H]-TdR的掺入值 ,以反应细胞增殖程度 [8 ]。
2. 9　体外诱生 IFN-γ:取 ( 20± 2) g的纯系 Balb /c
小鼠 5只 ,断头处死 ,无菌取脾 ,尼龙膜 150目过
滤 ,用 Hank s液制成细胞悬液 , 1 500 r /min离心
10 min,再用 RPM I1640培养液洗涤一次 ,离心后
用 RPM I1640培养液制成浓度 3× 106 /mL的细胞
悬液。取无菌 10 mL的试管 ,每支试管先加入 2 mL
培养液 ,然后按设计方案加入一定体积的多糖样品
后 ,每支试管最后均加入 1 m L制好的脾淋巴细胞
悬液 ,细胞终浓度为 1× 106 /m L。 放入 37℃ , 5%
CO2培养箱孵育 72 h后 , 2 000 r /min离心 10 min,
将上清液分成 6份收集 , - 20℃ 冷冻待测 IFN-γ。
2. 10　 IFN-γ含量测定:按 IFN-γ试剂盒说明操作。
3　结果
3. 1　 HAPS和 APS化学组成的比较
3. 1. 1　黄芪毛状根与黄芪中多糖含量及单糖组成
比较: HAPS含量为 1. 85% , APS为 2. 61%。HAPS
由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖
组成 ,摩尔比为 1∶ 2. 26∶ 0. 21∶ 0. 74∶ 2. 49∶
19. 47。 APS单糖组成与 HAPS相同 ,摩尔比为 1∶
4. 34∶ 3. 92∶ 1. 95∶ 11. 41∶ 20. 52。
3. 1. 2　 乙醇 分 级沉 淀 的部 分 多 糖 DEAE-
Sepha rose FF层析结果:经乙醇分级沉淀将总多糖
·1097·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2002年第 33卷第 12期
按相对分子质量大小粗分为三部分 , DEAE-
Sepharose FF层析图谱可以看出 HAPSI和 APSI,
HAPSII和 APSII组成相似 , HAPSIII和 APSIII
存在一定差异。各部分得率也不同。
3. 2　 HAPS与 APS免疫活性的比较
3. 2. 1　对小鼠免疫器官的影响:取 ( 20± 2) g昆明
小鼠 36只 ,随机分成 3组。 ip剂量为 100 mg /kg ,
连续 7 d。末次给药次日 ,将小鼠断头处死 ,取胸腺、
脾脏称重 ,计算胸腺指数和脾脏指数 ,结果见表 1。
HAPS能明显增加正常小鼠的胸腺重量 , APS无此
作用。 HAPS和 APS均显著增加小鼠脾脏重量。
表 1　 HAPS和 APS对小鼠免疫器官的影响 (x± s , n= 12)
组　别 剂量 ( mg /kg ) 胸腺指数 ( mg /g) 脾脏指数 ( mg /g)
对照 - 17. 72± 3. 24 48. 38± 6. 62
HAPS 100 21. 44± 5. 24* 131. 20± 19. 85* * *
APS 100 17. 47± 3. 25 123. 00± 18. 06* * *
　　　与对照组比较: * P < 0. 05　* * * P < 0. 001
3. 2. 2　对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响: 给药
方式同 3. 2. 1,末次给药次日 ,断头处死小鼠 ,迅速
剪开腹腔皮肤 ,无菌注射 Hank s溶液 3 mL,轻揉
腹部 ,抽取腹腔液 , 1 000 r /min离心 10 min。用磷酸
缓冲液定容 ,加入 0. 5% 鸡红细胞 0. 2 m L,于
37℃ , 5% CO2培养箱孵育 30 min。离心推片 ,用瑞
氏液染色 ,镜检 ,计算吞噬百分数和吞噬指数 ,结果
见表 2。 HAPS和 APS均能增加小鼠腹腔巨噬细胞
的数量 , APS促吞噬作用较 HAPS更显著。
表 2　HAPS和 APS对小鼠腹腔巨噬
细胞吞噬的影响 (x± s, n= 12)
组　别 剂量 ( mg /kg ) 吞噬百分率 (% ) 吞噬指数
对照 - 0. 00± 0. 00 0. 000± 0. 000
HAPS 100 0. 62± 0. 51* 0. 012± 0. 010
APS 100 4. 05± 3. 91* * 0. 157± 0. 263*
　　　与对照组比较: * P < 0. 05　* * P < 0. 001
3. 2. 3　对小鼠溶血素生成的影响:取 ( 20± 2) g昆
明小鼠 36只 ,随机分成对照组、 HAPS组和 APS
组。 ip连续 7 d。在给药第 3天 ,每只鼠用绵羊红细
胞 ( SRBC) 悬液 ip免疫 , 4 d后摘除小鼠眼球放
血 ,分离血清 ,测定每个样品的半数溶血值 ( HC50 ) ,
结果见表 3。 HAPS和 APS均能明显抑制 SRBC特
异性抗体生成。
3. 2. 4　对小鼠体外淋巴细胞增殖的影响: 见表 4。
结果表明 HAPS和 APS能显著促进小鼠脾淋巴细
胞增殖 ,但强度明显低于有丝分裂原 ConA。
3. 2. 5　对小鼠脾淋巴细胞体外诱生 IFN-γ的影
响:见表 5。结果表明 HAPS和 APS均能促进小鼠
脾淋巴细胞诱生 IFN-γ,其中 APS的作用更明显。
表 3　HAPS和 APS对小鼠溶血素
生成的影响 (x± s , n= 12)
组　别 剂量 ( mg /k g) HC50
对照 - 13. 92± 6. 60
HAPS 100 8. 25± 3. 88*
APS 100 5. 40± 0. 71*
　　　与对照组比较: * P < 0. 05
表 4　HAPS和 APS对小鼠脾淋巴
细胞增殖的影响 (x± s , n= 6)
组　别 浓度 (μg /m L) 〔3H〕-TdR ( cpm)
HAPS 50 3 350± 1 089*
APS 50 2 076± 681*
ConA 1 31 923± 5 817* * *
细胞对照 - 　 684± 161
　　　与细胞对照比较: * P < 0. 05　* * * P < 0. 001
表 5　HAPS和 APS对小鼠脾淋巴细胞
诱生 IFN-γ的影响 (x± s , n= 6)
组　别 浓度 (μg /m L) IFN-γ( ng /m L)
HAPS 50 　　 127. 66± 85. 97* * *
APS 50 2 866. 26± 980. 06* * *
ConA 1 407. 29± 242. 11* * *
细胞对照 - 　 0. 00±　 0. 00
　　　与细胞对照比较: * * * P < 0. 001
4　讨论
　　黄芪毛状根中总多糖比栽培黄芪中总多糖含量
略低 ,可能是由于培养时间短 ,代谢产物积累量少。
但栽培黄芪需生长两年后采集 ,而毛状根只需 20 d
培养即可收获。相比较生产毛状根具有生长速度快、
无污染、有效成分含量稳定等特点 ,可作为中药材生
产的另一途径。
采用不同浓度乙醇分级沉淀可将总多糖按相对
分子质量大小粗分为 3部分 ,从 DEAE-Sepharose
FF层析图谱可以看出 HAPSI和 APSI, HAPSII和
APSII组成基本相似 ,而 HAPSIII和 APSIII存在
一定差异。
黄芪毛状根与黄芪中多糖的单糖组成相同 ,但
摩尔比不同 ,特别是木糖和半乳糖摩尔比差异较大。
总之 , HAPS和 APS在化学组成上基本相似 ,个别
方面存在差异可能是由于黄芪和毛状根生长条件不
同 ,代谢产物合成途径中某些细节可能不同造成的。
HAPS和 APS均能增加小鼠胸腺重量和脾脏
重量 ,增加小鼠腹腔巨噬细胞的数量 , APS显著促
进腹腔巨噬细胞吞噬功能 ,这可能是一种直接刺激
作用 ;促进脾淋巴细胞增殖并诱生 IFN-γ。 HAPS和
APS均抑制小鼠溶血素生成 ,提示 HAPS和 APS
对免疫系统有选择性作用。HAPS和 APS与小鼠脾
淋巴细胞体外培养 ,具有明显促增殖作用 ,但增殖能
·1098· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2002年第 33卷第 12期
力较有丝分裂原 ConA明显减弱 ,提示 HAPS和
APS均有有丝分裂原样作用。
参考文献:
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研究 [ J]. 天然产物研究与开发 , 1994, 16( 1): 23-28.
[3 ]　 Mich el D. Colorimet ric method for determimat ion of sugars
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化学与生物物理学报 , 1989, 21( 2): 152-156.
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重量、淋巴细胞增殖和空斑形成的影响 [ J] . 中国药理学报 ,
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[7 ]　李先荣 ,康　永 ,牛艳艳 ,等 . 注射用黄芪多糖药理作用的研究
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响 [ J] . 中国药理学报 , 1993, 14( 3): 243-247.
菟丝子黄酮对应激大鼠卵巢内分泌的影响
王建红 ,王敏璋 ,伍庆华 ,闵建新 ,陈晓凡 ,欧阳栋
(江西中医学院 ,江西 南昌　 330006)
摘　要: 目的　观察菟丝子黄酮对心理应激引起卵巢内分泌功能降低的调节作用。方法　采用声 -光 -电复合应激刺
激制造大鼠卵巢内分泌功能降低模型 ,观察菟丝子黄酮对模型大鼠血清 E2 , P水平 ,肾上腺抗坏血酸含量以及垂
体、卵巢、子宫重量的影响。 结果　菟丝子黄酮明显提高模型大鼠血清 E2 , P水平 ,增加垂体、卵巢、子宫的重量 ,但
对肾上腺抗坏血酸含量没有明显的影响。 结论　菟丝子黄酮能够明显改善卵巢内分泌功能。
关键词: 菟丝子黄酮 ;卵巢内分泌 ;心理应激
中图分类号: R285. 5　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 12 1099 03
Effects of flavonoids fromCuscuta chinens is on ovarian endocrine
in female rats exposed to psychologic stress
WANG Jian-hong , W ANG Min-zhang , WU Qing-hua,
M IN Jian-xin, CHEN Xiao-fan, OU YANG Dong
( Jiangx i Co lleg e of TCM , Nanchang 330006, China)
Abstract: Object　 To observ e the effects of the f lav onoids ex t racted f rom Cuscuta chinensis Lam.
( FC) on the ovarian endocrine functions in female ra ts expo sed to psycho logic st ress. Methods　 Sound,
ligh t and elect ricity w ere combined into a st ressful stimulus to induce dysfunction on ovarian endocrine
functions in female rats; to observe the effects o f FC on the ovarian endocrine functions in fema le rats ex-
posed to psycholo gic st ress, by determining the changes of serum E2 , P and asco rbic acid lev els in adrenal
g land, and by w eighing the pi tui taries, ova ries and uteruses. Results　 FC increased the serum E2 , P and
the w eigh t of pitui taries, ov aries and uteruses obviously , but did no t increase asco rbic acid lev els in a-
drenal g land in female rats expo sed to psycho logic st ress. Conclusion　 FC improves the ovarian endocrine
functions in fema le rats.
Key words: flavonoids of Cuscuta chinensis Lam. ( FC) ; ov arian endocrine; psychologic st ress
　　菟丝子是旋花科植物 Cuscuta chinensis Lam.
的成熟种子 ,为温补肾阳的要药 ,在中医临床上应用
广泛 ,尤其在治疗生殖内分泌失调类疾病方面 [1 ]。菟
丝子主要成分为黄酮类化合物 [2 ] ,本实验研究了菟
丝子总黄酮对心理应激大鼠卵巢内分泌的调节
作用。
1　材料
1. 1　药物: 菟丝子经本院中药鉴定教研室鉴定为
·1099·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2002年第 33卷第 12期
收稿日期: 2002-05-05基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 39960026) ;江西省卫生厅资助项目 ( 2000A21)作者简介:王建红 ( 1963-) ,女 ,江西南昌人 ,江西中医学院基础部副教授 ,现为生理教研室主任 ,硕士生导师 ,主要从事中药对人类生殖内分泌功能调控方面研究工作。 Tel: ( 0791) 6836406　 E-mai l: w ang jh 69@ hotmai l. com
* 江西中医学院 2000级研究生